Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att generera ett proof-of-principle tvåvärd adenovirus typ 5 (Ad5) vektor Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 genom att använda antigenet Capsid-Incorporation strategi. Denna vektor visat sig uppvisa kvalitativ kondition, till förmågan fly Ad5-positiva sera in vitro och antigeniciteten samt immunogenicitet till de införlivade antigenerna.
Abstract
Adenovirusserotyp 5 (Ad5) har i stor utsträckning modifierats med traditionella transgena metoder för vaccinutveckling. De reducerade verkningsgrad av dessa traditionellt modifierade Ad5 vektorer i kliniska prövningar kan i första hand korrelerad med Ad5 existerande immunitet (PEI) bland majoriteten av befolkningen. Att främja Ad5-vektorvaccinutveckling genom att lösa den oro som Ad5 PEI, har innovativa Antigen Capsid-Incorporation strategi använts. Genom förtjänsten av denna strategi, Ad5-vektoriserade vi först byggde hexon skyttelplasmid HVR1-Kwas-HVR5-His 6 / pH5S genom subkloning den hypervariabla regionen (HVR) 1 av hexon i en tidigare konstruerad skyttelplasmid HVR5-His 6 / pH5S, som hade Hans 6 tag införlivas HVR5. Detta HVR1 DNA-fragment innehållande en HIV-epitop ELDKWAS syntetiserades. HVR1-Kwas-HVR5-His 6 / pH5S var då arise och samtransformeras med linjäriserad ryggrad plasmid pAd5 / ΔH5 (GL),för homolog rekombination. Detta rekombinerade plasmid pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 transfekterades in i celler för att generera virusvektor Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6. Denna vektor valideras för att ha kvalitativa kondition indikeras av viral fysiska titer (VP / ml), infektiös titer (IP / ml) och motsvarande VP / IP-förhållande. Både HIV-epitopen och hans 6 tag var ytexponerade på Ad5 kapsiden, och behöll epitopspecifik antigenicitet av sina egna. En neutralisering analys visade förmågan hos denna divalenta vektor för att kringgå neutralisering med Ad5-positiva sera in vitro. Möss immunisering visat generation av robusta humoral immunitet specifik för HIV-epitopen och hans 6. Detta proof-of-principle studie antydde att protokollet i samband med antigenet Capsid-Inkorporering strategi kan rimligen utnyttjas för generering av Ad5-vektoriserade vacciner genom att modifiera olika kapsidproteiner. Detta protokoll kan även fTTERLIGARE modifierad för generering av sällsynta serotyp adenovirus-vektorvacciner.
Introduction
Humant adenovirus (Ad) är ett medelstort, utan hölje virus med en ikosaedriska nukleokapsid som innehåller en dubbelsträngad DNA-genomet. Ad tillhör Adenoviridae familjen, med en indelning i sju grupper (A till G). Varje grupp innehåller virus av olika serotyper. Varav adenovirusserotyp 5 (Ad5) från grupp C har varit den mest omfattande studier och tillämpas mest för vektoriserade metoder som genterapi och vaccinationer.
Den traditionella transgen strategi har utvecklats och tillämpats för Ad5 ändringar, som kännetecknas av förskjutningen av virus tidiga gener med en gen av intresse, och den fokuserade uttryck av genen av intresse i en värd. Exempel är konstruktionen av pENV9 / Ad5hrΔE3 genom att ersätta tidig gen 3 (E3) med rev-genen av simian immunbristvirus 1, byggandet av AdCMVGag genom att ersätta tidig gen 1 (E1) med gag-genen av humant immunbristVirus (HIV) 2, och byggandet av Ad lac Z genom att ersätta E1 med lac Z-genen 3. Den breda tillämpningen av den traditionella transgen strategi för Ad5 beror på följande meriter: de många datorer i Ad5, genomförbara genteknik på virus och virusförökning, den stora boende av främmande gen insatsen och säkerhet Ad5 4,5. Däremot har de reducerade effektivitet av Ad5-vektoriserade kliniska terapier genom användning av denna strategi varit en stor flaskhals, som har kartlagts till i första hand förknippas med Ad5 PEI, eftersom Ad5 är så utbredd bland de flesta barn och vuxna 4,6.
För att övervinna det stora hinder som Ad5, är det primära målet att utveckla en alternativ strategi kringgå Ad5 PEI. Medfödd immunitet 7, adaptiv immunitet såsom neutraliserande antikroppar (NABS) 8-10 och CD8 + T-cellsvar 10 mot Ad5 har visats contribute Ad5 PEI, med Ad5 haffar ser ut att spela en dominerande roll i bidragen till Ad5 PEI 10,11. Dessutom Ad5 haffar målepitoper ligger i kapsidproteiner, inklusive den stora protein hexon, fiber och penton bas. Varav är hexon huvudmålet för Ad5 haffar 8,11-13. Baserat på dessa upptäckter har en innovativ antigen Capsid-Incorporation strategi införts. Denna nya strategi belyser utbyte eller inkorporering av proteiner-of-intresse på Ad5 kapsidproteiner, som skiftar eller döljer Ad5 neutraliserande epitoper, vilket leder till minskade erkännande av alkoholfria drycker och effektiva Ad5 vektor förvaltningar. Det är anmärkningsvärt att denna strategi är konkurrenskraftiga eftersom det kan också hjälpa värdar framkallar robust humoral immunitet och potent cellulär immunitet genom att direkt presentera antigener av intresse för immunsystemet 4,14,15. Baserat på denna strategi, kan den molekylära kloningen och rekombinant Ad virusvektor räddning strukturellt delasi fyra steg: (a) framställning av genen av intresse fragment av antingen polymerase chain reaction (PCR) eller syntes; (B) ligering av genen fragment i en skyttel plasmid som innehåller genen av intresse fragment och homologa vapen till ett adenovirus ryggrad; (C) den homolog rekombination genom samtidig omvandla buss plasmid som innehåller genen av intresse fragment med arise ryggraden plasmiden pAd5 / ΔH5 (GL) 16; (D) transfektion av arise rekombinanta adenovirala plasmid för att rädda den rekombinanta Ad vektorn införlivas med antigen-of-intresse.
Vår grupp och några andra har utökat denna alternativa annons införlivande strategi för Ad vektoriserade vaccinutveckling mot olika patogener. Vi rapporterade generering av en rekombinant Ad vektor Ad-HVR1-LGS-His 6 -V3 genom införlivande av en His-märkt HIV-1-antigenet V3 in HVR1 locale av Ad5 hexon (hexon5). Detta genererade vektor utlöste strong humoralt immunsvar specifikt mot V3-epitopen 4. Vi rapporterade också utvecklingen av Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 genom införlivande HIV-1-membran proximala ektodomän region (MPER) i HVR2 locale av hexon5 2. Dessutom har Dr Zhou grupp använt fördelarna med denna annons införlivande strategi att utveckla annons serotyp 3 (Ad3) vektoriserade vacciner, dvs., Generering av virusvektor R1SP70A3 genom att införliva en neutraliserande epitop SP70 av Enterovirus 71 i HVR1 av Ad3 hexon (hexon3). R1SP70A3 genererade starka alkoholfria drycker och IFN-γ produktion specifika för epitopen SP70, som leder till den höga graden av skydd mot Enterovirus 71 utmaning 15.
För tekniska referens, tog vår studie fördel av den kvalitativa Antigen Capsid-inkorporering strategi att fokusera på produktion av en tvåvärd Ad5 vektor Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 genom att införliva en HIV-1-antigen i HVR1 enda His-markör in HVR5 av hexon5. Den alstrade virala vektorn var också immunologiskt utvärderades. Den Antigen Capsid-Inkorporering strategi skulle kunna användas för att utveckla Ad5-vektoriserade vaccinations metoder mot olika infektionssjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
University of Alabama i Birmingham Institutional Animal Användning och skötsel kommittén godkänt användningen av möss som beskrivs häri omfattas av det godkända protokoll nummer 101.109.272.
1. Genetisk Konstruktion av en modifierad plasmid pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 med Antigen Capsid-inkorporering strategi
- Konstruktion av skyttelplasmid HVR1-Kwas-HVR5-His 6 / pH5S
- Beställa en plasmid innehållande den syntetiserade DNA-sekvensen HVR1-Kwas mellan restriktionsenzymställen Agel till Accl av hexon5 genen.
- Digest 6 ^ g av det syntetiserade fragmentet (HVR1-Kwas) med enzymerna Agel (6 enheter) och Accl (6 enheter) under 3 timmar vid 37 ° C. Lös de uppdelade fragmentet i en 2% agarosgel genom elektrofores, och rena fragmentet med en DNA-gelextraktionskit enligt tillverkarens protokoll.
- Baserat på det molära förhållandet av insatsen till vektor vid 3: 1, använd T4 DNA-ligas och ligas bUffer att ligera 12 ng av fragmentet (HVR1-Kwas) in i 100 ng av en tidigare konstruerad skyttelplasmid HVR5-His 6 / pH5S 17 i en 10 jil volym vid RT under 2 h, via områden av Agel och Accl.
- Omvandla 1 pl av 10 pl av ligeringsprodukten i 50 pl elektro DH5a-celler i ett elektroporator (vid 1800 V). Lägg 950 | il av SOC-medium till de transformerade DH5a-celler och inkubera blandningen under en timme vid 37 ° C med 300 varv per minut. Sprid 100-200 pl av ett ml blandningen på Luria-Bertani (LB) agar innehållande kanamycin och inkubera O / N vid 37 ° C.
- För att screena ~ 10 kolonier från PCR riktar fragmentet HVR1-Kwas, blanda den framåtriktade primern (TATGTGTGTCATGTATGCGT), omvänd primer (GGAGGCCCACTTGTCCAGCTC) och en enda DH5a koloni i en PCR Master Mix lösning (enligt tillverkarens protokoll). Kör prov på en termo genom att hänvisa till bruksanvisningen som medföljer PCR Master Mix lösning.
- Använd den framåtriktade primern (TATGTGTGTCATGTATGCGT) att sekvensera fragmentet HVR1-Kwas i screenade kloner i avsnitt 1.1.4.1.
- Konstruktion av plasmiden pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6
- Digest 6 pg av HVR1-Kwas-HVR5-His 6 / pH5S med enzymer EcoRI (6 enheter) och Pmel (6 enheter) under 3 timmar vid 37 ° C, och rena fragmentet innehållande homologa rekombinations armar och den dubbla modifierade hexon5 genen, såsom anges i steg 1.1.2. Linjärisera ryggraden plasmiden pAd5 / ΔH5 (GL) 16 med Swal.
- Co-transform 100 ng av mål-fragmentet från skytteln plasmiden och 100 ng av den linearise pAd5 / ΔH5 (AR) ryggraden i 50 pl av elektrokompetenta BJ5183 celler för homolog rekombination i en elektroporator (vid 1800 V). Lägg 950 | il av SOC-medium till de transformerade cellerna och inkubera blandningen under en timme vid 37 ° C, 300 varv per minut. Sprid 100-200 pl av 1 ml blandningpå LB-agar innehållande kanamycin (slutlig 50 | ig / ml) för O / N inkubation vid 37 ° C.
- Pick ~ 10 små kolonier i 3 ml flytande LB innehållande kanamycin (slutlig 50 | ig / ml) för O / N inkubering vid en skakapparat (250 varv per minut, 37 ° C). Extrahera plasmider från odlingen. Använd PCR-analys för att screena 10 kolonier genom att rikta fragmentet HVR1-Kwas, såsom visas i steg 1.1.4.1.
- För att screena samma kolonier genom PCR-analys med inriktning på plX fragmentet av ryggraden genomet, blanda den framåtriktade primern (AGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTT), omvänd primer (CCAAACAGAGTCTGGTTTTTTATTTAT) och en enda BJ5183 koloni i en PCR-huvudblandning lösning (enligt tillverkarens protokoll). Kör prov på en termo genom att hänvisa till bruksanvisningen som medföljer PCR Master Mix lösning.
- Utse de PCR dubbel-positiva kolonier som pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6.
- Omvandla 100 ng av plasmiden pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 iatt DH5a-celler som visas i steg 1.1.4.
- Använd PCR-analys för att screena ~ 10 kolonier genom att rikta fragmentet HVR1-Kwas, såsom visas i steg 1.1.4.1.
- Använd PCR-analys för att screena samma kolonierna genom att rikta den plX fragmentet av ryggraden genomet, såsom visas i steg 1.2.2.2.
- Använd den framåtriktade primern (TATGTGTGTCATGTATGCGT) att sekvensera fragmentet HVR1-Kwas i pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6.
2. Framställning av modifierad Ad5 virala vektorer Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6
- Utgör det kompletta mediet genom tillsats av FBS (slutlig 10%), 100X Icke-essentiella aminosyror (slutlig 0,1 mM), 200 mM L-glutamin (slutlig 2 mM) och penicillin / streptomycin-lösning (slutlig 1%) i DMEM med hög glukoshalt . Upprätthålla humana embryonjur (HEK293) -celler i fullständigt medium i en odlingsinkubator (37 ° C och 5% CO2 i 85% fuktade betingelser).
- Räddning av viralt vector Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6
- Frö 3,0 x 10 6 av de HEK293-celler i en T-25 kolv innehållande 5 ml komplett medium och kulturen O / N för att åstadkomma ett monoskikt med 80% konfluens.
- Linearisera 15 pg av pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 i en 100 | il volym med restriktionsenzymet Pacl (15 enheter) vid 37 ° C under 3 timmar.
- Extrahera linjäriserad pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 genom centrifugering av reaktions två gånger (10.000 x g under 1 min) med en lika stor volym fenol: kloroform: isoamylalkohol (förhållande på 25: 24: 1) i ett dragskåp och genom sekventiell centrifugering (10.000 x g under 10 min) med en blandad lösning (300 | il 100% etanol och 10 ^ il natriumacetat) och 700 | il av 70% etanol. Kasta supernatanten vid varje centrifugeringssteg.
- Resuspendera den renade plasmiden i ~ 40 | il destillerat vatten eller Tris-EDTA (TE) buffert. Kvantifiera plasmid-DNA genom att mäta den optiska density (OD) vid 260 nm.
- Transfektera 3 pg av ariserade plasmiden med kommersiell liposomal transfektion reagens i T-25 kolv, enligt tillverkarens handbok. Ändra transfektionsmediet med fullständigt medium vid 6 h efter transfektion och efterföljande inkubering i odlingsinkubator. Behåll transfekterade celler genom att ersätta komplett medium var två till tre dagar, tills individuell virala plack form.
- När plack utvecklas till full cytopatisk effekt (CPE), skrapa de återstående cellerna utanför kolven i en steril huv, och skörd cellysatet genom att centrifugera mediet vid 300 xg under 10 min vid 4 ° C. Suspendera cellpelleten i ~ 1 ml medium innehållande 2% FBS, och bryta cellerna genom frysning-tining fyra gånger. Samla upp supernatanten innehållande undsatta viruset efter centrifugering lysatet vid 10.000 xg under 10 minuter vid 4 ° C.
- Storskalig spridning av den virala vektorn Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6
- Utbreda thE-virus i en T-75 kolv innehållande HEK293-celler i den sterila huven genom att infektera med 1/3 till full lysat från T-25-kolv. Tillåt fullständig CPE att utvecklas inom två till tre dagar i odlingsinkubator. Skörda lysatet vätskan som anges i steg 2.2.5.
- Sprida virus i 02:59 T-175-kolvar i den sterila huven genom att infektera med halv till full lysat från T-75-kolv, beroende på virusutbredningsförhållanden. Tillåt fullständig CPE att utvecklas inom två till tre dagar i odlingsinkubator. Skörda lysatet vätskan som anges i steg 2.2.5.
- Propagera viruset i ett dussin eller flera T-175-kolvar i den sterila huven genom att infektera med halv till full lysat från föregående T-175-kolv (ar). Bestäm mängden kolven användningen baserat på virusutbredningsförhållanden och mängden virus i nöd. Skörda lysatet vätskan som anges i steg 2.2.5 när den är full CPE sker inom två till tre dagar i kultur inkubator.
- Purifblue av Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 genom cesiumklorid
- Bered två densiteter av CsCl-lösningar i 5 mM HEPES: 1,33 g / ml och 1,45 g / ml, samtidigt som man undviker kontakt med CsCl.
- Belastning 4 ml CsCl (1,33 g / ml) i en steril ultracentrifugrör, och försiktigt ladda 4 ml CsCl (1,45 g / ml) mot botten av röret. Belastning 4 ml lysat supernatanten långsamt på toppen av gradienter i den sterila huven.
- Centrifugera röret vid 110.000 xg under tre timmar vid 4 ° C för att separera den mogna / lägre Virusbandet från den defekta / högre virusbandet. Samla det undre bandet med användning av en 3 ml spruta beväpnad med en 33 G nål och späd bandet med 5 mM HEPES till en 4 ml volym i den sterila huven.
- Ladda ett annat rör med två densiteter av CsCl-lösningar och den utspädda band av viruset såsom beskrivs i steg 2.4.2. Centrifugera röret vid 110.000 x g O / N vid 4 ° C. Samla den virala bandet som beskrivs i steg 2.4.3.
- Injicera samlas viruslösningen i en dialysär kassetten genom en 3 ml spruta beväpnad med en 33 G nål i den sterila huven.
- Placera kassetten i 700 ml 1x dialysbuffert (1 L recept: 100 ml 10x PBS, 100 ml 100% glycerol och 800 ml destillerat vatten; filtrera bufferten genom ett 0,22 ^ m filter) och byt dialysbufferten varje 3 hrs för fyra gånger. Aspirera ut dialyserat viruslösningen med användning av nålade spruta.
3. Validering av räddade virusvektor
- Viral vektor titreringar
- För virusen fysiska titer, späd både virus och dialysbuffert (bakgrundskontroll) vid ett: 10 och 1: 20 i viruslyseringsbuffert (10% SDS i Tris-EDTA) i små rör och inkubera alla rör vid 56 ° C under 10 min.
- Slå på en biophotometer och ställa in läget av absorbansen vid OD 260 nm. Använd den utspädda dialysbuffert (1: 10) för att balansera bakgrundssignalen genom att klicka "tomma" botten. Typ "10 + 90" i biophotometer screen och läs signalen av det utspädda viruset (1: 10).
- Läs signalen av det utspädda viruset (1: 20) genom att följa metoden i steg 3.1.2, men i stället skriver "5 + 95" i biophotometer skärmen. Multiplicera de två virusavläsnings nummer genom 1,1x10 12 och beräkna den genomsnittliga titer med en enhet som VP / ml, baserat på de två individuella titer från de två utspädningar.
- För viruset infektiös titer (IP / ml), använd Karber statistiska TCID50 metod 14 för att bestämma infektionsdjup på HEK293-celler på 10 dagar efter infektion (dpi)
- Utvärdering av antigen exponering visas på den virala vektorn
- Täck virusvektor i en ELISA-platta och fortsätta med resten av stegen i en standard ELISA-metod 14. Använd humant anti-gp41 (2F5) monoklonal antikropp (mAb) och mus-anti-His-markör-mAb för detektion av motsvarande inkorporerade antigener 14.
- Lösa den virala vektorn i en denaturöd protein gelelektrofores (SDS-PAGE) och fortsätt med resten av stegen i en vanlig västerländsk blot-metoden 14. Använd humant anti-gp41 (2F5) monoklonal antikropp (mAb) och mus-anti-His-markör-mAb för detektion av motsvarande inkorporerade antigener 14.
- In vitro-utvärdering av vektorn på förmågan att kringgå Ad5-positve sera
- Behåll HeLa-celler i komplett medium i odlingsinkubator (37 ° C och 5% CO2 i 85% fuktade betingelser). Utgör det kompletta mediet genom tillsats av FBS (slutlig 10%), 200 mM L-glutamin (slutlig 2 mM) och penicillin / streptomycin-lösning (slutlig 1%) in Minimum Essential Medium Eagle (MEME).
- Seed HeLa-celler i 6-brunnsplattor vid 1x10 6 celler / brunn och inkubera plattorna i odlingsinkubator (37 ° C och 5% CO2 i 85% fuktade betingelser) under 2 timmar. Inkubera Ad5-positiva sera (0,1 pl eller 0 il) med 5 IP / cell av virusvektor (Ad5 eller Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6) i odlings inkubator under 1 timme innan du lägger till blandningarna på de 6-brunnsplattor innehållande celler.
- Vid 24 timmar efter infektion (HPI), skölj cellerna en gång med PBS och lysera celler i 0,5 ml lyseringsbuffert. Centrifugera vid 15.000 xg under 5 min och samla supernatanten. Blanda 20 pl av supernatanten med 100 | il luciferas substrat för luciferas signalläsning, eftersom virus innehåller luciferasgenen.
4. Immunologiska Utvärdering av räddade virusvektor
- Bered två immuniseringsgrupper: Ad5 och Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6.
- Injicera möss (n = 8 / grupp) intramuskulärt med virus på 1x10 10 VP / mus, i en homolog "prime-boost" immunisering regim, med ett intervall på 2 veckor.
- Vid 2 veckor efter varje injektion, blöda möss utan bedövning genom kinden blödning med djurlansetter (5 mm spets längd) ochsamla blod i 1,5 ml rör.
- Blanda blodet i rören genom att vända upp och ned, och inkubera blodet vid RT under 30 minuter. Spin rören vid 10.000 xg under 5 min vid 4 ° C och avsättning sera (toppskikt) till nya 1,5 ml rör.
- Snurra nya rör vid 10000 x g under 5 minuter vid 4 ° C och avsättning sera mot nyligen märkt 1,5 ml rör för lagring vid -80 ° C.
- Utvärdering av antigenspecifika humoral immunitet genom serum-baserade ELISA
- Späd Hans peptid (lager på 1 mM) och HIV-1-peptid (lager på 1 mM) separat i 100.
- mM karbonatbuffert (pH 9,5) för att uppnå den peptidbeläggningskoncentration på 10 pM. Belägga ELISA-plattor med de utspädda peptidema separat genom att lägga till 100 | j, l per brunn och inkubering av plattorna O / N vid 4 ° C.
- Tvätta plattorna med PBST under fyra gånger vid 200 | il / brunn och block för ett h i 5% BSA i PBST. Applicera mus-sera till plattorna vid ett: 100 spädning i blockerings buffer, 100 ul / brunn. Inkubera i 2 h inkubation vid RT.
- Tvätta plattorna med PBST under fyra gånger. Blockera plattorna genom inkubering vid rumstemperatur under 30 minuter i blockerande buffert vid 100 | il / brunn.
- Applicera get-anti-mus-IgG-HRP (1: 5000 i blockerande buffert) vid 100 | il / brunn till båda plattorna belagda med Hans peptid och HIV-1-peptid individuellt. Inkubera i 2 h vid RT. Tvätta plattorna med PBST.
- Läs plattorna vid OD450 nm efter inkubering med HRP-substrat under 30 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den antigen Capsid-Inkorporering strategi (Figur 1A) användes för att generera den divalenta Ad5 virala vektorn Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6. För det första, skyttelplasmid HVR1-Kwas-HVR5-His 6 / pH5S konstruerades genom subkloning av HVR1-Kwas fragment i föregående konstruerad skyttelplasmid HVR5-His 6 / pH5S 17. För det andra plasmiden pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 14 konstruerades genom en homolog rekombination mellan fragment av "EcoRI-HVR1-Kwas-HVR5-His6-Pmel" och Swal-arise pAd5 / ΔH5 (GL ) 16 (Figur 1B). Transfektion av Pacl diger pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 i en T-25 kolv leder till undsättning av den virala vektorn Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 14. Den räddade viral vektor därefter förökas i stor skala och renades genom två cykler av CsCl-gradient ultracentrifug.
För attvisa lönsamhet / lämplighet räddade virusvektor Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6, den fysiska titer bestämdes vid 1,3 x 10 11 VP / ml genom att mäta fysiska kopior av viralt genom, och den smittsamma titern var bestämd vid 1,4 x 10 9 IP / ml genom att titrera de faktiska smittsamma viruspartiklar. VP / IP förhållandet därefter beräknats till 92 14. Normalt en annons med en VP / IP-förhållande under 1000 indikerar en kvalitativ lämplighet detta virus. För att påvisa huruvida detta undsatta viruset visar den antigena HIV-antigen och His-markör respektive på ytan av den virala kapsiden huvudsakliga protein hexon5 ades ELISA genomförts med mänskligt 2F5 mAb och mus-anti-His-markör-mAb, respektive. Resultaten indikerade att både den humana 2F5 mAb (figur 2A) 14 och mus-anti-His-markör-mAb (Figur 2B) 14 uppvisade bindning till Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6, medan det inte fanns någon bindning till den negativa control vektor Ad5. Western-blot-analys användes för att bekräfta uppgifterna i ELISA, både mänskligt 2F5 mAb (figur 2C) 14 och mus anti-His tag mAb (figur 2D) 14 upptäckta särskilda band runt 117 kDa endast i viruset Ad5 / H5- HVR1-Kwas-HVR5-His 6, vilket motsvarar storleken av hexon5 protein. För att utvärdera potentialen hos Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 i kringgå neutralisering av Ad5-positiva sera, neutralisationsanalysen analys genomfördes såsom anges i protokollet avsnitt 3.3. Resultaten visade att den relativa luminiscent enheten signal (RLU) från den virala vektorn Ad5 behandlades med 0 il Ad5-positve sera är 12 gånger högre än från samma vektor som behandlats med 0,1 pl av Ad5-positve sera (p-värde <0,001 ). Detta antydde neutraliseringen av vektorn Ad5 av Ad5-positvive sera. Däremot fanns det ingen större skillnad från den virala vektorn Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6behandlades med 0 il och 0,1 pl Ad5-positve sera (Figur 3). Eftersom hexon är huvudmålet för Ad NABS och hexon specifika neutraliserande epitoper bor i alla HVRs av hexon 12,18, data ovan visat att Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 undgått neutralisering med Ad5-positve sera in vitro och föreslog potentialen hos Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 på kringgå Ad5 PEI i värden.
För att undersöka om det ändrade tvåvärda Ad5 virusvektor med Antigen Capsid-Inkorporering strategi kan framkalla stark humoral immunitet specifik för de införlivade antigenerna-of-intresse, var "prime-boost" immuniseringsregim tillämpas immunisera möss med kontroll virusvektor Ad5 och den divalenta vektor Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6. Sera-baserade ELISA belagda med HIV-1-peptid visade att sera från immunisering grupp Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 hade significant-bindning till HIV-1-peptid vid spädningar mellan 40 och 640, i jämförelse med serum från kontrollgruppen (p-värde <0,001) (Figur 4A) 14. Sera-baserade ELISA belagda med sin peptid visade att sera från immunisering grupp Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 hade signifikant bindning till Hans peptiden jämfört med sera från kontrollgruppen, som statistiskt p-värde < 0,001 vid sera utspädningar av 40 och 80, p-värde <0,01 vid utspädning av 160 och p-värde <0,05 vid en 320 utspädning (figur 4B) 14. Ovanstående resultat indikerade alstringen av humoralt immunsvar mot de inkorporerade antigener på tvåvärda virala vektorn.
Figur 1. Schematisk illustration av den genetiska konstruktionen av plasmid pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 med Antigen Capsid-inkorporering strategi. (A) Antigen Capsid-Incorporation strategi kännetecknas av direkt visa antigen av intresse på kapsidproteinerna (hexon, penta bas, plX och / eller fiber) av adenovirus. Denna siffra var anpassad från Nemerow et al., 2009. Virology 384 (2009) 380-388, upphovsrätt Elsevier. (B) Gene fragment (HVR1-Kwas) syntetiserades och klonades in i en pUC-vektor av ett företag. Detta fragment subklonades in i den tidigare konstruerade skyttelplasmid HVR5-His 6 / pH5S av restriktionsenzymerna Agel och Accl för att generera HVR1-Kwas-HVR5-His 6 / pH5S. Den resulte transfer plasmid digererades med enzymerna EcoRI och Pmel, och co-transformerades med Swal-linjäriserad ryggrad plasmiden pAd5 / ΔH5 (AR) för homolog rekombination, vilket resulterar i genereringen av den rekombinerade ryggraden plasmiden pAd5 / H5-HVR1-Kwas -HVR5-His 6. I denna figur, R1 betecknar HVR1 och R5 betecknar HVR5 och GL betecknar grönt fluorescerande protein (GFP) och luciferase separat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Utvärdering av den antigena exponeringen av inkorporerade antigener på kapsid ytan av den tvåvärda virala vektorn Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6. Sammanlagt viral vektor-ELISA utfördes för att bestämma om de införlivade antigener exponerades på vektorn yta bibehållen antigen egenskaperna hos sina egna. ELISA-plattor belades med den tvåvärda vektorn, och inkuberades med humant 2F5 mAb (A) eller mus-anti-His-mAb (B). Data indikerade signifikant bindning av antikropparna till den tvåvärda vektorn, men inte till styrvektorn Ad5. R1-Kwas-R5-His 6 betecknar Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6. Western-blot-analys utfördes för att bekräfta den antigena bindningen av humant 2F5 mAb (C) eller mus-anti-His-mAb (D) till de införlivade antigenerna på den divalenta vektorn. I båda (C) och (D), spår 1 indikerar Ad5, och spår 2 visar Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Utvärdering av den tvåvärda virala vektorn förmåga att undkomma neutralisering genom neutralisationsanalysen Ad5-positve sera in vitro. Utfördes för att bestämma om den divalenta vektor skulle undkomma neutralisering. Resultaten visade att neutralisering av Ad5-virus av sera, men esudden neutralisering av tvåvärda virus in vitro. I denna figur betecknar R1-Kwas-R5-His 6 Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6. Asteriskerna *** betecknar p-värde <0,001.
Figur 4. In vivo generationen av humoral immunitet med den tvåvärda virala vektorn i musmodell. Sera-baserad ELISA användes för att utvärdera den humorala immunitet mot de inkorporerade proteinerna på den tvåvärda vektorn Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 . HIV-1-peptiden (A) och hans peptid (B) belades i ELISA-plattorna separat, följt av inkubering med mus-sera från de två immuniseringsgrupperna (Ad5 och Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6) . Data indikerade signifikant alstringen av humorala immunsvar mot HIV-1 antigen i HVR1 (A) och hans tag i HVR5 (B). Varje datapunkt representerar medel och SD från åtta replikat. Asteriskerna *** betecknar p-värde <0,001, ** betecknar p-värde <0,01, och * betecknar p-värde <0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tillämpningen av den traditionella transgen strategi för Ad5 ändring för utveckling av vaccin har minskat främst på grund av flaskhalsen i samband med Ad5 PEI 4,6. Denna flaskhals kan delvis minskas genom tillämpning av alternativa Antigen Capsid-Incorporation strategi (Figur 1A), eftersom denna strategi kan undgå neutralisering av Ad5 alkoholfria drycker genom att ersätta neutraliserande epitoper av Ad5 med antigener-of-intresse, och underlätta bildandet av robust immunitet till de införlivade antigenerna-of-intresse. I denna studie, genereringen av den modifierade tvåvärda virusvektor Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 infördes som en konceptuell exempel (Figur 1B). Motsvarande protokoll punkt 1.1.1, den syntetiserade fragmentet i den beställda plasmiden innehåller en HIV-1 gp41 kort gen substitution i HVR1 lokalen av hexon5. Den partiella gp41-genen kodar en epitop ELDKWAS, som ersätterpartiell HVR1 från aminosyrorna 139-144 av hexon5 14. ELDKWAS är en potent neutraliserande epitop i HIV-1 gp41 19.
Under kloning, fanns det två kritiska steg. Ett steg var valet av två restriktionsenzymer när syntetisering genfragmentet intresse i protokollsektionen 1.1.1. Valet av de två enzymerna beror villkorligt på platsen för annons kapsiden ändras, dvs., I denna studie, var genfragment innehållande Kwas utsetts att införliva HVR1 av hexon5 protein. Restriktionsenzymer Agel och Accl finns separat på N-terminalen och C-terminalen flankerande områden i HVR1 lokalen, och inte existerar i fragmentet HVR1-Kwas, alltså Agel och Accl valdes till individuellt ställas till N-terminalen och C- terminalen av den syntetiserade fragmentet HVR1-Kwas. Eftersom hexon är huvudmålet för Ad NABS och hexon specifika neutraliserande epitoper är bosatta i alla HVRs av hexon 12,18, är det möjligt att the hexon modifierad Ad5 vektorer med Antigen Capsid-Incorporation strategi skulle kunna få möjlighet att kringgå neutraliseringen av Ad5-positiva sera in vitro, och även Ad5 PEI i värden. I denna studie kunde både HVR1 och HVR5 på den divalenta virala vektorn att bidra till utsläpp av neutralisering med Ad5-positiva sera. Den andra kritiska steget var i protokollet avsnitt 1.2.2. Efter O / N-inkubation av samtransforme blandning på LB-agar, de odlade BJ5183 kolonierna behöver vara omedelbart odlades i flytande LB för O / N och plasmider måste omedelbart extraheras från BJ5183 celler såväl. Försena förfarandena kommer sannolikt att leda till potentiella rekombination och mutationer, eftersom rekombinerade plasmiden i BJ5183 cellerna är inte stabil. Den korrekta plasmiden från homolog rekombination måste omvandlas till DH5a för att bibehålla en stabil och korrekt genom arter.
Efter kloning, fanns det två mer kritiska steg. Denförsta steg i protokollsektionen är ca transfektion. Det är nödvändigt att transfektera den rekombinerade annons ryggraden plasmiden in i celler som uttrycker Ad5 E1 (HEK293), om ryggraden plasmiden är E1-genen tagits bort. Den andra steget i protokollet avsnitt 2.3 handlar om virus uppskalning. Den grundläggande proceduren för virus uppskalning följer principen om standardvirus uppskalning från en T-25 kolv till T-75-kolvar och T-175 flaskor. Men antalet av kolvarna (T-75 och / eller T-175) för användning beror på tillväxthastigheten hos viruset, CPE utveckling orsakad av virusinfektionen, och mängden virus som behövs.
Den Antigen Capsid-Incorporation strategi möjliggör bred tillämpning på Ad ändringar. Med denna strategi är det möjligt att modifiera eller infoga heterologa antigener på olika kapsid stora proteiner, såsom hexon 2,4,20, penton bas 21 och fibern 22. Kapsiden mindre protein plX C-terminalen visade också lovande för heterologous antigen / peptid-inkorporering 21,23. Förutom enda modifiering flera ändringar på Ad med denna strategi uppnås även framgång. Exempel på detta är alstringen av tvåvärda Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 i denna studie genom inkorporationer i både HVR1 och HVR5 av hexon5, och införlivandet av två neutraliserande epitoper av enterovirus typ 71 till antingen HVR1 och HVR2 eller HVR1 och HVR4 eller HVR1 och HVR5 av hexon3 24. Dessa exempel innebära att möjligheten att hexon ändringar i andra serotyper av Ad, i syfte att antingen genterapi eller vaccinering strategi. Våra data visade också bolagisering av två Trypanosoma cruzi epitoper i hexon och plX (opublicerade data). Denna strategi har också utökats för att göra chimära Ad-vektorer för antingen vaccination eller genterapi tillvägagångssätt. Exempel på detta är alstringen av chimära Ad5H3 genom omkoppling hexon5 med hexon3 16, alstringen av chimära Ad3H7 genom omkoppling hexon3 with hexon7 25 och generering av chimär Ad5F4 genom att ersätta Ad5 fiber med Ad4 fiber 26.
I denna studie, den divalenta Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 visat framkallande av humorala immunsvar som är specifika för de införlivade antigenerna-of-intresse. Vår nuvarande projekt visar att cellsvaret ASP2 specifika CD8 T avsevärt primas genom immunisering med en vektor Ad5-plX-ASP2, som genererades genom att införliva ASP2 peptid till protein IX (PIX) i Ad5, med antigenet Capsid-inkorporering strategi (data ej visade). ASP2, namnges också amastigote ytprotein 2, är en immun antigen av digenetic intracellulära protozoparasit Trypanosoma cruzi (T. cruzi) 27. Denna nya experimentella fynd utökar vår kunskap att tillämpningen av antigen Capsid-Incorporation strategi för Ad vektoriserade vaccin kan framkalla inte bara humorala immunsvar, men också den cellulära Immune svar som är specifika för antigenerna-of-intresse.
Även om förhållandevis fördelaktigt för den traditionella transgen strategi har Antigen Capsid-Incorporation strategi också tre nackdelar. För det första kan det inte tillåta inkorporering av genen av intresse så länge som traditionella strategi gör. Det har rapporterats att Antigen Capsid-Incorporation strategi för hexon5 tillåter insättningar av högst 80 aminosyror (aa) i HVR1, 77 aa i HVR5 och 57 aa i HVR2 2. Varav är HVR1 den mest tillåtande språk för inkorporering. Emellertid kan den mindre kapsidproteinet plX rymma en insertion av 1000 aminosyror 28. För det andra, vissa antigener-of-intresse för naturen misslyckas i införliva annons kapsidproteinerna, på grund av faktorer såsom avgifter och styrkor av aminosyror, som tycks störa den strukturella arrangemang av Ad-virus. I det här fallet, införandet av lämpliga distanser kopplade till antigener av intresse kan hjälpa ee framgångsrik inkorporering 4. För det tredje, inkorporeringar i vissa HVR lokaler, dvs., HVR6 eller HVR7 skulle kunna leda till misslyckade generation av livskraftiga virala vektorer 12. Med tanke på de fördelar och nackdelar med båda strategierna, kommer en klok urval från de båda strategierna eller en kombination av båda strategierna beror på de specifika villkor / behov. Ett exempel på kamning båda strategierna är genereringen av Ad5 / HVR2-MPER-L15 (Gag), varigenom membran proximala yttre område (MPER) av HIV-1 gp41was inkorporerade i HVR2 av hexon5 med antigenet Capsid-Inkorporering strategi, och HIV-1-gag-genen sattes in för att ersätta den E1-genen locale av Ad5 med den traditionella transgenen strategin 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av National Institutes of Health ger 5T32AI7493-20 och 5R01AI089337-03. De finansiärer hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x DPBS | Thermo Scientific | SH30256.01 | for cell spliting |
| 10x DPBS | Thermo Scientific | SH30378.02 | for dialysis buffer preparation |
| glycerol | SIGMA | G5516-1L | for dialysis buffer preparation |
| SDS | BIO-RAD | 161-0301 | for virus lysis buffer preparation |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30910.03 | component of culture medium |
| 100x Non-Essential Amino Acids | Thermo Scientific | SH30238.01 | component of culture medium |
| 200 mM L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | component of culture medium |
| penicillin/streptomycin solution | Cellgro | 30-002-CI | component of culture medium |
| DMEM with high glucose | Thermo Scientific | SH30081.01 | for HEK293 cell culture |
| Minimum Essential Medium Eagle | SIGMA | M5650 | for HeLa cell culture |
| phenol:chloroform:isoamyl alcohol | SIGMA | P3803-100ML | for large size of DNA purification |
| cesium chloride | Research Products International Corp. | C68050 | for virus purificiation |
| HEPES | Cellgro | 25-060-CI | for CsCl solution preparation |
| HEK293 | ATCC | 51-0036 | for virus rescue and upscale |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | for neutralization assay |
| T-25 flask | Thermo Scientific | 156367 | for cell culture |
| T-75 flask | CORNING | 430641 | for cell culture |
| T-175 flask | Thermo Scientific | 159910 | for cell culture |
| Ultracentrifuge | BECKMAN | NA | for virus purification |
| Ultracentrifuge tube | BECKMAN | 344059 | for virus purification |
| dialysis cassette | Thermo Scientific | 66380 | for virus dialysis |
| ELISA plate | Thermo Scientific | 442404 | for ELISA |
| human anti-gp41 (2F5) mAb | NIH AIDS Reagent Program | 1475 | for immunological assays |
| mouse anti-His tag mAb | GenScript | A00186 | for immunological assays |
| SOC medium | CORNING | 46-003-CR | for transformation |
| PCR master mix solution | QIAGEN | 201445 | for PCR |
| Animal lancet (point length at 5 mm) | MEDIpoint | for mice bleeding | |
| Biophotometer | Eppendorf | for virus physical titer titration |
References
- Cheng, S. M., et al. Coexpression of the simian immunodeficiency virus Env and Rev proteins by a recombinant human adenovirus host range mutant. Journal of virology. 66, 6721-6727 (1992).
- Matthews, Q. L., et al. HIV antigen incorporation within adenovirus hexon hypervariable 2 for a novel HIV vaccine approach. PloS one. 5, e11815 (2010).
- DeMatteo, R. P., et al. Long-lasting adenovirus transgene expression in mice through neonatal intrathymic tolerance induction without the use of immunosuppression. Journal of virology. 71, 5330-5335 (1997).
- Gu, L., et al. A recombinant adenovirus-based vector elicits a specific humoral immune response against the V3 loop of HIV-1 gp120 in mice through the 'Antigen Capsid-Incorporation' strategy. Virology journal. 11, 112 (2014).
- Matthews, Q. L., Krendelchtchikov, A. L. G., Li, Z. C. Viral Vectors for Vaccine Development. INTECH. , (2013).
- Tang, D. C., Zhang, J., Toro, H., Shi, Z., Van Kampen, K. R. Adenovirus as a carrier for the development of influenza virus-free avian influenza vaccines. Expert review of vaccines. 8, 469-481 (2009).
- Flatt, J. W., Kim, R., Smith, J. G., Nemerow, G. R., Stewart, P. L. An intrinsically disordered region of the adenovirus capsid is implicated in neutralization by human alpha defensin 5. PloS one. 8, e61571 (2013).
- Bradley, R. R., Lynch, D. M., Iampietro, M. J., Borducchi, E. N., Barouch, D. H. Adenovirus serotype 5 neutralizing antibodies target both hexon and fiber following vaccination and natural infection. Journal of virology. 86, 625-629 (2012).
- Zaiss, A. K., Machado, H. B., Herschman, H. R. The influence of innate and pre-existing immunity on adenovirus therapy. Journal of cellular biochemistry. 108, 778-790 (2009).
- Sumida, S. M., et al. Neutralizing antibodies and CD8+ T lymphocytes both contribute to immunity to adenovirus serotype 5 vaccine vectors. Journal of virology. 78, 2666-2673 (2004).
- Sumida, S. M., et al. Neutralizing antibodies to adenovirus serotype 5 vaccine vectors are directed primarily against the adenovirus hexon protein. Journal of immunology. 174, 7179-7185 (2005).
- Bradley, R. R., et al. Adenovirus serotype 5-specific neutralizing antibodies target multiple hexon hypervariable regions. Journal of virology. 86, 1267-1272 (2012).
- Gahery-Segard, H., et al. Immune response to recombinant capsid proteins of adenovirus in humans: antifiber and anti-penton base antibodies have a synergistic effect on neutralizing activity. Journal of virology. 72, 2388-2397 (1998).
- Gu, L., et al. Using multivalent adenoviral vectors for HIV vaccination. PloS one. 8, e60347 (2013).
- Tian, X., et al. Protection against enterovirus 71 with neutralizing epitope incorporation within adenovirus type 3 hexon. PloS one. 7, e41381 (2012).
- Wu, H., et al. Construction and characterization of adenovirus serotype 5 packaged by serotype 3 hexon. Journal of virology. 76, 12775-12782 (2002).
- Wu, H., et al. Identification of sites in adenovirus hexon for foreign peptide incorporation. Journal of virology. 79, 3382-3390 (2005).
- Qiu, H., et al. Serotype-specific neutralizing antibody epitopes of human adenovirus type 3 (HAdV-3) and HAdV-7 reside in multiple hexon hypervariable regions. Journal of. 86, 7964-7975 (2012).
- Parker, C. E., et al. Fine definition of the epitope on the gp41 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 for the neutralizing monoclonal antibody 2F5. Journal of virology. 75, 10906-10911 (2001).
- Farrow, A. L., et al. Immunization with Hexon Modified Adenoviral Vectors Integrated with gp83 Epitope Provides Protection against Trypanosoma cruzi Infection. PLoS neglected tropical diseases. 8, e3089 (2014).
- Krause, A., et al. Epitopes expressed in different adenovirus capsid proteins induce different levels of epitope-specific immunity. Journal of virology. 80, 5523-5530 (2006).
- Omori, N., et al. Modification of a fiber protein in an adenovirus vector improves in vitro gene transfer efficiency to the mouse microglial cell line. Neuroscience letters. 324, 145-148 (2002).
- Dmitriev, I. P., Kashentseva, E. A., Curiel, D. T. Engineering of adenovirus vectors containing heterologous peptide sequences in the C terminus of capsid protein IX. Journal of virology. 76, 6893-6899 (2002).
- Xue, C., et al. Construction and characterization of a recombinant human adenovirus type 3 vector containing two foreign neutralizing epitopes in hexon. Virus research. 183, 67-74 (2014).
- Tian, X., et al. Construction and characterization of human adenovirus serotype 3 packaged by serotype 7 hexon. Virus research. 160, 214-220 (2011).
- Kim, J. W., et al. An adenovirus vector incorporating carbohydrate binding domains utilizes glycans for gene transfer. PloS one. 8, e55533 (2013).
- Vasconcelos, J. R., et al. Pathogen-induced proapoptotic phenotype and high CD95 (Fas) expression accompany a suboptimal CD8+ T-cell response: reversal by adenoviral vaccine. PLoS pathogens. 8, e1002699 (2012).
- Matthews, Q. L., et al. Genetic incorporation of a herpes simplex virus type 1 thymidine kinase and firefly luciferase fusion into the adenovirus protein IX for functional display on the virion. Molecular imaging. 5, 510-519 (2006).
