Summary
يتم وصف البروتوكولات لدراسة سرطان الثدي هجرة الخلايا وانتشارها والاستعمار في نسيج العظام نظام نموذجي يزدرع البشري.
Abstract
العظام هو الموقع الأكثر شيوعا لالانبثاث سرطان الثدي. على الرغم من أنه من المقبول على نطاق واسع أن سلوك الخلايا السرطانية المكروية التأثيرات، لا يعرف إلا القليل عن سرطان الثدي خصائص الخلية والسلوكيات داخل المكروية الأم من أنسجة العظام البشرية. لقد قمنا بتطوير المناهج لتتبع وقياس وتعدل خلايا سرطان الثدي البشرية داخل المكروية ل مثقف شظايا الأنسجة والعظام البشرية معزولة عن رؤساء الفخذ التخلص التالية إجمالي العمليات الجراحية لاستبدال مفصل الورك. باستخدام خلايا سرطان الثدي هندسيا لو luciferase تعزيز الخضراء بروتين فلوري (EGFP) التعبير، ونحن قادرون ل quantitate بتكاثر الهجرة وانتشار أنماط باستخدام التصوير تلألؤ بيولوجي (BLI)، والتفاعلات خلية المسار داخل شظايا العظام باستخدام المجهر مضان، وتقييم خلايا الثدي بعد الاستعمار مع التدفق الخلوي. المزايا الرئيسية لهذا النموذج ما يلي: 1) من مواليد، microe الأنسجة سليمة معمارياnvironment يتضمن أنواع الخلايا الإنسان ذات الصلة، و2) الوصول المباشر إلى المكروية، مما يسهل الكمية السريعة ومراقبة النوعية واضطراب الثدي والخلايا العظمية الخصائص والسلوكيات والتفاعلات. ومن القيود الأساسية، في الوقت الحاضر، هو قابلية محدودة من شظايا الأنسجة، والتي تحصر نافذة الدراسة إلى الثقافة على المدى القصير. وتشمل تطبيقات في النظام النموذجي دراسة البيولوجيا الأساسية للسرطان الثدي وغيرها من الأورام الخبيثة التي تسعى العظام داخل المتخصصة النقيلي، ووضع استراتيجيات علاجية فعالة لاستهداف خلايا سرطان الثدي في أنسجة العظام.
Introduction
ومن المعترف به على نطاق واسع المكروية الورم بأنه حاسم للسلوك الخلايا السرطانية خلال تطور سرطان الثدي النقيلي وتنتشر 1-3. والهدف من الطريقة المعروضة هنا هو تسهيل دراسة خلايا سرطان الثدي داخل المكروية من النسيج العظمي البشري، الموقع الأكثر شيوعا من سرطان الثدي ورم خبيث 4-6. وتتكون العظام من المقصورات المعادن ونخاع 7-9، وكلاهما تأوي الخلايا وعوامل يفرز المتورطين في تطور النقيلي 10،11. على الرغم من أن تستخدم على نطاق واسع في نماذج الماوس الجسم الحي تسهيل الدراسات المنهجية لعملية النقيلي 12-15، والتفاعلات خلية داخل الهيكل العظمي لا يمكن الوصول إليها بسهولة لمراقبة واضطراب المباشر. نظم نموذج لدراسة وزراعة الأنسجة الماوس العظام وخلايا نخاع الماوس توفر وصول أفضل، وقد أسفرت العديد من الأفكار بشأن الحديث المتبادل والآليات الكامنة وراء خلية سرطان الثدي مetastasis الهيكل العظمي الفئران 16-22. ومع ذلك، فقد أوضحت الدراسات أنه قد يكون هناك أنماط أنواع محددة من osteotropism للأنسجة العظام 23،24. هذه الأنماط يمكن أن تعكس أنواع محددة المتأصلة الاختلافات في خصائص النسيج العظمي، والاختلافات الناجمة عن تغير السكان نخاع العظم في المناعة ناقصة الفئران 11، و / أو سن مبكرة نسبيا من الفئران المستخدمة في التجارب، وكلها المحددات المحتملة للعظم المكروية.
في المختبر النهج لدراسة خلايا سرطان الثدي في الإنسان العظام المشترك الثقافات وركزت عادة على أنواع الخلايا العظمية محددة مثل بانيات المشتقة من نخاع أو خلايا انسجة مثقف كما الطبقات الوحيدة أو داخل النظم نموذج 3-الأبعاد المهندسة 25-35. على الرغم من أن نماذج ثقافة الخلية 2-الأبعاد وقد شكلت الدعامة الأساسية لفي المختبر النهج لأبحاث السرطان، منذ فترة طويلة تم الاعتراف بأن سلوك الخلية يتم تبديل جذري في مonolayer نظم الاستزراع 18،36،37. وقد أدى ذلك إلى تطوير microenvironments المهندسة التي تحاكي تعقيد الأنسجة الحية 3-الأبعاد، بما في ذلك المصفوفة والنماذج القائمة على سقالة مكونة من مواد طبيعية مثل الكولاجين، أو البوليمرات الاصطناعية المصنفة مع أنواع معينة من الخلايا لخلق microenvironments الأنسجة مثل 36-41. وشملت النهج المهندسة أيضا استخدام منصات مفاعل حيوي لمراقبة ودراسة الوسط الهرموني من المكروية 18،19،41-43. على الرغم من أن نماذج المحاكاة البيولوجية والمفاعلات الحيوية توفر العديد من عناصر المكروية الأنسجة المعقدة في الإعداد للرقابة، كما تم تطبيقها بنجاح للمضي قدما في دراسة الانبثاث سرطان الثدي إلى العظام 18،19،35،42،43، نظم نموذج هندسيا لا تتضمن عموما مجموعة كاملة من أنواع الخلايا ومكونات المصفوفة خارج الخلية الحالية ضمن بيئة العظام الأم.
حتى وقت قريب، وسرطان الثديلم تدرس الخلايا داخل، سليمة، المكروية 3-الأبعاد الأصلية للأنسجة العظام البشرية. نحن ذكرت مؤخرا تطوير نموذج التعاون الثقافة باستخدام شظايا الأنسجة والعظام البشرية معزولة عن استبدال مفصل الورك (THR) جراحة العينات 44. هذه العينات تؤوي كل من المقصورات المعادن ونخاع اللازمة لدراسة الآليات الكامنة الصغرى الانبثاث في الثقافة على المدى القصير. في الأعمال السابقة أنشأنا إثبات صحة المبدأ لاستخدام التصوير تلألؤ بيولوجي (BLI) لمراقبة انتشار خلايا سرطان الثدي، معربا عن luciferase المراسل (MDA-MB-231-fLuc) شارك في تربيتها مع شظايا العظام 44. هنا نقدم تفصيلا البروتوكولات التجريبية لدراسة انتشار خلايا الثدي السرطانية، والاستعمار، والهجرة في سياق المكروية الأم باستخدام إإكسبلنتس النسيج العظمي البشري.
لأول مرة نقدم بروتوكول للمشاركة في زراعة خلايا سرطان الثدي المجاورة لشظايا العظام لقياس الثديتكاثر الخلايا باستخدام BLI. في هذا القسم، والمصنف تعليق خلية الثدي كبقع خلية في 6 لوحات جيدا المجاورة لشظايا العظام، والتي يجمد بواسطة قطعة من الشمع العظام. آبار المراقبة تحتوي على الشمع العظام، ولكن لا شظية العظام. مرة واحدة نعلق البقع الخلية، ويضاف المتوسطة واللوحة هو مثقف لمدة 24 ساعة، وبعد ذلك كثافة إشارة للإضاءة الحيوية (المرتبطة عدد الخلايا) ويقاس مع BLI. في الخطوة التالية نقدم طرق لخلايا سرطان الثدي زراعة شارك المصنف مباشرة على شظايا العظام لدراسة الاستعمار والانتشار. هنا و pipetted تعليق خلية الثدي مباشرة على أجزاء النسيج العظمي، والتي يتم رصدها في الثقافة عن طريق BLI ومضان المجهر مع مرور الوقت لتتبع الاستعمار وعدد الخلايا. في هذه الطريقة، مقصورة نخاع يمكن مسح من شظايا العظام في أي لحظة من الوقت لتحليل خلايا سرطان الثدي مستعمرة من قبل التدفق الخلوي، أو المقايسات الجدوى نخاع.
وبالإضافة إلى ذلك، فإننا ديالكاتب نهجين مختلفين لقياس سرطان الثدي خلية الهجرة. في الطريقة الأولى وترد خطوات لقياس الهجرة نحو supernatants زراعة الأنسجة العظمية. في هذا البروتوكول هي المصنفة في خلايا سرطان الثدي على الداخلية، والسطوح العليا من Transwell إدراج الأغشية مع 8 ميكرون حجم المسام (كما هو موضح في الشكل 1A). ثم يتم وضعها على إدراج في لوحة المتلقي مع الآبار التي تحتوي على طاف النسيج العظمي أو السيطرة المتوسطة. وعلى مدار فترة حضانة 20 ساعة، أعداد صغيرة من خلايا سرطان الثدي تهاجر من خلال الأغشية إدراج أسفل إلى أقل الآبار زراعة الأنسجة حيث يعلقونها للكشف من قبل BLI. في طريقة الهجرة الثانية هي المصنفة في خلايا سرطان الثدي على الدنيا، الأسطح الخارجية للTranswell الأغشية إدراج. توضع شظايا النسيج العظمي في أكواب إدراج وخلايا سرطان الثدي تهاجر من خلال الأغشية لاستعمار شظايا العظام (كما هو موضح في الشكل 1B)، والتيثم يتم تصويرها باستخدام BLI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم جمع رؤساء الفخذ من المرضى الذين يخضعون لجراحة THR الاختيارية في قسم جراحة العظام في كلية الطب بجامعة ستانفورد. تم جمع جميع الأنسجة كما العينات التي تم تحديدها دي وفقا للوائح مكتب الالتزام بحوث جامعة ستانفورد.
1. اختيار الخط سرطان الثدي خلية (ق)
- الحصول على أو بالنقل خط خلايا سرطان الثدي المطلوب (ق) مع luciferase المراسل-GFP مراسل بناء. وأجريت التجارب التالية باستخدام MDA-MB-231 وMCF-7 سرطان الثدي خطوط الخلايا المهندسة للتعبير مستقر من يراعة luciferase (fLuc) وتعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) من خلال ترنسفكأيشن مع الجمال النائم ينقول بلازميد pKT2 / LuBiG وPK ترانسبوزاز بلازميد / hUbiC-SB11 45،46.
ملاحظة: يتم أشار خطوط الخلايا transfected باسم MDA-MB-231-fLuc-EGFP، وMCF-7-fLuc-EGFP.
2. عزل الأنسجة Fragments من رؤساء الفخذ
- بعد الجراحة THR، وجمع رأس الفخذ التخلص منها في حاوية معقمة مليئة المالحة الفسيولوجية. نقل العينة إلى المختبر ومعالجته ضمن 1-3 ساعة من الجراحة. ملاحظة: إذا كان هناك تأخير في المعالجة، ووضع العينة في 4 درجات مئوية.
- إعداد منطقة العمل عن طريق وضع العناصر التالية على حصيرة ماصة في تدفق الصفحي غطاء نسيج الثقافة: قفازات معقمة، مقراض جراحي، ملقط، دورق مع 70٪ الأيزوبروبانول لشطف الأدوات، والسفن زراعة الأنسجة كما هو منصوص عليه أدناه لكل نوع من التجربة .
- يرتدي القفازات الجراحية المعقمة لعقد رئيس عظم الفخذ المستديرة في يد واحدة، استخدم مقراض في جهة أخرى لاستخراج شظايا العظام التربيقية من الحجم المطلوب (~ 2-5 ملم) من رمح العلوي المكشوفة من عظم الفخذ. نقل شظايا العظام في سفينة الثقافة (على سبيل المثال، 6-، 12-، أو 24 بئرا لوحة زراعة الأنسجة أو غرفة الهجرة)، وهذا يتوقف على نوع من الانتشار النووي، العقيدonization أو الهجرة التجربة، كما هو موضح في الخطوات من 3 أو 4 أو 5.
ملاحظة: شظايا العظام الأنسجة يجب أن تحصد كما هو موضح أعلاه بعد إكمال الخطوات الأولية لكل انتشار والاستعمار أو الهجرة فحص معين. سوف شظايا تتراوح في حجمها كما هو مبين في الشكل (2). شظايا يمكن أن يكون وزنه قبل أو بعد عدة تجارب لغرض توحيد.
3. زراعة المشارك خلايا سرطان الثدي المجاورة لشظايا العظام لقياس الثدي انتشار الخلية باستخدام BLI
- قبل التجربة، وإعداد تعليق يحتوي على 2 × 10 5 خلايا سرطان الثدي / 50 ميكرولتر، وإعداد شمعات من الشمع العظام لشل حركة شظايا العظام في الثقافة. قطع رأس P200 micropipette في 3 قطع واستخدام نهاية الضيقة من أكبر قطعة في "قطع الكعكة" بطريقة لقطع صغيرة (~ 35 ملغ) قطعة من الشمع العظام. استخدام نهاية واسعة من أصغر قطعة لإخراج المقابس الشمع العظام في طبق بتريللتخزين.
- ضع قطعة من الشمع العظام في موقف 12:00 من كل بئر واضغط بلطف إلى أسفل مع السبابة معقم-القفاز.
- ماصة 50 ميكرولتر من تعليق خلية تحتوي على 1 × 10 5 خلايا سرطان الثدي في DMEM 10٪ FBS + القلم بكتيريا في وسط كل بئر من لوحة 6 جيدا. (بدلا من ذلك، وخلايا البذور في نمط فرقت اذا شئت.) وضع لوحة في 37 درجة مئوية نسيج الثقافة الحاضنة لمدة 45 دقيقة إلى تعزيز مرفق الخلية.
- وضع جزء 1 العظام على 1 قطعة من الشمع العظام لكل بئر تجريبي وتطبيق ضغط لطيف مع مقراض لضمان الحصول عليها. إجراء تجارب في ثلاث نسخ توضع مثل أن 3 شظايا العظام من عينة THR نظرا الى أعلى ثلاثة آبار، في حين أن ثلاثة آبار السفلية تحتوي على الشمع العظام فقط والضوابط.
- باستخدام ماصة 5 مل، برفق وببطء تقديم 5 مل من DMEM 10٪ FBS إلى جانب كل بئر لتجنب طرد الخلايا الثدي أو شظايا العظام. وضع لوحة في 3776، C الأنسجة ثقافة حاضنة لل20-24 ساعة.
- لأداء التصوير تلألؤ بيولوجي (BLI) إزالة لوحة من الحاضنة وإضافة الركيزة luciferin (لتحقيق تركيز من 300 ميكروغرام / مل) إلى كل بئر. صورة لوحة فورا على منصة التصوير IVIS باستخدام المعلمات التالية: F توقف 1، binning صغير، وقت التعرض لل 1 ثانية، ومستوى D. قياس كثافة إشارة من كل جانب متوسط الاشعاع (الفوتونات / ثانية / سنتيمتر مربع / ستيراديان).
- استخدام برامج التصوير لتحديد المناطق ذات الاهتمام (ROI) ل quantitate متوسط الاشعاع لجميع الآبار التجريبية والضابطة. تصدير متوسط قيم الاشعاع لورقة اكسل لأداء الإحصاءات وتوليد الرسوم البيانية.
4. زراعة المشارك خلايا سرطان الثدي المصنف مباشرة على شظايا العظام لدراسة الاستعمار وعدد الخلايا
- استخدام ملقط لوضع شظايا العظام مباشرة في الآبار الفارغة ل24-جيدا لوحة زراعة الأنسجة (1 جزء / جيد).
- بذرةETTE 50 ميكرولتر تعليق الخلية قطرة من DMEM 10٪ FBS تحتوي على 1 X 03-06 أكتوبر خلايا سرطان الثدي مباشرة على رأس كل منهما جزء العظام. وضع لوحة في 37 درجة الأنسجة C ثقافة حاضنة لمدة 45 دقيقة إلى تعزيز مرفق الخلية. إضافة بلطف 1-2 مل DMEM 10٪ FBS إلى جانب كل هذا جيدا أن شظية وغمرت تماما في المتوسط. احتضان لوحة في 37 ° C الأنسجة ثقافة حاضنة لل20-24 ساعة.
- بعد الحضانة، واستخدام ملقط لنقل كل جزء أنسجة العظام لوحة 24-جيدا الطازجة التي تحتوي على 1 مل DMEM 10٪ FBS في كل بئر. لأداء BLI، اتبع الخطوات 3،6-3،7 أعلاه. بالإضافة إلى ذلك، يمكن اعتبار أجزاء باستخدام مجهر مضان، أو مسح للحصول على السكان نخاع لتحليل أرقام خلايا سرطان الثدي والممتلكات كما هو موضح في الخطوة 6.
- لإعداد شظايا سليمة للتقييم النوعي بواسطة المجهر مضان التالية BLI، ماصة 5 ميكرولتر من الفلورسنت حل وضع العلامات البايفوسفونيت (ما قبلقلص وفقا لتعليمات الشركة الصانعة) في كل بئر لتسمية شويكات المعدنية من شظايا العظام. احتضان لوحة في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 24 ساعة أخرى.
- وبعد 24 ساعة من الثقافة في الفلورسنت حل وضع العلامات البايفوسفونيت، واستخدام ملقط لنقل شظايا لوحات زراعة الأنسجة التي تحتوي على الفينول الحمراء الخالية المتوسطة وعرض باستخدام مجهر مضان تكوينها لGFP صورة (485 نانومتر) والتسمية البايفوسفونيت (680 نانومتر).
5. قياس الهجرة من خلايا سرطان الثدي إلى أجزاء الأنسجة والعظام ومثقف العظام جزء Supernatants
- الهجرة نحو أنسجة العظام الثقافة طاف.
ملاحظة: إجراء تجارب في ثلاث نسخ بحيث 3 شظايا من عينة THR معين وتستخدم لتوليد 3 supernatants. لكل تجربة، تتم مقارنة الهجرة عبر ثلاث آبار تحتوي على supernatants العظام مقابل ثلاثة آبار تحتوي على السيطرة المتوسطة فقط.- توليد تيس العظاممقاضاة supernatants من خلال وضع شظايا العظام في آبار من لوحة 12-جيدا تحتوي على 2.2 مل DMEM 10٪ FBS لكل بئر. الثقافة في 37 ° C الأنسجة ثقافة حاضنة لمدة 24 ساعة. سحب متوسطة على مدار 24 ساعة واستبدالها مع 2.2 مل الطازجة٪ FBS DMEM-10. آبار المراقبة علاج تحتوي على DMEM 10٪ FBS بنفس الطريقة.
ملاحظة: يتم تغيير المتوسطة في 24 ساعة لإزالة العوامل يفرز استجابة لصدمة الأنسجة الناتجة من عملية جراحية. لأنه يتم إنشاؤها supernatants النسيج العظمي في FBS تحتوي المتوسطة والآبار التي تحتوي على FBS التي تحتوي على المتوسطة مدرجة فقط للسيطرة على مساهمات FBS للهجرة خلايا سرطان الثدي. - في 48 ساعة، وجمع 0.9 مل من كل طاف / تحكم المتوسطة وماصة في آبار من لوحة الاستقبال. سيتم لاحقا وضع تدرج في هذه الآبار. احتضان لوحة الاستقبال في الثقافة حاضنة الأنسجة في حين بذر تدرج. ملاحظة: طاف المتبقية (~ 1 مل بعد التبخر) يمكن جمعها لتحليل الواقع secretomeالتمرير إذا رغب 44.
- البذور يدرج Transwell، ووضعها في معيار، فارغة 24-جيدا لوحة زراعة الأنسجة. ماصة 350 ميكرولتر تعليق الخلية التي تحتوي على 1 × 10 5 خلايا سرطان الثدي في DMEM 10٪ FBS على العلوي، داخل سطح غشاء من كل إدراج كما هو مبين في الشكل 1A. وضع لوحة 24-جيدا تحتوي على إدراج المصنفة في 37 ° C زراعة الأنسجة حاضنة لمدة 45 دقيقة من أجل تعزيز المرفق.
- مرة واحدة وقد أرفقت الخلايا إلى إدراج، واستخدام ملقط لنقل إدراج لوحة المتلقي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. زاوية كل إدراج عندما وضعها في جهاز الاستقبال جيدا لمنع تشكيل فقاعة بين الغشاء إدراج والمتلقي طاف جيدا. احتضان لوحة الاستقبال مع تدرج لمدة 20 ساعة في 37 ° C الأنسجة الثقافة الحاضنة.
ملاحظة: تحقق الجانب السفلي من لوحة المتلقي لفقاعات بين الغشاء إدراج والمتلقي supernatan جيدار. إذا فقاعات واضحة، وإزالة إدراج محددة ووضعها مرة أخرى إلى المتلقي بشكل جيد حتى موجودة جود فقاعات. - بعد 20 ملقط استخدام ساعة لإزالة إدراج من لوحة الاستقبال. باستخدام الإجراءات في الخطوات 3،6-3،7 أداء BLI لصورة الخلايا التي هاجروا إلى وتعلق على الجزء السفلي من الآبار لوحة الاستقبال.
- توليد تيس العظاممقاضاة supernatants من خلال وضع شظايا العظام في آبار من لوحة 12-جيدا تحتوي على 2.2 مل DMEM 10٪ FBS لكل بئر. الثقافة في 37 ° C الأنسجة ثقافة حاضنة لمدة 24 ساعة. سحب متوسطة على مدار 24 ساعة واستبدالها مع 2.2 مل الطازجة٪ FBS DMEM-10. آبار المراقبة علاج تحتوي على DMEM 10٪ FBS بنفس الطريقة.
- الهجرة نحو شظايا النسيج العظمي.
توضع إجراء تجارب في ثلاث نسخ بحيث 3 شظايا من عينة THR بالنظر إلى 3 إدراج منفصلة، وتوضع 3 الخرز الزجاجي إلى 3 إدراج منفصلة الضوابط: ملاحظة.- إعداد لوحة الاستقبال من قبل pipetting 0.9 مل DMEM 10٪ FBS في كل بئر. وضعه في الثقافة حاضنة الأنسجة أثناء إعداد تدرج.
- إلى البذور وإدراج، عكس لهم على سطح microfuge أنبوب مربع من البلاستيك يحتوي على غطاء. ماصة 50 ميكرولتر تعليق الخلية قطرة من DMEM 10٪ FBS تحتوي على 1 × 10 5 خلايا سرطان الثدي دirectly على، السطح السفلي الخارجي من كل غشاء إدراج (والذي هو مواجهة على إدراج المقلوب). تغطية مربع microfuge أنبوب مع غطاء تصدع مفتوحة وتحويلها إلى 37 درجة مئوية الحاضنة الأنسجة لمدة 45 دقيقة إلى تعزيز مرفق الخلية.
- نقل مربع microfuge أنبوب إلى نسيج الثقافة هود، واستخدام ملقط لتحويل إدراج المصنفة الجانب الأيمن حتى ونقلها إلى الآبار من لوحة الاستقبال. ماصة 0.450 مل DMEM 10٪ FBS في كل كوب إدراج. باستخدام ملقط، ونقل جزء واحد أنسجة العظام (~ 3 ملم) في كل كوب إدراج استعداد. اختياريا، واستخدام الخرز الزجاجي ضوابط السلبية كما في آبار إضافية. وضع لوحة في ثقافة حاضنة الأنسجة لمدة 20 ساعة.
- لقياس الهجرة، وإعداد 24-جيدا القياسية لوحة زراعة الأنسجة التي تحتوي على 1 مل DMEM 10٪ FBS لكل بئر. إزالة لوحة الاستقبال من الحاضنة واستخدام ملقط لنقل شظايا العظام وحبات من كل إدراج في آبار منفصلة من لوحة القياسية. إضافة وسيفيرينالركيزة (لتحقيق تركيز النهائي من 300 ميكروغرام / مل) إلى كل بئر وتنفيذ BLI باستخدام الإجراءات في الخطوات 3،6-3،7.
6. قبل وبعد التجريبية تحليلات إضافية
- تحليل نخاع مسح.
- نقل جزء العظام في مصفاة الخلية 70 ميكرومتر وضعها في أعلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. استخدام حقنة 10 مل مع إبرة 25 G لطرد بقوة جزء مع 10 مل من برنامج تلفزيوني للحصول على تعليق من خلايا نخاع في أنبوب مخروطي الشكل. الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 3 دقائق في 300 x ج و 21 درجة مئوية، ونضح وطاف resuspend الخلايا مكعبات في برنامج تلفزيوني أو حل آخر المطلوبة للالتدفق الخلوي.
ملاحظة: تختلف أحجام إعادة تعليق اعتمادا على حجم بيليه الخلية بعد الطرد المركزي، والتطبيق. - لفحوصات قابلية ~ 75-300 حجم ميكرولتر من PBS مناسبة، ويمكن تحليلها باستخدام هذه المعلقات fluorescenc المتاحة تجارياالبريد المقايسات الحيوية مقرها وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، pipetted في عدادة الكريات التقليدية، وتحسب باستخدام مجهر مضان مقلوب.
- لتحليل تدفق cytometric أو الفرز على أساس الكشف عن خلايا سرطان الثدي GFP إيجابية، resuspend الكرية خلية في 1 مل PBS تحتوي على 2٪ FBS، 2mm و EDTA، و 10 ملي HEPES مثل أن تركيز هو 1 × 10 6 خلية / مل.
- نقل جزء العظام في مصفاة الخلية 70 ميكرومتر وضعها في أعلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. استخدام حقنة 10 مل مع إبرة 25 G لطرد بقوة جزء مع 10 مل من برنامج تلفزيوني للحصول على تعليق من خلايا نخاع في أنبوب مخروطي الشكل. الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 3 دقائق في 300 x ج و 21 درجة مئوية، ونضح وطاف resuspend الخلايا مكعبات في برنامج تلفزيوني أو حل آخر المطلوبة للالتدفق الخلوي.
- H & E تلطيخ والمناعية.
- لمعالجة شظايا لالهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ و / أو المناعية، ضع شظايا في أشرطة بلاستيكية المسمى مع قلم رصاص رقم 2، ويغرق في حاوية مليئة 10٪ من الفورمالين مخزنة لمدة 24 ساعة.
- الأنسجة عملية البارافين التضمين، باجتزاء وتلطيخ باستخدام بروتوكولات الروتينية التي تشمل خطوة زوال الكلس لحساب شويكات المعدنية داخل كل جزء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عزل شظايا الأنسجة من رؤساء الفخذ
تم جمع رؤساء الفخذ من أعداد متساوية من الذكور والإناث من المرضى (44-90 عاما) يخضع الاختيارية مجموع جراحة استبدال مفصل الورك في قسم جراحة العظام في كلية الطب بجامعة ستانفورد. يحتوي كل رأس الفخذ التخلص منها جزء صغير من عظم الفخذ العلوي، الذي يؤوي أنسجة العظام التربيقية تتألف من شويكات المعادن ونخاع. هذا النسيج يمكن الوصول إليها من خلال المقطع العرضي يتعرض جراحيا من رمح (الشكل 2A) باستخدام مقراض الجراحية لاستخراج شظايا صغيرة. يتم إظهار الأنسجة من القطع المستخرجة في الشكل 2B، وكشف عن المكونات المعدنية ونخاع. ظهور القطع المستخرجة يختلف عبر رؤساء الفخذ تم الحصول عليها من مختلف المرضى، بدءا من الأصفر إلى الأحمر، وهذا يتوقف على محتوى خلية شحمية من نخاع كما هو مبين في الشكل 2C. Wالبريد شرح استخدام هذه الشظايا النسيج العظمي في المقايسات قصيرة المدى لقياس التفاعلات الدينامية مع خلايا سرطان الثدي هندسيا لو luciferase EGFP التعبير.
-زراعة شارك خلايا سرطان الثدي المتاخمة لشظايا العظام لقياس الثدي تكاثر الخلايا باستخدام ضوء بارد التصوير
يظهر الإعداد لوحة الثقافة ل-زراعة شارك MDA-MB-231-fLuc-EGFP خلايا سرطان الثدي المجاورة لشظايا العظام يجمد لقياس انتشار خلايا الثدي باستخدام BLI في الشكل 3A. ويتضح من BLI لوحة في 24 ساعة في الشكل 3B، وإشارة BLI من 3 تجارب، مما يدل على تعزيز انتشار الخلايا في وجود مقابل ويظهر عدم وجود شظايا العظام في الشكل 3C.
-زراعة شارك خلايا سرطان الثدي المصنف مباشرة على شظايا العظام لدراسة الاستعمار وعدد الخلايا
استعمار MCF-7-fLuc-EGFP جells المصنفة مباشرة على أجزاء النسيج العظمي التي تقاس عن طريق BLI في 24 ساعة هو موضح في الشكل 4A، مما يدل على انخفاض إشارة المرتبطة انخفاض كثافة البذر. ويرد جزء المصنف مباشرة في 48 ساعة في الشكل 4B، بعد وصفها مع الفلورسنت biphosophonate الكاشف، كما التقط بواسطة المجهر مضان للكشف عن استعمار خلايا سرطان الثدي داخل مقصورات المعادن ونخاع. وكشفت هذه الأنماط الاستعمار أيضا في أجزاء المصنفة مباشرة معالجتها بعد تجريبيا لتلطيخ المناعى مع cytokeratin الأجسام المضادة (أرقام 4C و 4D).
قياس الهجرة من خلايا سرطان الثدي إلى أجزاء الأنسجة والعظام ومثقف العظام جزء Supernatants
تم الكشف عن هجرة الخلايا MDA-231-fLuc-EGFP عبر أغشية مسامية الهجرة نحو supernatants زراعة الأنسجة العظام وإلى شظايا العظام مع BLI كما هو مبين في الشكل 5. ويرد نمط الهجرة قوي نحو supernatants الثقافة المستمدة من ثلاثة أجزاء من THR العينة الواردة في الشكل 5A، الذي يصور زيادة الهجرة إلى الآبار التي تحتوي على العظام الأنسجة طاف مقابل السيطرة المتوسطة. وإن لم يكن كل أنماط الهجرة هي هذه قوية، والهجرة نحو supernatants العظام هي أكبر عادة من نحو السيطرة المتوسطة في معظم التجارب. ويرد نمط الهجرة نموذجية إلى شظايا العظام من THR عينة معينة في الشكل 5B.
تحليل مسح كوسا
وبالإضافة إلى ذلك، نحن لتوضيح أن خلايا نخاع يمكن مسح من شظايا المستعمر، ويمكن الكشف عن أن الخلايا السرطانية مسح الثدي بين هذه الخلايا عن طريق التدفق الخلوي (الشكل 6B)، BLI (الشكل 6C)، و / أو مضان المجهر (الشكل 6D) .
قياس الجدوى
الشكل 1: إعداد التجارب الهجرة. (A) في تجارب "الهجرة إلى الأمام"، تمتلئ الآبار لوحة المتلقي مع ولدت سابقا supernatants زراعة الأنسجة العظمية. خلايا سرطان الثدي التي يتم المصنفة على الداخلية، والسطوح العليا من الأغشية Transwell في أكواب إدراج تحتوي على بورصة دبي للطاقة 10٪ FBS تهاجر من خلال الأغشية ونعلق على الجزء السفلي من الآبار للكشف من قبل BLI. 
الشكل 2: عزل شظايا الأنسجة من رؤساء الفخذ. (A) استخراج شظايا العظام تربيقي باستخدام مقراض الجراحي. (B) الأنسجة من جزء ثابت مباشرة بعد الاستخراج من الأنسجة عظم الفخذ تظهر المتمعدنة (السهم الأبيض) ونخاع (السهم الأسود) المقصورات. شظايا العظام (C) تربيقية المستخرجة من اثنين مختلفة رؤساء الفخذ مما يدل على التباين في مقابل الأحمر المحتوى النخاع الأصفر. 
الشكل (3):-زراعة المشارك خلايا سرطان الثدي المجاورة لشظايا العظام لقياس انتشار خلايا الثدي باستخدام التصوير تلألؤ بيولوجي. (A) الثقافة الإعداد لوحة ل-زراعة شارك MDA-MB-231-fLuc-EGFP خلايا سرطان الثدي المجاورة لشظايا العظام يجمد، كما يتبين من السهام: بقع الخلية (الأزرق)، والشمع العظام (أسود)، وتفتيت العظام (أحمر ). وأشار إلى موقف الشمع العظام أيضا من قبل دائرة المنقطة السوداء. يتم عرض لوحة قبل إضافة متوسطة. أعلى 3 آبار تحتوي على شظايا العظام المربوطة إلى الشمع العظام وثلاثة آبار السفلي يحتوي على شمع العظام فقط. (B) BLI من لوحة في 24 ساعة. (C) الكميات من إشارات BLI لخلايا MDA-MB-231-fLuc-EGFP تزايد في وجود (الحانات البنفسجية) مقابل غياب (القضبان الخضراء) من شظايا من ثلاثة THR العينات مثقف كما هو موضح. لكل عينة THR والحانات وتمثل القيم BLI متوسط قياس عبر 3 التي تحتوي على جزء - 3 آبار مراقبة مقابل. هذه النتيجة تبين مستويات أعلى من الانتشار النووي في وجود مقابل غياب شظايا العظام. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري (P <0.01). مستنسخة بإذن 44. 
الشكل 4: الكشف عن خلايا سرطان الثدي المصنف مباشرة على شظايا العظام. (A) استعمار خلايا MCF-7-fLuc-EGFP المصنف مباشرة على أجزاء النسيج العظمي كما الكشف عنها بواسطة BLI في 24 ساعة، والتي تبين انخفاض إشارة المرتبطة انخفاض كثافة البذر. (B) جزء المصنف مباشرة في 48 ساعة بعد البذر، و وضع العلامات مشاركة 24 ساعة مع الفلورسنت biphosophonate كاشف. مضان المجهري يكشف EGFP + سرطان الثدي الخلايا كماsociated مع الشوكة المعدنية (السهم الأخضر)، ومع الخلايا الدهنية في المقصورة نخاع (السهام البيضاء). وكشفت هذه الأنماط الاستعمار أيضا في أجزاء المصنفة مباشرة المجهزة للتلطيخ المناعى مع عموم cytokeratin الأجسام المضادة AE1 / AE3 التالية 72 ساعة من شارك في ثقافة (C) و (D). في (C) خلايا سرطان الثدي-cytokeratin إيجابي، الرمز بواسطة السهام، ويلاحظ المتاخمة لالخلايا الشحمية في المقصورة نخاع. في لوحظ المرفقة (D) خلية سرطان الثدي cytokeratin إيجابي إلى الشوكة المعدنية. (C) و (D) مستنسخة بإذن 44. 
الشكل 5: قياس الهجرة من خلايا سرطان الثدي إلى أجزاء الأنسجة والعظام ومثقف supernatants جزء العظام هجرة MDA-MB-231خلايا -fLuc-EGFP عبر أغشية مسامية الهجرة نحو supernatants زراعة الأنسجة العظام وإلى شظايا العظام والكشف على مدار 24 ساعة مع BLI. (A) إشارة BLI الكاشفة تعزيز الهجرة نحو supernatants ثقافة مستمدة من THR نظرا العينة مقابل السيطرة المتوسطة. (B ) إشارة BLI مما يدل على نمط الهجرة من خلايا سرطان الثدي إلى 3 شظايا العظام من واحدة عينة THR. يتم الرمز شظايا العظام من قبل دوائر بيضاء منقطة. وترد آبار المراقبة التي تحتوي على الخرز الزجاجي في القاع. 
الشكل (6):. الكشف عن الخلايا MDA-MB-231fLUC-EGFP في الكوسا مسح من شظايا المستعمر (A) شظايا دون (يسار) ومع (يمين) استعمرت خلايا سرطان الثدي، والكشف عنها من قبل BLI (ب) تحليل الكوسا مسح من شظايا (A) التي كتبها fالخلوي منخفضة. تم الكشف عن خلايا سرطان الثدي EGFP إيجابية في نخاع مسح من جزء BLI إيجابية، ولكن ليس جزء BLI سلبية. (C) BLI الكشف عن سرطان الثدي مستعمرات الخلايا الناتجة عن ثقافة نخاع مسح جزء من BLI إيجابية. (D) الإسفار المجهري للمقصورة نخاع مسح من شظية-BLI إيجابي، والتي تبين الخلايا MDA-MB-231fLUC-EFGP في مجال خلايا نخاع. 
عينات قياس الجدوى Viabilities لخلايا نخاع مسح من شظايا الأنسجة المعزولة من 4 THR مباشرة بعد جمع وفي 24، 48، 72 ساعة، و 6 أيام الثقافة في DMEM 10٪ FBS: الرقم 7. تم تغيير المتوسطة في 24 و 72 ساعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ميهرا وآخرون. وقد سبق وصفها جمع بعد الوفاة وتحليل عينات العظام من مرضى سرطان البروستاتا النقيلي حصادها في وقت تشريح الجثة، وكشف عن الأنسجة عالية الجودة والتحقق من صحة استخدام عينات العظام البشرية لدراسة عملية النقيلي 47. هنا وصفناها بروتوكولات لجمع ومعالجة واستخدام شظايا الأنسجة والعظام البشرية التي تم الحصول عليها من رؤساء الفخذ التخلص منها بعد الجراحة THR في نظام التعاون ثقافة على المدى القصير لدراسة الهجرة الخلية الثدي والاستعمار وانتشار الأسلحة النووية. يتم تنفيذ ما يقرب من 300،000 جراحات استبدال مفصل الورك سنويا في الولايات المتحدة (الأكاديمية الأمريكية لجراحي العظام، Orthoinfo.aaos.org)، وعادة ما يتم تجاهل هذه العينات. واحدة من المؤشرات الأكثر شيوعا لهذه الجراحة هي هشاشة العظام من مفصل الورك، مما يؤدي إلى انهيار تدريجي للأسطح الغضروف الذي يغطي رأس الفخذ، مما يؤدي إلى آلام المفاصل. خلال مجموع replacem الوركجراحة الأنف والحنجرة تتم إزالة جزء صغير من عظم الفخذ العلوي جنبا إلى جنب مع رأس الفخذ. عظم الفخذ هو موقع شيوعا من سرطان الثدي ورم خبيث 48، وهذه العينات تحتوي على أنسجة العظام التربيقية، موقع النقيلي الاستعمار خلايا الثدي. معظم المرضى الذين خضعوا لاستبدال مفصل الورك و50-80 سنة، وهي الفئة العمرية التي أقواس سنوات ذروة الإصابة بسرطان الثدي. وهكذا، هذه الأنسجة تشكل مصدرا قيما لدراسة سرطان الثدي النقيلي العظام المتخصصة.
هناك العديد من الخطوات الهامة والاعتبارات المرتبطة بهذه التقنيات. أولا، ronguer الجراحية نوعية جيدة أمر ضروري لاستخراج شظايا العظام التربيقية صغيرة في حين الضغط على رأس الفخذ في متعاكسين، قفاز. سوف ملقط لا تعمل لأنها ليست قوي بما فيه الكفاية لاستخراج الأنسجة تربيقية تحتوي على شويكات المعدنية. وهناك اعتبار آخر مهم في هذه المقايسات ويتعلق بالمناولة خط خلايا الثدي والركض، particularly فيما يتعلق المقايسات الهجرة. مرور على المدى الطويل و / أو التباين في الإجراءات trypsinization يمكن أن يؤدي إلى اختيار متتابعة من أكثر السكان الخلية / أقل عنيد، ويحتمل تغيير الردود المهاجرة في التجارب. وتتعلق قضية أخرى إلى توحيد التجارب، نظرا لتنوع الأنسجة الجراحية التي تم الحصول عليها من المرضى من مختلف الأعمار والحالات المرضية. ولمعالجة ذلك، ونحن توظيف والتصميم التجريبي داخل الموضوع الذي يتم اختبار جميع المتغيرات في ثلاث نسخ (على سبيل المثال، عبر ثلاث شظايا / الآبار التجريبية مقابل ثلاثة آبار شظايا / السيطرة) باستخدام شظايا من عينة مريض معين الجراحية. ويمكن اختبار المتغيرات باستخدام هذا التصميم على العينات المأخوذة من المرضى متعددة، وتحليلها إحصائيا باستخدام اختبار T تقرن للبيانات بمعدل متوسط أعلى من مكررات، و / أو داخل المواضيع في اتجاه واحد ANOVA لالبيانات عبر مكررات. وأخيرا، وجود قيود الرئيسي لهذا الأسلوب هو نافذة قصيرة من viability خلال ثقافة يزدرع.
كشفت قياساتنا viabilities نخاع من ~ 90٪ في يوم جمع، وذلك تمشيا مع القياسات الحيوية تم الحصول عليها من شفاطات نخاع العظم 49. مع مرور الوقت، ومع ذلك، لاحظنا انخفاضا تدريجيا على مدى يومين وثلاثة، مع خسارة هائلة في جدوى بعد يوم 6. على الرغم من أننا لا تقاس قابلية المقصورة المعادن، وتشير الملاحظات النوعية أن هناك انخفاض مماثل في جدوى بانيات العظم وosteocytes بطانة، كما رأينا في الشكل 4D. وبناء على هذه التجارب، لدينا محدودة التجارب ثقافتنا للدراسات على المدى القصير أجرى أكثر من 48 أو 72 ساعة. وأشارت التجارب الأولية (غير مدرجة) أن قابلية يمكن تحسين استخدام وسائل الإعلام المتاحة تجاريا وضعت للحفاظ على خلايا نخاع. ومع ذلك فإننا لم يتميز السكان خلية نخاع في هذه التجارب، ولا أعرف إذا كانت نتائج أفضل جدوى من المختارةثمرة من بعض القطعان خلية نخاع. ووضع بروتوكولات للحفاظ على وتمديد بقاء هذه إإكسبلنتس تكون مهمة لدفع هذا النظام النموذجي.
على الرغم من أن هذا النموذج يقتصر على فترات زمنية قصيرة، مزاياه الرئيسية فيما يتعلق أساليب أخرى تشمل الميزات التالية: 1) الأنسجة 3 الابعاد سليمة إيواء أنواع الخلايا ذات الصلة التي تشكل المكروية العظام البشرية، و2) إمكانية الوصول إلى المكروية العظام لرصد والتفاعلات الدينامية مشوشة، 3) أعداد كبيرة من شظايا النموذج الواحد للتجارب تكرار، و4) منخفضة التكلفة مقارنة مع النماذج الحيوانية.
في حين وصفناها المقايسات لدراسة الثدي الانبثاث سرطان العظام، وهذه العينات والنهج يمكن بسهولة أن تمتد إلى دراسة أخرى الأورام الخبيثة العظام تسعى مثل سرطان البروستاتا، وكذلك أمراض العظام الأخرى. على الرغم من أننا قد استخدمت رؤساء الفخذ التخلص منها في المقام الأول باعتباره ذلكurce من شظايا الأنسجة، وتشكل هذه العينات أيضا مصدرا إضافيا للنخاع العظم البشري، والتي يتم جمعها عادة من خلال نخاع العظم من المتطوعين الشباب. وأخيرا، في حين وصفناها النهج باستخدام خطوط الخلايا المهندسة لتلألؤ بيولوجي ومضان، فإن معظم الإجراءات يمكن تعديلها للاستخدام مع الخلايا الأخرى إذا كانت هذه خطوط الخلايا و / أو منصات التصوير غير متوفرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذه الدراسات، في جزء منه، من المنح المقدمة من مؤسسة البديل بحوث والتنمية (107588)، والمعهد الوطني للصحة (1U54CA136465-04S1)، وبرنامج بحوث سرطان الثدي كاليفورنيا (201B-0141). نشكر الدكاترة. أندرو ويلبر وR. سكوت ماكيفور للتبرع السخي من هم
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (1X) + GlutaMAX-l | Life Technologies | 10569-010 | Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| McCoy's 5A Medium (1X) | Life Technologies | 16600-082 | Supplement all McCoy's with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillen Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Blastocidin (10 mgl/ml) | InvivoGen | ant-bl | Supplement media used for transfected cell lines. |
| Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size) | Corning Incorporated | 353097 | |
| Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate | Corning Incorporated | 353504 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells* | Invitrogen Detection Technologies | L-3224 | |
| FluoroBrite DMEM | Life Technologies | A18967-01 | |
| D-luciferin firefly, potassium salt 5 g (30 mg/ml) | Life Technologies | L-8220 | |
| Sterile Cell Strainer 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3516 | |
| 12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3513 | |
| 24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3526 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Bone wax | Surgical Specialties Corporation | 903 | |
| IVIS 50 Imaging Platform | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | ||
| Living Image Software Program | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | 133026 | |
| EVOS FL Imaging System | Life Technologies | Version 4.2 | |
| OsteoSense 680 EX | PerkinElmer | NEV10020EX | |
| MCF-7 breast cancer cells | ATCC | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | HTB-26 | |
| Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody | DAKO Cytomation | Clone (AE1/AE3) |
References
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13, 227 (2011).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
- Bissell, M. J., Radisky, D. Putting tumours in context. Nat Rev Cancer. 1, 46-54 (2001).
- Coleman, R. E., Rubens, R. D. The clinical course of bone metastases from breast cancer. British journal of cancer. 55, 61-66 (1987).
- Mundy, G. R. Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities. Nat Rev Cancer. 2, 584-593 (2002).
- Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
- Clarke, B. Normal bone anatomy and physiology. Clin J Am Soc Nephrol. 3, Suppl 3. S131-S139 (2008).
- Weatherholt, A. M., Fuchs, R. K., Warden, S. J. Specialized connective tissue: bone, the structural framework of the upper extremity. Journal of hand therapy : official journal of the American Society of Hand Therapists. 25, 123-131 (2012).
- Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicologic pathology. 34, 548-565 (2006).
- Casimiro, S., Guise, T. A., Chirgwin, J. The critical role of the bone microenvironment in cancer metastases. Molecular and cellular endocrinology. 310, 71-81 (2009).
- Patel, L. R., Camacho, D. F., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. Mechanisms of cancer cell metastasis to the bone: a multistep process. Future Oncol. 7, 1285-1297 (2011).
- Goldstein, R. H., Weinberg, R. A., Rosenblatt, M. Of mice and (wo)men: mouse models of breast cancer metastasis to bone. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 25, 431-436 (2010).
- Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochemical and biophysical research communications. 394, 443-447 (2010).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212 (2006).
- Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer metastasis reviews. 33, 721-735 (2014).
- Schiller, K. R., et al. Secretion of MCP-1 and other paracrine factors in a novel tumor-bone coculture model. BMC Cancer. 9, 45 (2009).
- Curtin, P., Youm, H., Salih, E. Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex-vivo co-cultures of live calvarial bones and cancer cells. Biomaterials. 33, 1065-1078 (2012).
- Krishnan, V., et al. Dynamic interaction between breast cancer cells and osteoblastic tissue: comparison of two- and three-dimensional cultures. Journal of cellular physiology. 226, 2150-2158 (2011).
- Krishnan, V., Vogler, E. A., Sosnoski, D. M., Mastro, A. M. In vitro mimics of bone remodeling and the vicious cycle of cancer in bone. Journal of cellular physiology. 229, 453-462 (2014).
- Bussard, K. M., Venzon, D. J., Mastro, A. M. Osteoblasts are a major source of inflammatory cytokines in the tumor microenvironment of bone metastatic breast cancer. Journal of cellular biochemistry. 111, 1138-1148 (2010).
- Sosnoski, D. M., Krishnan, V., Kraemer, W. J., Dunn-Lewis, C., Mastro, A. M. Changes in Cytokines of the Bone Microenvironment during Breast Cancer Metastasis. International journal of breast cancer. 2012, 160265 (2012).
- Bussard, K. M., et al. Localization of osteoblast inflammatory cytokines MCP-1 and VEGF to the matrix of the trabecula of the femur, a target area for metastatic breast cancer cell colonization. Clinical & experimental metastasis. 27, 331-340 (2010).
- Kuperwasser, C., et al. A mouse model of human breast cancer metastasis to human bone. Cancer research. 65, 6130-6138 (2005).
- Rosenblatt, M. A tale of mice and (wo)men: development of and insights from an 'all human' animal model of breast cancer metastasis to bone. Transactions of the American Clinical and Climatological Association. 123, 135-150 (2012).
- Oh, H. S., et al. Bone marrow stroma influences transforming growth factor-beta production in breast cancer cells to regulate c-myc activation of the preprotachykinin-I gene in breast cancer cells. Cancer research. 64, 6327-6336 (2004).
- Moharita, A. L., et al. SDF-1alpha regulation in breast cancer cells contacting bone marrow stroma is critical for normal hematopoiesis. Blood. 108, 3245-3252 (2006).
- Koro, K., et al. Interactions between breast cancer cells and bone marrow derived cells in vitro define a role for osteopontin in affecting breast cancer cell migration. Breast cancer research and treatment. 126, 73-83 (2011).
- Pohorelic, B., et al. Role of Src in breast cancer cell migration and invasion in a breast cell/bone-derived cell microenvironment. Breast cancer research and treatment. 133, 201-214 (2012).
- Nicola, M. H., et al. Breast cancer micrometastases: different interactions of carcinoma cells with normal and cancer patients' bone marrow stromata. Clinical & experimental metastasis. 20, 471-479 (2003).
- Korah, R., Boots, M., Wieder, R. Integrin alpha5beta1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer research. 64, 4514-4522 (2004).
- Martin, F. T., et al. Potential role of mesenchymal stem cells (MSCs) in the breast tumour microenvironment: stimulation of epithelial to mesenchymal transition (EMT). Breast cancer research and treatment. 124, 317-326 (2010).
- Kapoor, P., Suva, L. J., Welch, D. R., Donahue, H. J. Osteoprotegrin and the bone homing and colonization potential of breast cancer cells. Journal of cellular biochemistry. 103, 30-41 (2008).
- Chen, X., Lu, J., Ji, Y., Hong, A., Xie, Q. Cytokines in osteoblast-conditioned medium promote the migration of breast cancer cells. Tumour biology : the journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine. 35, 791-798 (2014).
- Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35, 2454-2461 (2014).
- Marlow, R., et al. A novel model of dormancy for bone metastatic breast cancer cells. Cancer research. 73, 6886-6899 (2013).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Hutmacher, D. W., et al. Can tissue engineering concepts advance tumor biology research. Trends in biotechnology. 28, 125-133 (2010).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature reviews. Molecular cell biology. 7, 211-224 (2006).
- Hutmacher, D. W. Biomaterials offer cancer research the third dimension. Nature. 9, 90-93 (2010).
- Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in cancer biology. 15, 365-377 (2005).
- Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology advances. 32, 1256-1268 (2014).
- Dhurjati, R., Krishnan, V., Shuman, L. A., Mastro, A. M., Vogler, E. A. Metastatic breast cancer cells colonize and degrade three-dimensional osteoblastic tissue in vitro. Clinical & experimental metastasis. 25, 741-752 (2008).
- Mastro, A. M., Vogler, E. A. A three-dimensional osteogenic tissue model for the study of metastatic tumor cell interactions with bone. Cancer research. 69, 4097-4100 (2009).
- Contag, C. H., et al. Monitoring dynamic interactions between breast cancer cells and human bone tissue in a co-culture model. Molecular imaging and biology : MIB : the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 16, 158-166 (2014).
- Multhaup, M., et al. Cytotoxicity associated with artemis overexpression after lentiviral vector-mediated gene transfer. Human gene therapy. 21, 865-875 (2010).
- Thorne, S. H., et al. CNOB/ChrR6, a new prodrug enzyme cancer chemotherapy. Mol Cancer Ther. 8, 333-341 (2009).
- Mehra, R., et al. Characterization of bone metastases from rapid autopsies of prostate cancer patients. Clin Cancer Res. 17, 3924-3932 (2011).
- Riccio, A. I., Wodajo, F. M., Malawer, M. Metastatic carcinoma of the long bones. Am Fam Physician. 76, 1489-1494 (2007).
- Ahmann, G. J., et al. Effect of tissue shipping on plasma cell isolation, viability, and RNA integrity in the context of a centralized good laboratory practice-certified tissue banking facility. Cancer epidemiology, biomarkers & prevention : a publication of the American Association for Cancer Research, cosponsored by the American Society of Preventive Oncology. 17, 666-673 (2008).
