Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Udnytte den Antigen capsidet-Indbygning strategi for udvikling af adenovirusserotype 5-vektoriserede Vaccine Approaches

Published: May 6, 2015 doi: 10.3791/52655
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 2Center for AIDS Research, University of Alabama at Birmingham

Summary

Her præsenterer vi en protokol til at generere en proof-of-principle divalente adenovirus type 5 (Ad5) vektor Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 ved at udnytte Antigen capsidet-Indbygning-strategi. Denne vektor blev påvist at udvise kvalitativ egnethed skal muligheden undslippe Ad5-positive sera in vitro, og antigeniciteten samt immunogenicitet til de inkorporerede antigener.

Abstract

Adenovirus serotype 5 (Ad5) er blevet grundigt modificeret med traditionelle transgene metoder til udvikling af vacciner. De reducerede effektiviteter af disse traditionelt modificerede Ad5 vektorer i kliniske forsøg kunne primært korreleret med Ad5 allerede eksisterende immunitet (PEI) blandt det flertal af befolkningen. At fremme Ad5-vektoriserede vaccine udvikling ved at løse bekymring Ad5 PEI, har den innovative Antigen capsidet-Indbygning strategi været ansat. Ved merit i denne strategi, Ad5-vectored vi først konstrueret hexon shuttle plasmidet HVR1-Kwas-HVR5-Hans 6 / pH5S ved subkloning af hypervariable region (HVR) 1 af hexon i en tidligere konstrueret shuttle plasmid HVR5-Hans 6 / pH5S, som havde His6 tag indarbejdes i HVR5. Denne HVR1 DNA-fragment indeholdende en HIV-epitop ELDKWAS blev syntetiseret. HVR1-Kwas-HVR5-Hans 6 / pH5S blev derefter lineariseret og co-transformeret med lineariseret backbone plasmid pAd5 / ΔH5 (GL),til homolog rekombination. Dette rekombineret plasmid pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 blev transficeret ind i celler for at generere den virale vektor Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6. Denne vektor blev valideret til at have kvalitative fitness angivet ved viral fysisk titer (VP / ml), infektiøs titer (IP / ml) og tilsvarende VP / IP-forhold. Både HIV-epitop og His-tag 6 var overflade-eksponeret på Ad5 capsid, og beholdt epitop-specifikke antigenicitet af deres egne. En neutralisation assay indikerede evne denne divalente vektor at omgå neutralisering af Ad5-positive sera in vitro. Mus immunisering demonstreret frembringelse af robuste humoral immunitet specifikke for HIV epitopen og His6. Dette proof-of-principle undersøgelse foreslået, at protokollen er knyttet til Antigen capsidet-Indbygning strategi kunne indpasses anvendes til generering af Ad5-vectored vacciner ved at ændre forskellige kapsidproteiner. Denne protokol kan endda være fDERLIGERE modificeret til frembringelse af sjældne serotype adenovirus-vectored vacciner.

Introduction

Human adenovirus (Ad) er en mellemstor, ikke-kappeklædte virus med en tyvefladet nukleokapsid indeholder en dobbeltstrenget DNA genom. Annoncen tilhører Adenoviridae familien, med en klassifikation i syv grupper (A til G). Hver gruppe indeholder virus af forskellige serotyper. Heraf adenovirus serotype 5 (Ad5) fra gruppe C har været den mest omfattende undersøgt og er det mest ansøgte vectored tilgange såsom genterapi og vaccination.

Den traditionelle transgen strategi er blevet udviklet og anvendt til Ad5 modifikationer, som er karakteriseret ved forskydningen af ​​virus tidlige gener med et gen af ​​interesse, og den fokuserede ekspression af genet af interesse i en vært. Eksempler er konstruktionen af pENV9 / Ad5hrΔE3 ved at erstatte tidlige gen 3 (E3) med rev-genet fra Simian Immunodeficiency Virus 1, opførelse af AdCMVGag ved at erstatte tidlige gen 1 (E1) med gag-genet af human immundefektVirus (HIV) 2, og opførelsen af Ad lacZ ved at erstatte E1 med lacZ gen 3. Den brede anvendelse af den traditionelle transgen strategi for Ad5 afhænger af følgende fortjenester: den brede vifte af værter for Ad5 den mulige gen engineering på virus og virus formering, store indkvartering af fremmed gen indsatsen og sikkerhed Ad5 4,5. De reducerede effektiviteter af Ad5-vectored kliniske behandlinger ved brug af denne strategi har dog været en vigtig flaskehals, som er blevet kortlagt til primært forbundet med Ad5 PEI, da Ad5 er så udbredt blandt de fleste børn og voksne 4,6.

At overvinde de store hindringer for Ad5 det primære mål er at udvikle en alternativ strategi omgå Ad5 PEI. Medfødte immunitet 7, adaptiv immunitet såsom neutraliserende antistoffer (NABS) 8-10 og CD8 + T-cellereaktioner 10 imod Ad5 er blevet vist at contribute til Ad5 PEI, med Ad5 NABS synes at spille den dominerende rolle i bidragene til Ad5 PEI 10,11. Desuden Ad5 nabs målepitoper placeret i capsidproteiner, herunder det store protein hexon, fiber og penton base. Heraf hexon er den vigtigste mål for Ad5 NABS 8,11-13. Baseret på disse resultater, er der indført en innovativ Antigen capsidet-Indbygning-strategi. Denne roman strategi fremhæver udskiftning eller inkorporering af proteiner af interesse på Ad5 capsidproteiner, der skifter eller masker Ad5 neutraliserende epitoper, der fører til nedsat anerkendelse fra NABS og effektive Ad5 vektor forvaltninger. Det er bemærkelsesværdigt, at denne strategi er konkurrencedygtige, fordi det også kan hjælpe værter fremkalde robust humoral immunitet og potent cellulær immunitet ved direkte at præsentere antigener af interesse til immunsystemet 4,14,15. Baseret på denne strategi, kan den molekylære kloning og rekombinant Ad viral vektor redning strukturelt opdelti fire hovedtrin: (a) fremstilling af genet af interesse fragment ved enten polymerasekædereaktion (PCR) eller syntese; (B) ligering af gen-fragment i en shuttle-plasmid, der indeholder genet af interesse fragment og homologe arme til en adenovirus backbone; (C) den homologe rekombination af co-transformation shuttle plasmid indeholdende genet af interesse fragmentet med det lineariserede plasmid backbone pAd5 / ΔH5 (GL) 16; (D) transfektion af lineariseret rekombinant adenoviral plasmid for at redde den rekombinante Ad-vektoren indarbejdet med antigener af interesse.

Vores gruppe og nogle andre har udvidet denne alternative annonce inkorporering strategi for Ad vektoriserede vaccine udvikling mod forskellige infektiøse patogener. Vi rapporteret dannelsen af en rekombinant Ad vektor Ad-HVR1-LGS-His 6 -V3 ved at inkorporere et His-mærket HIV-1-antigenet V3 ind HVR1 locale af Ad5 hexon (hexon5). Dette genererede vektor udløste strrespons ong humoral immunrespons specifikt for V3 epitopen 4. Vi rapporterede også udviklingen af Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 ved at inkorporere HIV-1 membran proksimale ektodomæne region (MPER) i HVR2 locale af hexon5 2. Derudover har Dr. Zhou gruppe anvendes fordelene ved denne annonce inkorporering strategi for at udvikle Ad serotype 3 (Ad3) vektoriserede vacciner, dvs.., Frembringelsen af virale vektor R1SP70A3 ved inkorporering af et neutraliserende epitop SP70 af Enterovirus 71 i HVR1 af Ad3 hexon (hexon3). R1SP70A3 genereret stærke NABS og IFN-γ produktion specifikke for epitopen SP70, som fører til den høje beskyttelse mod Enterovirus 71 udfordring 15.

Med henblik på teknisk reference, vores undersøgelse udnyttede den kvalitative Antigen capsidet-Indbygning strategi om at fokusere på dannelsen af et divalent Ad5 vektor Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 ved at inkorporere en HIV-1-antigen i HVR1 enda Hans-tag ind HVR5 af hexon5. Den genererede virusvektor blev også immunologisk evalueret. Antigenet capsid--Indbygning strategi kunne udnyttes til udvikling af Ad5-vectored vaccination tilgange mod forskellige infektionssygdomme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

University of Alabama i Birmingham Institutional Animal brug og Omsorgsudvalget godkendt brugen af ​​mus som beskrevet heri under den godkendte protokol nummer 101.109.272.

1. Genetisk Konstruktion af et Modified Plasmid pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 med antigenet capsidet-Indbygning strategi

  1. Konstruktion af shuttle plasmidet HVR1-Kwas-HVR5-Hans 6 / pH5S
    1. Bestil et plasmid indeholdende den syntetiserede DNA-sekvens HVR1-Kwas mellem restriktionsenzymsteder Agel til AccI af hexon5 genet.
    2. Fordøje 6 ug af det syntetiserede fragment (HVR1-Kwas) med enzymer Agel (6 enheder) og Accl (6 enheder) i 3 timer ved 37 ° C. De nedbrudte fragment i en 2% agarosegel ved elektroforese, og rense fragment med et DNA gelekstraktionskit ifølge producentens protokol.
    3. Baseret på det molære forhold af indsatsen til vektor ved 3: 1, anvende T4 DNA-ligase og ligase Buffer at ligere 12 ng af fragmentet (HVR1-Kwas) i 100 ng af et tidligere konstrueret shuttle plasmid HVR5-His 6 / pH5S 17 i en 10 pi volumen ved stuetemperatur i 2 timer, via lokaliteter af Agel og Accl.
    4. Transform 1 pi ud af 10 pi af ligeringsproduktet i 50 pi elektrokompetente DH5a celler i et elektroporator (ved 1800 V). Tilføj 950 pi SOC medium til de transformerede DH5a celler og inkuber blandingen i 1 time ved 37 ° C, med 300 rpm. Spred 100-200 ml 1 ml blandingen på Luria-Bertani (LB) agar indeholdende kanamycin og inkuberes O / N ved 37 ° C.
      1. Til screening ~ 10 kolonier ved PCR rettet mod fragmentet HVR1-Kwas, bland den fremadrettede primer (TATGTGTGTCATGTATGCGT), revers primer (GGAGGCCCACTTGTCCAGCTC) og en enkelt koloni DH5a i en PCR Master Mix opløsning (ifølge producentens protokol). Køre prøver på en thermocycler ved at henvise til manualen forsynet med PCR Master mix løsning.
      2. Brug den fremadrettede primer (TATGTGTGTCATGTATGCGT) at sekventere fragmentet HVR1-Kwas i kloner screenet i afsnittet 1.1.4.1.
  2. Konstruktion af plasmidet pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6
    1. Digest 6 ug HVR1-Kwas-HVR5-His 6 / pH5S med enzymer EcoRI (6 enheder) og Pmel (6 enheder) i 3 timer ved 37 ° C, og oprense fragmentet indeholdende homologe rekombination våben og den dobbelte modificerede hexon5 gen, som angivet i trin 1.1.2. Linearisere rygraden plasmidet pAd5 / ΔH5 (GL) 16 med SwaI.
    2. Co-transformation 100 ng mål-fragmentet fra shuttle plasmid og 100 ng af det lineariserede pAd5 / ΔH5 (GL) rygraden i 50 pi elektrokompetente BJ5183 celler til homolog rekombination i en elektroporator (ved 1800 V). Tilføj 950 pi SOC medium til de transformerede celler og inkuber blandingen i 1 time ved 37 ° C, 300 rpm. Spred 100-200 pi af 1 ml blandingpå LB-agar indeholdende kanamycin (endelig 50 ug / ml) i O / N inkubation ved 37 ° C.
      1. Pick ~ 10 små kolonier i 3 ml flydende LB indeholdende kanamycin (endelig 50 ug / ml) i O / N inkubation ved en ryster (250 rpm, 37 ° C). Uddrag plasmider fra kulturen. Anvende PCR analyse til at screene de 10 kolonier ved at målrette fragmentet HVR1-Kwas, som illustreret i trin 1.1.4.1.
      2. Til screening af de samme kolonier ved PCR-analyse rettet mod pIX-fragmentet af rygraden genomet, bland den fremadrettede primer (AGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTT), revers primer (CCAAACAGAGTCTGGTTTTTTATTTAT) og en enkelt BJ5183 koloni i en PCR Master Mix opløsning (ifølge producentens protokol). Køre prøver på en thermocycler ved at henvise til manualen forsynet med PCR Master mix løsning.
      3. Udpeg PCR double-positive kolonier som pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6.
    3. Transform 100 ng af plasmidet pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 iat DH5a-celler som vist i trin 1.1.4.
      1. Anvende PCR analyse til at screene ~ 10 kolonier ved at målrette fragmentet HVR1-Kwas, som illustreret i trin 1.1.4.1.
      2. Anvende PCR analyse til at screene de samme kolonier ved at målrette pIX-fragmentet af rygraden genomet, som vist i trin 1.2.2.2.
      3. Brug den fremadrettede primer (TATGTGTGTCATGTATGCGT) at sekventere fragmentet HVR1-Kwas i pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6.

2. Udarbejdelse af Modified Ad5 Viral Vector Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6

  1. Udgør den komplette medium ved tilsætning af FBS (endelig 10%), 100X ikke-essentielle aminosyrer (endelig 0,1 mM), 200 mM L-glutamin (endelig 2 mM) og penicillin / streptomycin-opløsning (endelig 1%) i DMEM med højt glucoseindhold . Opretholde humane embryoniske nyre (HEK293) celler i komplet medium i en kultur inkubator (37 ° C og 5% CO2 under 85% fugtige betingelser).
  2. Redning af viral vector Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6
    1. Frø 3,0 x 10 6 i HEK293-celler i en T-25-kolbe indeholdende 5 ml komplet medium og kultur O / N for at opnå et monolag med 80% konfluens.
    2. Linearisere 15 ug pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 i et 100 pi volumen med restriktionsenzym Pacl (15 enheder) ved 37 ° C i 3 timer.
      1. Uddrag lineariseret pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 ved centrifugering af reaktionsblandingen to gange (10.000 x g i 1 min) med et tilsvarende volumen af phenol: chloroform: isoamylalkohol (forhold på 25: 24: 1) i et stinkskab og ved sekventiel centrifugering (10.000 x g i 10 min) med en blandet opløsning (300 pi 100% ethanol og 10 pi natriumacetat) og 700 pi 70% ethanol. Supernatanten kasseres ved hvert centrifugeringstrin.
    3. Resuspender oprensede plasmid i ~ 40 pi destilleret vand eller Tris-EDTA (TE) buffer. Kvantificere plasmid-DNA ved at måle den optiske density (OD) ved 260 nm.
    4. Transficere 3 ug af det lineariserede plasmid med kommerciel liposomal transfektion reagens i T-25-kolbe, ifølge producentens manual. Ændre transfektion medium med komplet medium ved 6 timer efter transfektion og efterfølgende inkubering i kulturen inkubator. Opretholde transficerede celler ved at udskifte komplet medium hver to til tre dage, indtil individuelle virale plaques form.
    5. Når plaques udvikle sig til fuld cytopatisk effekt (CPE), skrabe de resterende celler off kolben i en steril hætte, og høst cellelysat ved centrifugering medium ved 300 xg i 10 minutter ved 4 ° C. Cellepelletten suspenderes i ~ 1 ml medium indeholdende 2% FBS, og bryde cellerne ved frysning-optøning fire gange. Opsaml supernatanten indeholdende reddede virus efter centrifugering lysat ved 10.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
  3. Storstilet udbredelse af den virale vektor Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6
    1. Udbrede the virus i en T-75 kolbe indeholdende HEK293-celler i den sterile hætte ved at inficere med 1/3 til fuld lysat fra T-25-kolbe. Tillade fuld CPE at udvikle sig inden to til tre dage i kulturen inkubator. Harvest lysatsupernatant som angivet i trin 2.2.5.
    2. Opformere virus i 1-3 T-175 kolber i den sterile hætte ved at inficere med 1/2 til fuld lysat fra T-75 kolbe, afhængigt af virus udbredelsesforholdene. Tillade fuld CPE at udvikle sig inden to til tre dage i kulturen inkubator. Harvest lysatsupernatant som angivet i trin 2.2.5.
    3. Opformere virus i et dusin eller flere T-175 kolber i den sterile hætte ved at inficere med 1/2 til fuld lysat fra den tidligere T-175-kolbe (er). Bestem mængden af ​​forbrug kolbe baseret på virus udbredelsesforholdene og mængden af ​​virus i nød. Harvest lysatsupernatant som angivet i trin 2.2.5, når fuld CPE sker inden for to til tre dage i kulturen inkubator.
  4. Purifgement af Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 ved cesiumchlorid
    1. Fremstille to tætheder af CsCI løsninger i 5 mM HEPES: 1,33 g / ml og 1,45 g / ml, og samtidig undgå kontakt med CsCl.
    2. Belastning 4 ml CsCI (1,33 g / ml) i en steril ultracentrifugerør, og forsigtigt indlæse 4 ml CsCI (1,45 g / ml) mod bunden af ​​røret. Belastning 4 ml lysatsupernatant langsomt på toppen af ​​gradienter i den sterile hætte.
    3. Centrifugeres røret ved 110.000 xg i 3 timer ved 4 ° C for at adskille det modne / nedre virus band fra den defekte / højere virus band. Opsaml det nedre bånd anvendelse af en 3 ml sprøjte bevæbnet med en 33 G nål og fortyndes båndet med 5 mM HEPES til et 4 ml volumen i den sterile hætte.
    4. Indlæser et andet rør med to tætheder af CsCI løsninger og den fortyndede bånd af virus som beskrevet i trin 2.4.2. Centrifugeres røret ved 110.000 xg O / N ved 4 ° C. Saml den virale bånd som beskrevet i trin 2.4.3.
    5. Injicer indsamlede virus løsning i en dialyser kassetten ved en 3 ml sprøjte bevæbnet med en 33 G nål i den sterile hætte.
    6. Placer kassetten i 700 ml 1x dialyse puffer (1 L opskrift: 100 ml 10x PBS, 100 ml 100% glycerol og 800 ml destilleret vand og filtreres bufferen gennem et 0,22 um filter) og erstatte dialysebufferen hver 3 hrs til 4 gange. Aspireres ud dialyserede virus løsning ved hjælp nåleforsynede sprøjte.

3. Validering af Reddet Viral Vector

  1. Virusvektor Titreringer
    1. For viruset fysiske titer, fortyndes både virus og dialyse puffer (baggrund kontrol) ved 1: 10 og 1: 20 i virus lysisbuffer (10% SDS i Tris-EDTA) i små rør og inkuberes alle rør ved 56 ° C i 10 min.
    2. Tænd et biophotometer og sæt den tilstand af absorbans ved OD 260 nm. Brug den fortyndede dialyse puffer (1: 10) for at afbalancere baggrundssignal ved at klikke på "blank" bunden. Type "10 + 90" i biophotometer screen og læs signalet fortyndet virus (1: 10).
    3. Læs signalet fortyndet virus (1: 20) ved at følge fremgangsmåden i trin 3.1.2, men i stedet skrive "5 + 95" i biophotometer skærmen. Multipliceres to virus udlæsning tal ved 1.1x10 12 og beregne den gennemsnitlige titer med en enhed som VP / ml, baseret på de to individuelle titere fra de to fortyndinger.
    4. For virus infektiøse titer (IP / ml), skal du bruge Karber statistiske TCID50 metode 14 til at bestemme infektionen dybde på HEK293 celler 10 dage efter infektion (dpi)
  2. Evaluering af antigenisk eksponering display på den virale vektor
    1. Coat den virale vektor i en ELISA plade og fortsæt med resten af trinene i en standard ELISA-metode 14. Bruge humane anti-gp41 (2F5) monoklonalt antistof (mAb) og muse-anti-His-mærke-mAb til påvisning af tilsvarende indarbejdet antigener 14.
    2. Løs den virale vektor i en denaturøde protein gelelektroforese (SDS-PAGE) og fortsæt med resten af trinnene i en standard western-blot-metode 14. Bruge humane anti-gp41 (2F5) monoklonalt antistof (mAb) og muse-anti-His-mærke-mAb til påvisning af tilsvarende indarbejdet antigener 14.
  3. In vitro bedømmelsen af vektoren på evnen til at omgå Ad5-positve sera
    1. Opretholde HeLa-celler i komplet medium i kulturen inkubator (37 ° C og 5% CO2 under 85% fugtige betingelser). Udgør den komplette medium ved tilsætning af FBS (endelig 10%), 200 mM L-glutamin (endelig 2 mM) og penicillin / streptomycin-opløsning (endelig 1%) i Minimum Essential Medium Eagle (MEME).
    2. Seed HeLa-celler i plader med 6 brønde ved 1x10 6 celler / brønd, og pladerne inkuberes i kulturen inkubator (37 ° C og 5% CO2 under 85% fugtig forhold) i 2 timer. Inkuber Ad5-positive sera (0,1 pi eller 0 pi) med 5 IP / celle af viral vektor (Ad5 eller Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6) i kulturen inkubator i 1 time, før du tilføjer blandingerne på de 6-brønds plader indeholdende celler.
    3. Ved 24 timer efter infektion (HPI), skylles cellerne én gang med PBS og lysere celler i 0,5 ml lysisbuffer. Centrifugere ved 15.000 x g i 5 minutter og den ovenstående væske opsamles. Bland 20 pi af supernatanten med 100 pi luciferase substrat for luciferase signallæse-, da vira indeholder luciferasegenet.

4. Immunologisk Evaluering af Reddet virusvektor

  1. Forbered to immunisering grupper: Ad5 og Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6.
    1. Injicere mus (n = 8 / gruppe) intramuskulært med virus ved 1x10 10 VP / mus, i en homolog "prime-boost" immunisering regimen, med et interval på 2 uger.
    2. Ved 2 uger efter hver injektion, bløder mus uden bedøvelse ved kinden blødning med animalsk lancetter (5 mm spids længde) tilindsamle blod i 1,5 ml rør.
  2. Bland blod i rørene ved at vende op og ned, og inkuber blodet ved stuetemperatur i 30 min. Spin rørene ved 10.000 xg i 5 min ved 4 ° C og overførsel sera (øverste lag) til nye 1,5-ml rør.
    1. Spin de nye rør ved 10.000 xg i 5 min ved 4 ° C og overførsel sera til nyligt mærket 1,5 ml rør til opbevaring ved -80 ° C.
  3. Evaluering af antigen-specifik humoral immunitet ved sera-baserede ELISA
    1. Fortynd Hans peptid (lager ved 1 mM) og HIV-1 peptid (lager ved 1 mM) separat i 100.
    2. mM carbonatpuffer (pH 9,5) for at opnå peptid overtrækskoncentration den ved 10 uM. Coate ELISA-plader med de fortyndede peptider separat ved tilsætning af 100 pi per brønd og inkubering af pladerne O / N ved 4 ° C.
    3. Pladerne skylles med PBST fire gange på 200 pl / brønd og blokere i 1 time i 5% BSA i PBST. Påfør musesera til pladerne ved 1: 100 fortynding i blokerende buffer, 100 pl / brønd. Inkuber i 2 timer inkubation ved stuetemperatur.
    4. Pladerne skylles med PBST fire gange. Pladerne blokeres ved inkubering ved stuetemperatur i 30 minutter i den blokerende buffer ved 100 pl / brønd.
    5. Anvende gede-anti-muse-IgG-HRP (1: 5000 i blokerende buffer) ved 100 pl / brønd til begge pladerne overtrukket med Hans peptid og HIV-1-peptid individuelt. Inkubere i 2 timer ved stuetemperatur. Pladerne skylles med PBST.
    6. Læs plader ved OD450 nm efter inkubering med HRP-substrat i 30 min.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Antigenet capsid-Inkorporering strategien (figur 1A) blev anvendt til at generere den divalente Ad5 virusvektor Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6. For det første shuttle plasmidet HVR1-Kwas-HVR5-His 6 / pH5S blev konstrueret ved subkloning HVR1-Kwas fragment i den tidligere konstruerede shuttle-plasmid HVR5-His 6 / pH5S 17. For det andet plasmid pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 14 blev konstrueret ved en homolog rekombination mellem det fragment af "EcoRI-HVR1-Kwas-HVR5-His6-Pmel" og Swal-lineariseret pAd5 / ΔH5 (GL ) 16 (figur 1B). Transfektion af PacI fordøjet pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 i en T-25 kolbe fører til redningen af den virale vektor Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 14. De reddede virusvektor blev derefter opformeret i stor skala og oprenset ved to cyklusser af CsCI-gradient ultracentrifuge.

For atpåvise levedygtigheden / egnethed reddet virale vektor Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6, den fysiske titer bestemmes ved 1,3 x 10 11 VP / ml ved at måle de fysiske kopier af virale genom, og den smitsomme titer var bestemt ved 1,4 x 10 9 IP / ml ved at titrere den faktiske infektiøse viruspartikler. VP / IP-forholdet blev efterfølgende opgjort til 92 14. Normalt en annonce med en VP / IP-forholdet under 1.000 indikerer en kvalitativ egnethed denne virus. For at demonstrere, om dette reddede virus viser den antigene HIV-antigen og His-tag henholdsvis på overfladen af ​​det virale capsid større protein hexon5, blev ELISA gennemført med humant 2F5 mAb og muse-anti-His tag mAb, hhv. Resultaterne indikerede, at både det humane 2F5 mAb (figur 2A) 14 og muse-anti-His-mærke-mAb (figur 2B) 14 viste binding til Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6, hvorimod der ikke var nogen binding til den negative control vektor Ad5. Western-blot-analyse blev anvendt til at bekræfte dataene i ELISA, som både humant 2F5 mAb (figur 2C) 14 og muse-anti-His-mærke-mAb (figur 2D) 14 detekterede specifikke bånd omkring 117 kDa kun i virus Ad5 / H5- HVR1-Kwas-HVR5-His 6, som svarer til størrelsen af hexon5 protein. For at vurdere potentialet i Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 i omgå neutralisering af Ad5-positive sera, neutraliseringsassay analyse blev udført som angivet i protokollen afsnit 3.3. Resultaterne viste, at den relative luminescerende enhed (RLU) signal fra den virale vektor Ad5 behandlet med 0 pi Ad5-positve sera er 12 gange højere end fra den samme vektor behandlet med 0,1 pi Ad5-positve sera (p-værdi <0,001 ). Dette antydede neutraliseringen af ​​vektoren Ad5 af Ad5-positvive sera. I modsætning hertil var der lidt forskel fra den virale vektor Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6behandlet med 0 pi og 0,1 pi Ad5-positve sera (figur 3). Da hexon er den største mål for Ad NABS, og hexon-specifikke neutraliserende epitoper bor i alle HVRs af hexon 12,18 dataene ovenfor påvist, at Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 undslap neutralisering af Ad5-positve sera in vitro og foreslog potentialet i Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 på omgåelse Ad5 PEI i værten.

For at undersøge, om det ændrede divalente Ad5 viral vektor med antigenet capsidet-Indbygning strategi kunne fremkalde robust humorale immunitet specifikke for de inkorporerede antigener af interesse, blev "prime-boost" immunisering regime anvendes på immunisering af mus med kontrol viral vektor Ad5 og den divalente vektor Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6. Sera-baserede ELISA belagt med HIV-1-peptid viste, at sera fra immunisering gruppe af Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 havde significant-binding til HIV-1-peptid ved fortyndinger på mellem 40 og 640, sammenlignet med sera fra kontrolgruppen (p-værdi <0,001) (figur 4A) 14. Sera-baserede ELISA belagt med Hans peptid viste, at sera fra immunisering gruppen af Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 havde signifikant binding til His peptidet sammenlignet med sera fra kontrolgruppen, som statistisk p-værdi < 0,001 ved sera fortyndinger af 40 og 80, p-værdi <0,01 ved fortynding af 160 og p-værdi <0,05 ved en 320 fortynding (figur 4B) 14. De ovennævnte resultater viste genereringen af ​​respons mod de inkorporerede antigener på den divalente virusvektor humorale immunrespons.

Figur 1
Figur 1. Skematisk illustration af den genetiske konstruktion af plasmid pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 med antigenet capsid-Indbygning strategi. (A) antigenet kapsid-Indbygning strategi er kendetegnet ved direkte vise antigen af interesse på capsidproteinerne (hexon, penta basen, pIX og / eller fiber) af adenovirus. Dette tal blev tilpasset fra Nemerow et al., 2009. Virology 384 (2009) 380-388, copyright Elsevier. (B) Gene fragment (HVR1-Kwas) blev syntetiseret og klonet ind i en pUC vektor af et selskab. Dette fragment blev subklonet ind i den tidligere konstruerede shuttle-plasmid HVR5-His 6 / pH5S af restriktionsenzymerne Agel og Accl at generere HVR1-Kwas-HVR5-His 6 / pH5S. Det resulterende bifunktionelle plasmid blev fordøjet med enzymerne EcoRI og Pmel, og co-transformeret med Swal-lineariseret plasmid backbone pAd5 / ΔH5 (GL) til homolog rekombination, hvilket resulterer i frembringelsen af ​​rekombineret backbone plasmid pAd5 / H5-HVR1-Kwas -HVR5-His 6. I denne figur R1 betegner HVR1 og R5 betegner HVR5, og GL betegner grøn fluorescens protein (GFP) og luciferase, separat. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Evaluering af den antigene eksponering af inkorporerede antigener på capsid overflade af den divalente virusvektor Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6. Hele virusvektor ELISA blev udført for at bestemme, om de inkorporerede antigener blev eksponeret på vektor overflade samtidig med at antigene egenskaber af deres egne. ELISA-plader blev overtrukket med den divalente vektor og inkuberet med humant 2F5 mAb (A) eller muse-anti-His mAb (B). Data indikerede signifikant binding af antistofferne til den divalente vektoren, men ikke til kontrolvektoren Ad5. R1-Kwas-R5-His 6 betegner Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6. Western-blot-analyse blev udført for at bekræfte den antigene binding af det humane 2F5 mAb (C) eller muse-anti-His mAb (D) til de inkorporerede antigener på den divalente vektor. I både (C) og (D), bane 1 indikerer Ad5 og bane 2 angiver Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Evaluering af den divalente virusvektor evne til at undslippe neutralisering af Ad5-positve sera in vitro. Neutralisation assay blev udført for at bestemme, om den divalente vektoren kunne slippe neutraliseringen. Resultaterne indikerede neutraliseringen af ​​Ad5-virus af seraene, men eskappe af neutralisering af den divalente virus in vitro. I denne figur, R1-Kwas-R5-His 6 betegner Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6. Stjernerne *** angiver p-værdi <0,001.

Figur 4
Figur 4. In vivo generering af humoral immunitet med den divalente viral vektor i musemodel. Sera-baserede ELISA blev anvendt til at evaluere det humorale immunitet mod de inkorporerede proteiner på den divalente vektor Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 . HIV-1-peptid (A) og Hans peptid (B) blev overtrukket i ELISA-pladerne separat, efterfulgt af inkubation med musesera fra de to immuniseringsgrupperne (Ad5 og Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6) . Data antydede den betydelige dannelse af humorale immunresponser mod HIV-1-antigenet i HVR1 (A) og His-mærket i HVR5 (B). Hvert datapunkt repræsenterer midler og SD fra otte gentagelser. Stjernerne *** angiver p-værdi <0,001, ** angiver p-værdi <0,01, og * betegner p-værdi <0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Anvendelsen af den traditionelle transgen strategi for Ad5 modifikation for udviklingen af vacciner er blevet reduceret primært som følge af flaskehalsen forbundet med Ad5 PEI 4,6. Denne flaskehals kan delvis formindskes ved anvendelse af alternative Antigen capsidet-Indbygning strategi (figur 1A), da denne strategi kan unddrage neutralisering af Ad5 NABS ved at erstatte neutraliserende epitoper af Ad5 med antigener af interesse, og letter generation af robuste immunitet til de inkorporerede antigener af interesse. I denne undersøgelse, generering af den modificerede divalente viral vektor Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 blev indført som en konceptuel eksempel (figur 1B). Svarende til protokollen punkt 1.1.1, den syntetiserede fragment i den bestilte plasmid indeholder en HIV-1 gp41 korte gen substitution i HVR1 locale af hexon5. Den delvise gp41 gen koder en epitop ELDKWAS, der erstatterdelvis HVR1 fra aminosyrerne 139-144 af hexon5 14. ELDKWAS er et potent neutraliserende epitop i HIV-1 gp41 19.

Under kloning, var der to kritiske trin. Et skridt var udvælgelsen af ​​to restriktionsenzymer når syntese interessen genfragmentet i protokollen punkt 1.1.1. Udvælgelsen af de to enzymer betinget afhænger af placeringen af Ad capsid som skal ændres, dvs.., I denne undersøgelse blev genfragment indeholdende Kwas udpeget til at inkorporere i HVR1 af hexon5 protein. Restriktionsenzymer Agel og AccI findes separat på N-terminal og C-terminal flankerende områder af HVR1 locale, og ikke findes i fragmentet HVR1-Kwas dermed Agel og Accl blev valgt for at være individuelt sættes på N-terminalen og C- terminus af det syntetiserede fragment HVR1-Kwas. Da hexon er den største mål for Ad NABS, og hexon-specifikke neutraliserende epitoper bor i alle HVRs af hexon 12,18, er det muligt, at the hexon modificeret Ad5 vektorer med antigenet capsidet-Indbygning strategi kunne få mulighed for at omgå den neutralisering af Ad5-positive sera in vitro, og selv Ad5 PEI i vært. I denne undersøgelse kunne både HVR1 og HVR5 på den divalente virale vektor bidrage til udslip af neutralisering af Ad5-positive sera. Den anden kritiske skridt var i protokollen punkt 1.2.2. Efter O / N inkubation af co-transformeret blanding på LB-agar, de dyrkede BJ5183 kolonier skal være umiddelbart dyrket i flydende LB for O / N, og plasmider skal straks ekstraheret fra BJ5183 celler såvel. Forsinke procedurer vil sandsynligvis føre til potentielle rekombination og mutationer, da rekombineret plasmid i BJ5183 cellerne ikke er stabil. Den korrekte plasmid fra den homologe rekombination skal omdannes til DH5a for at opretholde en stabil og korrekt genom arter.

Efter kloning var der to flere kritiske trin. Denførste skridt i protokollen afsnit handler om transfektion. Det er nødvendigt at transficere rekombineret Ad backbone plasmidet i celler, der udtrykker Ad5 E1 (HEK293), hvis rygrad plasmidet er E1-genet slettes. Den anden trin i protokollen afsnit 2.3 handler om virus opskalering. Den grundlæggende procedure for virus opskalering følger princippet om standard virus opskalering fra en T-25-kolbe til T-75 kolber og T-175 kolber. Men antallet af kolberne (T-75 og / eller T-175) til anvendelse afhænger af væksten hastighed af virus, CPE udvikling forårsaget af virusinfektion, og mængden af ​​virus nødvendig.

Antigenet capsid--Indbygning strategi giver mulighed for bred anvendelse på Ad ændringer. Med denne strategi, er det muligt at modificere eller inkorporere heterologe antigener på forskellige capsid store proteiner, såsom hexon 2,4,20, penton basis 21 og fiberen 22. Capsid mindre protein pIX C-terminalen viste også lovende for heterologous antigen / peptid inkorporering 21,23. Udover den eneste ændring, flere modifikationer på Ad med denne strategi også opnået succes. Eksempler er generering af divalente Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 i denne undersøgelse fra incorporations i både HVR1 og HVR5 af hexon5, og indarbejdelsen af to neutraliserende epitoper af enterovirus typen 71 til enten HVR1 og HVR2 eller HVR1 og HVR4 eller HVR1 og HVR5 af hexon3 24. Disse eksempler indebærer muligheden for hexon modifikationer i andre serotyper af Ad, med henblik på enten genterapi eller vaccination tilgang. Vores data viste også inkorporering af to Trypanosoma cruzi epitoper i hexon og pIX (upublicerede data). Denne strategi er også blevet udvidet til at gøre kimære Ad-vektorer for enten vaccination eller genterapi tilgange. Eksempler er generering af kimære Ad5H3 ved at skifte hexon5 med hexon3 16, generering af kimære Ad3H7 ved at skifte hexon3 with hexon7 25, og generering af kimære Ad5F4 ved at erstatte Ad5 fiber med Ad4 fiber 26.

I denne undersøgelse den divalente Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 demonstrerede fremkaldelse af humorale immunreaktioner er specifikke for de inkorporerede antigener af interesse. Vores nuværende projekt viser, at Asp2 CD8 T-celle respons er betydeligt primes ved immunisering med en vektor Ad5-pIX-Asp2, som blev frembragt ved at inkorporere Asp2 peptid til protein IX (pIX), i Ad5, med antigenet capsid-Indbygning strategi (data ikke vist). Asp2, også kaldet amastigote overfladeprotein 2, er en immundominant antigen fra digenetic intracellulære protozo parasit Trypanosoma cruzi (T. cruzi) 27. Denne nye eksperimentelle fund udvider vores viden om, at anvendelsen af ​​antigen capsidet-Indbygning strategi for Ad vectored vacciner kan fremkalde ikke kun humorale immunrespons, men også den cellulære Immune reaktioner specifikke for antigener af interesse.

Selv forholdsvis fordelagtigt for traditionelle transgen strategi Antigen capsidet-Indbygning strategi, har også tre ulemper. For det første kan det ikke tillade inkorporering af genet af interesse, så længe traditionelle strategi gør. Det er blevet rapporteret, at Antigen capsidet-Indbygning strategi for hexon5 giver mulighed for indsættelser af maksimalt 80 aminosyrer (aa) i HVR1, 77 aa i HVR5 og 57 aa i HVR2 2. Heraf HVR1 er den mest eftergivende locale for inkorporering. Imidlertid kan den mindre capsidprotein pIX rumme en insertion af 1000 aminosyrer 28. Sekund, nogle antigener af interesse i naturen mislykkes i at inkorporere ind i Ad capsidproteiner, som følge af de faktorer såsom gebyrer og kræfter aminosyrer, som synes at forstyrre den strukturelle arrangement af Ad-virus. I dette tilfælde indførelse af passende afstandsstykker koblet til antigener af interesse kan hjælpe the vellykket integration 4. For det tredje, incorporations i visse HVR lokaliteter, dvs.., HVR6 eller HVR7 kunne føre til mislykkedes generation af levedygtige virale vektorer 12. I betragtning af de fordele og ulemper ved begge strategier, vil en klog valg fra de to strategier eller en kombination af begge strategier afhænger af de særlige forhold / behov. Et eksempel på kæmning begge strategier er dannelsen af ​​Ad5 / HVR2-MPER-L15 (Gag), hvorved membranen-proksimale eksterne region (MPER) af HIV-1 gp41was indarbejdet i HVR2 af hexon5 med antigenet capsid-Inkorporering strategi, og HIV-1 gag-genet blev indsat for at erstatte E1-genet locale af Ad5 med den traditionelle transgen strategi 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet delvist af National Institutes of Health tilskud 5T32AI7493-20 og 5R01AI089337-03. De finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x DPBS Thermo Scientific SH30256.01 for cell spliting 
10x DPBS Thermo Scientific SH30378.02 for dialysis buffer preparation
glycerol SIGMA G5516-1L for dialysis buffer preparation
SDS BIO-RAD 161-0301 for virus lysis buffer preparation
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Scientific SH30910.03 component of culture medium
100x Non-Essential Amino Acids  Thermo Scientific SH30238.01 component of culture medium
200 mM L-glutamine Cellgro 25-005-CI component of culture medium
penicillin/streptomycin solution  Cellgro 30-002-CI component of culture medium
DMEM with high glucose Thermo Scientific SH30081.01 for HEK293 cell culture
Minimum Essential Medium Eagle SIGMA M5650 for HeLa cell culture
phenol:chloroform:isoamyl alcohol  SIGMA P3803-100ML for large size of DNA purification
cesium chloride  Research Products International Corp. C68050 for virus purificiation
HEPES Cellgro 25-060-CI for CsCl solution preparation
HEK293 ATCC 51-0036 for virus rescue and upscale
HeLa ATCC CCL-2 for neutralization assay
T-25 flask Thermo Scientific 156367 for cell culture 
T-75 flask CORNING 430641 for cell culture 
T-175 flask Thermo Scientific 159910 for cell culture 
Ultracentrifuge BECKMAN NA for virus purification
Ultracentrifuge tube BECKMAN 344059 for virus purification
dialysis cassette  Thermo Scientific 66380 for virus dialysis
ELISA plate Thermo Scientific 442404 for ELISA
human anti-gp41 (2F5) mAb NIH AIDS Reagent Program 1475 for immunological assays
mouse anti-His tag mAb GenScript A00186 for immunological assays
SOC medium CORNING 46-003-CR for transformation
PCR master mix solution QIAGEN 201445 for PCR
Animal lancet (point length at 5 mm) MEDIpoint for mice bleeding 
Biophotometer Eppendorf for virus physical titer titration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheng, S. M., et al. Coexpression of the simian immunodeficiency virus Env and Rev proteins by a recombinant human adenovirus host range mutant. Journal of virology. 66, 6721-6727 (1992).
  2. Matthews, Q. L., et al. HIV antigen incorporation within adenovirus hexon hypervariable 2 for a novel HIV vaccine approach. PloS one. 5, e11815 (2010).
  3. DeMatteo, R. P., et al. Long-lasting adenovirus transgene expression in mice through neonatal intrathymic tolerance induction without the use of immunosuppression. Journal of virology. 71, 5330-5335 (1997).
  4. Gu, L., et al. A recombinant adenovirus-based vector elicits a specific humoral immune response against the V3 loop of HIV-1 gp120 in mice through the 'Antigen Capsid-Incorporation' strategy. Virology journal. 11, 112 (2014).
  5. Matthews, Q. L., Krendelchtchikov, A. L. G., Li, Z. C. Viral Vectors for Vaccine Development. INTECH. , (2013).
  6. Tang, D. C., Zhang, J., Toro, H., Shi, Z., Van Kampen, K. R. Adenovirus as a carrier for the development of influenza virus-free avian influenza vaccines. Expert review of vaccines. 8, 469-481 (2009).
  7. Flatt, J. W., Kim, R., Smith, J. G., Nemerow, G. R., Stewart, P. L. An intrinsically disordered region of the adenovirus capsid is implicated in neutralization by human alpha defensin 5. PloS one. 8, e61571 (2013).
  8. Bradley, R. R., Lynch, D. M., Iampietro, M. J., Borducchi, E. N., Barouch, D. H. Adenovirus serotype 5 neutralizing antibodies target both hexon and fiber following vaccination and natural infection. Journal of virology. 86, 625-629 (2012).
  9. Zaiss, A. K., Machado, H. B., Herschman, H. R. The influence of innate and pre-existing immunity on adenovirus therapy. Journal of cellular biochemistry. 108, 778-790 (2009).
  10. Sumida, S. M., et al. Neutralizing antibodies and CD8+ T lymphocytes both contribute to immunity to adenovirus serotype 5 vaccine vectors. Journal of virology. 78, 2666-2673 (2004).
  11. Sumida, S. M., et al. Neutralizing antibodies to adenovirus serotype 5 vaccine vectors are directed primarily against the adenovirus hexon protein. Journal of immunology. 174, 7179-7185 (2005).
  12. Bradley, R. R., et al. Adenovirus serotype 5-specific neutralizing antibodies target multiple hexon hypervariable regions. Journal of virology. 86, 1267-1272 (2012).
  13. Gahery-Segard, H., et al. Immune response to recombinant capsid proteins of adenovirus in humans: antifiber and anti-penton base antibodies have a synergistic effect on neutralizing activity. Journal of virology. 72, 2388-2397 (1998).
  14. Gu, L., et al. Using multivalent adenoviral vectors for HIV vaccination. PloS one. 8, e60347 (2013).
  15. Tian, X., et al. Protection against enterovirus 71 with neutralizing epitope incorporation within adenovirus type 3 hexon. PloS one. 7, e41381 (2012).
  16. Wu, H., et al. Construction and characterization of adenovirus serotype 5 packaged by serotype 3 hexon. Journal of virology. 76, 12775-12782 (2002).
  17. Wu, H., et al. Identification of sites in adenovirus hexon for foreign peptide incorporation. Journal of virology. 79, 3382-3390 (2005).
  18. Qiu, H., et al. Serotype-specific neutralizing antibody epitopes of human adenovirus type 3 (HAdV-3) and HAdV-7 reside in multiple hexon hypervariable regions. Journal of. 86, 7964-7975 (2012).
  19. Parker, C. E., et al. Fine definition of the epitope on the gp41 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 for the neutralizing monoclonal antibody 2F5. Journal of virology. 75, 10906-10911 (2001).
  20. Farrow, A. L., et al. Immunization with Hexon Modified Adenoviral Vectors Integrated with gp83 Epitope Provides Protection against Trypanosoma cruzi Infection. PLoS neglected tropical diseases. 8, e3089 (2014).
  21. Krause, A., et al. Epitopes expressed in different adenovirus capsid proteins induce different levels of epitope-specific immunity. Journal of virology. 80, 5523-5530 (2006).
  22. Omori, N., et al. Modification of a fiber protein in an adenovirus vector improves in vitro gene transfer efficiency to the mouse microglial cell line. Neuroscience letters. 324, 145-148 (2002).
  23. Dmitriev, I. P., Kashentseva, E. A., Curiel, D. T. Engineering of adenovirus vectors containing heterologous peptide sequences in the C terminus of capsid protein IX. Journal of virology. 76, 6893-6899 (2002).
  24. Xue, C., et al. Construction and characterization of a recombinant human adenovirus type 3 vector containing two foreign neutralizing epitopes in hexon. Virus research. 183, 67-74 (2014).
  25. Tian, X., et al. Construction and characterization of human adenovirus serotype 3 packaged by serotype 7 hexon. Virus research. 160, 214-220 (2011).
  26. Kim, J. W., et al. An adenovirus vector incorporating carbohydrate binding domains utilizes glycans for gene transfer. PloS one. 8, e55533 (2013).
  27. Vasconcelos, J. R., et al. Pathogen-induced proapoptotic phenotype and high CD95 (Fas) expression accompany a suboptimal CD8+ T-cell response: reversal by adenoviral vaccine. PLoS pathogens. 8, e1002699 (2012).
  28. Matthews, Q. L., et al. Genetic incorporation of a herpes simplex virus type 1 thymidine kinase and firefly luciferase fusion into the adenovirus protein IX for functional display on the virion. Molecular imaging. 5, 510-519 (2006).

Tags

Immunologi Antigen capsidet-Indbygning strategi transgen metode Adenovirus (Ad) vaccine capsidproteinerne dual ændring allerede eksisterende immunitet (PEI)
Udnytte den Antigen capsidet-Indbygning strategi for udvikling af adenovirusserotype 5-vektoriserede Vaccine Approaches
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gu, L., Farrow, A. L.,… More

Gu, L., Farrow, A. L., Krendelchtchikov, A., Matthews, Q. L. Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches. J. Vis. Exp. (99), e52655, doi:10.3791/52655 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter