Summary
Les protocoles sont décrits pour l'étude de la migration des cellules de cancer du sein, de la prolifération et de la colonisation dans un système de modèle d'expiant de tissu osseux humain.
Abstract
L'os est le site le plus courant de métastase de cancer du sein. Même se il est largement admis que le comportement cellulaire influences microenvironnement de cancer, on en sait peu sur les propriétés et comportements de cellules de cancer du sein dans le microenvironnement natif du tissu osseux humain. Nous avons développé des approches pour suivre, de quantifier et de moduler les cellules cancéreuses du sein humain dans le microenvironnement de fragments humains en culture de tissus osseux isolés à partir de têtes fémorales rebut suivants arthroplasties totales de la hanche. En utilisant des cellules de cancer du sein d'ingénierie pour la luciférase et améliorés protéine fluorescente (EGFP) expression vert, nous sommes en mesure de quantifier de façon reproductible les schémas de migration et de prolifération utilisant l'imagerie par bioluminescence (BLI), les interactions cellulaires de piste dans les fragments d'os en utilisant la microscopie de fluorescence, et d'évaluer les cellules mammaires après colonisation par cytométrie de flux. Les principaux avantages de ce modèle sont les suivants: 1) un MicroE de tissu natif, l'architecture intactenvironnement qui comprend les types pertinents de cellules humaines, et 2) l'accès direct à la micro, ce qui facilite quantitative rapide et suivi qualitatif et la perturbation du sein et de cellules osseuses propriétés, les comportements et interactions. Une limitation principale, à l'heure actuelle, la viabilité est finie de fragments de tissus, qui confine la fenêtre d'études de culture à court terme. Les applications du système de modèle comprennent l'étude de la biologie fondamentale du cancer du sein et d'autres tumeurs malignes ostéotropes l'intérieur de la niche métastatique, et le développement de stratégies thérapeutiques pour cibler efficacement les cellules de cancer du sein dans les tissus osseux.
Introduction
Le microenvironnement tumoral est largement reconnue comme un facteur déterminant du comportement des cellules cancéreuses lors de la progression du cancer du sein métastatique et réparties 1-3. Le but de la méthode présentée ici est de faciliter l'étude des cellules de cancer du sein dans le microenvironnement du tissu osseux humain, le site le plus fréquent des métastases du cancer du sein 06/04. L'os est constitué de compartiments minéralisées et moelle 7-9, qui abritent les deux cellules et les facteurs sécrétés impliqués dans la progression métastatique 10,11. Bien que largement utilisé dans des modèles murins in vivo faciliter les études systémiques du processus métastatique 12-15, interactions cellulaires dans le squelette ne sont pas facilement accessibles pour l'observation et la perturbation directe. systèmes de modèle pour l'étude et la culture de tissus osseux de la souris et des cellules de moelle de souris fournissent un meilleur accès et ont donné de nombreuses idées concernant la diaphonie et les mécanismes sous-jacents cellules du cancer du sein metastasis du squelette murin 16-22. Cependant, des études ont suggéré qu'il pourrait y avoir des motifs spécifiques aux espèces de ostéotropisme pour le tissu osseux 23,24. Ces modèles pourraient refléter espèces spécifiques inhérents différences dans les propriétés du tissu osseux, les différences résultant de populations de moelle osseuse altérées chez des souris immunodéficientes 11, et / ou l'âge relativement jeune de souris utilisés dans des expériences, qui sont tous des déterminants probables de l'os microenvironnement.
Approches in vitro pour étudier les cellules du cancer du sein dans l'os co-cultures humaines ont généralement porté sur des types de cellules osseuses spécifiques tels que les ostéoblastes dérivées de la moelle ou de cellules stromales cultivées en monocouches ou dans des systèmes modèles en 3 dimensions modifiées 25-35. Bien que les modèles de culture cellulaires deux dimensions ont formé le pilier de approches in vitro pour la recherche sur le cancer, il est reconnu depuis longtemps que le comportement de la cellule est fondamentalement modifiée en monolayer systèmes de culture 18,36,37. Cela a conduit au développement de micro-environnements modifiés qui imitent la complexité des tissus vivants trois dimensions, y compris matriciel et modèles basés échafaudage sont constitués de matières naturelles, telles que le collagène, ou des polymères synthétiques ensemencées avec des types de cellules spécifiques pour créer des micro-environnements de tissu ressemblant 36-41. Les approches d'ingénierie ont également inclus l'utilisation de plates-formes de bioréacteurs pour contrôler et étudier le milieu hormonal du microenvironnement 18,19,41-43. Bien que les modèles et les bioréacteurs biomimétiques fournissent de nombreux éléments d'un microenvironnement des tissus complexes dans un environnement contrôlé, et ont été appliquées avec succès pour faire progresser l'étude des métastases du cancer du sein à l'os 18,19,35,42,43, systèmes modèles d'ingénierie ne intègrent généralement pas la gamme complète de types de cellules et de composants de la matrice extracellulaire présents dans l'environnement de l'os natif.
Jusqu'à récemment, le cancer du seincellules ne ont pas été étudiés dans le, intacte microenvironnement natif, trois dimensions des tissus osseux humains. Nous avons récemment rapporté le développement d'un modèle de co-culture en utilisant des fragments de tissus osseux humains isolés à partir de prothèse totale de hanche (PTH) Chirurgie spécimens 44. Ces spécimens abritent les deux compartiments minéralisées et de moelle osseuse nécessaires pour étudier les mécanismes sous-jacents de micro-métastases dans la culture à court terme. Dans des travaux antérieurs, nous avons établi la preuve de principe pour l'utilisation de l'imagerie par bioluminescence (BLI) de surveiller la prolifération des cellules du cancer du sein exprimant la luciférase (MDA-MB-231-Fluc) co-cultivées avec des fragments d'os 44. Ici, nous présentons détaillons protocoles expérimentaux pour étudier la prolifération des cellules du cancer du sein, de la colonisation et de la migration dans le contexte du microenvironnement natif utilisant des explants de tissus osseux humain.
Nous présentons d'abord un protocole de cellules de cancer du sein co-culture adjacents à des fragments d'os pour mesurer seinla prolifération cellulaire en utilisant BLI. Dans cette section, des suspensions de cellules du sein sont ensemencées sous forme de taches de cellules dans des plaques à 6 puits adjacents à des fragments d'os, qui sont immobilisées par des morceaux de cire osseuse. Les puits témoins contiennent de la cire d'os, mais pas de fragment d'os. Une fois les taches de cellules attachent, milieu est ajouté et la plaque est mise en culture pendant 24 heures, après quoi l'intensité du signal bioluminescent (associée avec le nombre de cellules) est mesuré avec BLI. Dans l'étape suivante, nous présentons des procédés pour les cellules cancéreuses du sein co-culture ensemencés directement sur les fragments d'os à étudier la colonisation et la prolifération. Ici, les suspensions de cellules du sein sont déposés à la pipette directement sur les fragments de tissus osseux, qui sont suivis dans la culture par BLI et la microscopie de fluorescence au cours du temps pour suivre la colonisation et le nombre de cellules. Dans ce procédé, le compartiment de moelle peut être envoyé à partir des fragments d'os à ne importe quel point dans le temps pour l'analyse de cellules du cancer du sein colonisés par cytométrie en flux, ou des dosages de viabilité de la moelle osseuse.
En outre, on describe deux approches différentes pour la mesure de la migration des cellules du cancer du sein. Dans la première méthode étapes sont décrites pour mesurer la migration vers les tissus osseux surnageants de culture. Dans ce protocole, les cellules de cancer du sein sont ensemencées sur les surfaces supérieures intérieures, d'insérer des membranes Transwell avec une taille de pores de 8 um (comme représenté sur la figure 1A). Les inserts sont ensuite placés dans une plaque de réception avec des puits contenant des tissus osseux surnageant ou le milieu de contrôle. Au cours d'une période d'incubation de 20 h, un petit nombre de cellules cancéreuses du sein migrent à travers les membranes d'insertion vers le bas dans les puits de culture de tissus inférieurs où ils se fixent pour la détection par BLI. Dans la seconde méthode de migration des cellules de cancer du sein sont ensemencées sur les surfaces extérieures inférieures, de membranes d'insert Transwell. des fragments de tissu osseux sont placées dans les cupules d'insertion et les cellules de cancer du sein migrent à travers les membranes à coloniser les fragments d'os (comme représenté sur la figure 1B), quisont ensuite imagé en utilisant BLI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Têtes fémorales ont été prélevés chez des patients subissant une chirurgie élective THR dans le département de chirurgie orthopédique à l'École de médecine de l'Université Stanford. Tous les tissus ont été recueillies dans dépersonnalisées spécimens conformément à la réglementation de l'Office Université Stanford recherches sur l'observation.
1. Sélection d'une ligne (s) de cellules du cancer du sein
- Obtenir ou transfecter la lignée cellulaire de cancer du sein souhaitée (s) avec une construction de rapporteur de la luciférase-GFP. Les expériences suivantes ont été effectuées en utilisant le MDA-MB-231 et MCF-7 du cancer du sein lignées cellulaires conçus pour l'expression stable de la luciférase de luciole (USLC) et le renforcement de la protéine fluorescente verte (EGFP) par transfection avec la Belle au Bois Dormant transposon plasmide pKT2 / Lubig et le plasmide pK transposase / Hubic-SB11 45,46.
REMARQUE: Les lignées de cellules transfectées sont désignés comme MDA-MB-231-Fluc-EGFP, et MCF-7-Fluc-EGFP.
2. Isoler tissus Fragments de têtes fémorales
- Après la chirurgie THR, recueillir la tête fémorale au rebut dans un récipient stérile remplie de sérum physiologique. Transférer le spécimen dans le laboratoire et de traiter dans un délai de 1-3 heures de la chirurgie. Remarque: se il ya un retard dans le traitement, le spécimen à 4 ° C.
- Préparer une zone de travail en plaçant les éléments suivants sur un tapis absorbant dans une hotte à flux laminaire de culture de tissu: gants stériles, rongeur chirurgicale, pinces, bécher avec 70% d'isopropanol à rincer les instruments, et les navires de culture de tissus tel que stipulé ci-dessous pour chaque type d'expérience .
- Le port d'un gant chirurgical stérile pour maintenir la tête du fémur tour dans une main, utilisez le rongeur dans l'autre main pour extraire des fragments d'os trabéculaire de taille désirée (~ 2-5 mm) de l'arbre supérieure exposée du fémur. Transfert des fragments d'os dans le récipient de culture (par exemple, 6, 12, ou 24 puits plaque de culture tissulaire ou de la chambre de migration), en fonction du type de prolifération, colonisation ou migration expérience, telle que décrite dans les étapes 3, 4 ou 5.
REMARQUE: des fragments de tissus osseux doit être récolté comme décrit ci-dessus après avoir terminé les étapes initiales pour chaque prolifération, la colonisation ou la migration test spécifique. Fragments varieront en taille comme le montre la figure 2. Les fragments peuvent être pesés avant ou après des expériences dans le but de normalisation.
3. Les cellules du cancer du sein Co-culture adjacentes à Fragments d'os pour mesurer sein prolifération cellulaire en utilisant BLI
- Avant l'expérience, préparer une suspension contenant 2 x 10 5 cellules du cancer du sein / 50 ul, et préparer des bouchons de cire osseuse pour l'immobilisation de fragments d'os en culture. Couper une pointe de micropipette P200 en 3 morceaux et utiliser l'extrémité étroite de la plus grande pièce d'une manière "cookie cutter" pour couper des petits (~ 35 mg) morceaux de cire osseuse. Utiliser l'extrémité large de la plus petite pièce pour éjecter les bouchons de cire osseuse dans une boîte de Pétripour le stockage.
- Placez un morceau de cire d'os à la position de 12 heures de chaque puits et appuyez doucement avec un index stériles gantées.
- Introduire à la pipette 50 ul de suspension cellulaire contenant 1 x 10 5 cellules de cancer du sein dans un milieu DMEM-10% SVF + Pen-Strep au centre de chaque puits d'une plaque à 6 puits. (Variante, des cellules de semences dans un motif dispersé si désiré.) Placer la plaque dans une culture de tissu C incubateur à 37 ° pendant 45 min à promouvoir l'attachement des cellules.
- Placez une fragment d'os sur une morceau de cire osseuse pour chaque puits expérimental et appliquer une légère pression avec le rongeur pour le fixer. Réaliser des expériences en triple telle que trois fragments d'os d'un spécimen THR données sont placées dans les trois premiers puits, tandis que les trois derniers puits contiennent la cire osseuse seulement comme témoins.
- L'utilisation d'une pipette de 5 ml, doucement et lentement fournir 5 ml de DMEM-10% FBS sur le côté de chaque puits afin d'éviter de déloger les cellules mammaires ou des fragments d'os. Placer la plaque dans un 3776; C culture tissulaire incubateur pour 20-24 h.
- Pour effectuer l'imagerie par bioluminescence (BLI) retirer la plaque de l'incubateur et ajouter le substrat de luciférine (pour obtenir une concentration de 300 ug / ml) dans chaque puits. Image la plaque immédiatement sur une plateforme d'imagerie IVIS utilisant les paramètres suivants: f-stop de 1, petite binning, temps d'exposition de 1 sec, le niveau D. mesurer l'intensité du signal de chaque ainsi que l'éclat moyenne (photons / seconde centimètres / carré / stéradian).
- Utilisez le logiciel d'imagerie pour définir des régions d'intérêt (ROI) pour quantifier le rayonnement moyenne pour tous les puits expérimentaux et de contrôle. valeurs de radiance moyenne à l'exportation vers une feuille Excel pour effectuer des statistiques et de générer des graphiques.
4. Les cellules du cancer du sein Co-culture ensemencées directement sur Fragments d'os pour l'étude de la colonisation et du numéro de cellulaire
- Utiliser des pinces pour placer des fragments d'os directement dans les puits vides d'une plaque de culture tissulaire à 24 puits (1 fragment / puits).
- Pépinette un 50 ul de suspension cellulaire gouttelette de DMEM-FBS à 10% contenant 1 X 3 à 6 octobre cellules de cancer du sein directement au-dessus de chaque fragment d'os. Placer la plaque dans un 37 ° C incubateur de culture tissulaire pendant 45 min à promouvoir l'attachement des cellules. Ajouter doucement 2.1 ml de DMEM-10% de FBS dans le côté de chaque puits de telle sorte que le fragment est entièrement immergé dans le milieu. Incuber la plaque dans un 37 ° C incubateur pour culture de tissus de 20 à 24 h.
- Après incubation, utiliser une pince pour transférer chaque fragment de tissu osseux à une plaque à 24 puits fraîche contenant 1 ml de DMEM-10% de FBS dans chaque puits. Pour effectuer BLI, suivez les étapes 3.6 à 3.7 ci-dessus. En outre, les fragments peuvent être visualisés à l'aide d'un microscope à fluorescence, ou rincés pour obtenir la population de la moelle osseuse pour l'analyse des chiffres et des propriétés cellulaires de cancer du sein comme décrit dans l'étape 6.
- Pour préparer les fragments intacts pour l'évaluation qualitative par microscopie à fluorescence suivant BLI, pipette 5 pi de solution d'étiquetage de bisphosphonate fluorescent (prépréparée selon les instructions du fabricant) dans chaque puits pour étiqueter les spicules minéralisées des fragments d'os. Incuber la plaque dans l'incubateur de culture tissulaire pendant 24 heures.
- À la suite de 24 h de culture dans la solution de marquage de bisphosphonate fluorescent, utiliser une pince pour transférer les fragments de plaques de culture de tissu contenant du milieu dépourvu de rouge de phénol et vue l'aide d'un microscope à fluorescence configuré pour imager la GFP (485 nm) et l'étiquette de bisphosphonate (680 nm).
5. Mesurer la migration des cellules de cancer du sein à des fragments de tissu osseux et de culture Fragment d'os surnageants
- Migration vers le tissu osseux surnageant de culture.
REMARQUE: réaliser des expériences en triple telle que trois fragments d'un spécimen THR données sont utilisés pour générer trois surnageants. Pour chaque expérience, la migration est comparée dans trois puits contenant surnageants osseuses contre trois puits contenant du milieu de commande seulement.- Générer tis osseusepoursuivre surnageants en plaçant des fragments d'os dans les puits d'une plaque à 12 puits contenant 2,2 ml de DMEM-10% de FBS par puits. Culture dans un 37 ° C incubateur de culture tissulaire pendant 24 heures. Retirer le milieu à 24 h et le remplacer par 2,2 ml frais DMEM-10% de FBS. Traiter les puits témoins contenant du DMEM-FBS à 10% de la même manière.
NOTE: Le milieu est changé à 24 h pour éliminer les facteurs sécrétés en réponse à un traumatisme des tissus résultant d'une chirurgie. Parce que les surnageants de tissu osseux sont générés dans un milieu contenant du FBS-puits contenant FBS, un milieu contenant seulement sont inclus pour contrôler la contribution de FBS à la migration de cellules de cancer du sein. - A 48 heures, de recueillir 0,9 ml de chaque / moyen et pipette de contrôle surnageant dans les puits d'une plaque réceptrice. Les insertions seront ensuite placés dans ces puits. Incuber la plaque du récepteur dans le tissu incubateur de culture tout en ensemençant les inserts. Remarque: Le surnageant restant (~ 1 ml après évaporation) peuvent être collectées pour l'analyse des sécrétome factors 44 si vous le souhaitez.
- Pour ensemencer les inserts Transwell, placez-les dans une norme, vide de 24 puits plaque de culture de tissus. Introduire à la pipette 350 ul de suspension cellulaire contenant 1 x 10 5 cellules de cancer du sein dans du DMEM-FBS à 10% sur la surface de la membrane interne, supérieure, de chaque insert comme représenté sur la figure 1A. Placer la plaque à 24 puits contenant les inserts ensemencées dans les 37 ° C incubateur de culture tissulaire pendant 45 min pour favoriser la fixation.
- Une fois que les cellules ont attaché aux inserts, utiliser une pince pour transférer les inserts à la plaque de récepteur selon les instructions du fabricant. Angle chaque insert lorsque vous les placez dans le récepteur et pour prévenir la formation de bulles entre la membrane d'insertion et le récepteur ainsi surnageant. Incuber la plaque du récepteur avec des inserts pendant 20 heures dans un 37 ° C incubateur de culture tissulaire.
REMARQUE: Vérifiez la partie inférieure de la plaque réceptrice de bulles entre la membrane d'insertion et le récepteur ainsi supernatant. Si des bulles sont visibles, enlever les inserts spécifiques et de les placer à nouveau dans le récepteur ainsi jusqu'à ce qu'aucune bulle sont présents. - Après 20 heures d'utilisation des forceps pour retirer les inserts de la plaque du récepteur. En utilisant les procédures décrites dans les étapes 3.6 à 3.7 à l'image BLI effectuer les cellules qui ont migré dans et fixés au fond des puits de la plaque de réception.
- Générer tis osseusepoursuivre surnageants en plaçant des fragments d'os dans les puits d'une plaque à 12 puits contenant 2,2 ml de DMEM-10% de FBS par puits. Culture dans un 37 ° C incubateur de culture tissulaire pendant 24 heures. Retirer le milieu à 24 h et le remplacer par 2,2 ml frais DMEM-10% de FBS. Traiter les puits témoins contenant du DMEM-FBS à 10% de la même manière.
- La migration vers les fragments de tissu osseux.
REMARQUE: réaliser des expériences en triple telle que trois fragments d'un spécimen THR données sont placés dans trois inserts séparés, et trois perles de verre sont placés dans trois inserts séparés comme témoins.- Préparer la plaque réceptrice par pipetage de 0,9 ml de DMEM-FBS à 10% dans chaque puits. Placez-le dans le tissu incubateur de culture tout en préparant les inserts.
- Pour ensemencer les inserts, les inverser sur la surface d'une boîte de tube de centrifugeuse en plastique muni d'un couvercle. Pipeter 50 uL d'une suspension cellulaire de gouttelettes de DMEM-FBS à 10% contenant 1 x 10 5 cellules de cancer du sein; directly sur la surface extérieure, en bas de chaque membrane de l'insert (qui est orientée vers le haut sur les inserts inversées). Couvrir la boîte de tube de centrifugeuse avec le couvercle entrouverte et de le transférer à l'incubateur à 37 ° C de tissu pendant 45 min à promouvoir l'attachement des cellules.
- Transférer la boîte du tube de centrifugeuse pour la hotte de culture de tissus, et d'utiliser une pince pour tourner les inserts ensemencées côté droit et les transférer dans les puits de la plaque réceptrice. Pipette 0,450 ml de DMEM-FBS à 10% dans chaque cupule d'insertion. En utilisant des pinces, transférer un fragment de tissu osseux (~ 3 mm) dans chaque coupelle d'insertion préparé. Eventuellement, utiliser des perles de verre de contrôles négatifs dans des puits supplémentaires. Placer la plaque dans un incubateur de culture de tissu pendant 20 heures.
- Pour mesurer la migration, préparer une plaque de culture de tissu à 24 puits standard contenant 1 ml de DMEM-FBS à 10% par puits. Retirer la plaque du récepteur de l'incubateur et utiliser des pinces pour transférer les fragments d'os et perles de chaque insert dans des puits séparés de la plaque standard. Ajouter luciférinesubstrat (pour obtenir une concentration finale de 300 ug / ml) dans chaque puits et BLI effectuer en utilisant les procédures décrites dans les étapes 3.6 à 3.7.
6. Les analyses pré- et post-expérimentaux supplémentaires
- Analyse de moelle rouge.
- Transférer un fragment d'os dans un tamis cellulaire de 70 pm placée au sommet d'un tube conique de 50 ml. Utiliser une seringue de 10 ml avec une aiguille 25 G pour rincer énergiquement le fragment avec 10 ml de PBS pour obtenir une suspension de cellules de moelle osseuse dans le tube conique. Centrifuger la suspension de cellules pendant 3 minutes à 300 x g et 21 ° C, Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans du PBS ou tout autre solution souhaitée pour la cytométrie de flux.
REMARQUE: Les volumes de remise en suspension varie en fonction de la taille du culot de cellules après centrifugation, et l'application. - Pour les tests de viabilité ~ 75-300 volumes ul de PBS sont appropriées, et ces suspensions peuvent être analysées à l'aide disponible dans le commerce fluorescence essais de viabilité en fonction selon les instructions du fabricant, à la pipette dans un hémocytomètre classique, et comptées en utilisant un microscope à fluorescence inversé.
- Pour l'analyse par cytométrie de flux ou tri basé sur la détection de cellules de cancer du sein positives à GFP, remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de PBS contenant 2% de FBS, 2 mM d'EDTA et 10 mM de HEPES de telle sorte que la concentration est de 1 x 10 6 cellules / ml.
- Transférer un fragment d'os dans un tamis cellulaire de 70 pm placée au sommet d'un tube conique de 50 ml. Utiliser une seringue de 10 ml avec une aiguille 25 G pour rincer énergiquement le fragment avec 10 ml de PBS pour obtenir une suspension de cellules de moelle osseuse dans le tube conique. Centrifuger la suspension de cellules pendant 3 minutes à 300 x g et 21 ° C, Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans du PBS ou tout autre solution souhaitée pour la cytométrie de flux.
- Coloration H & E et immunohistochimie.
- Pour traiter les fragments pour hématoxyline & éosine (H & E) coloration et / ou immunohistochimie, placer les fragments de cassettes plastique étiquetés avec un crayon numéro 2, et plonger dans un récipient rempli de formol à 10% tamponnée pendant 24 heures.
- tissus de procédé pour inclusion dans la paraffine, de sectionnement et de la coloration en utilisant des protocoles de routine qui comprennent une étape de décalcification pour tenir compte des spicules minéralisées dans chaque fragment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isoler des fragments de tissus provenant de têtes fémorales
Têtes fémorales ont été prélevés sur un nombre égal de patients de sexe féminin (44-90 ans) qui subissent une chirurgie de remplacement total de la hanche élective dans le département de chirurgie orthopédique à l'École de médecine de l'Université Stanford et masculins. Chaque tête fémorale jeté contient une petite portion de la partie supérieure du fémur, qui abrite tissu osseux trabéculaire composé de spicules minéralisées et osseuse. Ce tissu est accessible à travers la section transversale chirurgicalement exposée de l'arbre (Figure 2A) en utilisant une pince-gouge chirurgicale pour extraire des petits fragments. L'histologie des pièces extraites est représenté sur la figure 2B et révéler les composants minéralisés et la moelle. L'aspect des pièces extraites varie selon les têtes fémorales obtenus à partir de patients différents, allant du jaune au rouge, en fonction de la teneur en adipocytes de la moelle, comme illustré sur la figure 2C. We démontrer l'utilisation de ces fragments de tissus osseux à court terme des essais pour mesurer des interactions dynamiques avec des cellules de cancer du sein d'ingénierie pour la luciférase et l'expression de l'EGFP.
Les cellules du cancer du sein Co-culture adjacente à Fragments d'os pour mesurer sein prolifération cellulaire utilisant bioluminescence Imaging
La configuration de la plaque de culture de cellules MDA-MB-231-Fluc-EGFP cellules de cancer du sein co-culture adjacents à des fragments d'os immobilisés pour mesurer la prolifération des cellules du sein en utilisant BLI est représenté sur la figure 3A. BLI de la plaque à 24 h est illustré à la Figure 3B, et le signal à partir de 3 expériences BLI, démontrant augmentation de la prolifération cellulaire en présence vs absence de fragments d'os est représenté sur la figure 3C.
Les cellules du cancer du sein Co-culture ensemencées directement sur Fragments d'os pour l'étude de la colonisation et du numéro de cellulaire
La colonisation de MCF-7-c-EGFP Flucaunes ensemencés directement sur les fragments de tissus osseux, telle que mesurée par BLI à 24 heures est illustré sur la figure 4A, montrant signal associé à la densité d'ensemencement baisse diminué. Un fragment directement graine est disponible à 48 h sur la figure 4B, après marquage fluorescent réactif avec biphosophonate, tels que vus par microscopie à fluorescence pour révéler la colonisation des cellules de cancer du sein dans les compartiments minéralisées et la moelle. Ces patrons de colonisation sont également révélés dans fragments directement graines traitées post-expérimentalement pour la coloration immunohistochimique avec l'anticorps cytokératine (figures 4C et 4D).
Mesure de la migration des cellules cancéreuses du sein à des fragments de tissu osseux et de culture Fragment d'os surnageants
La migration des cellules MDA-231-Fluc-EGFP à travers les membranes poreuses migration vers tissu osseux surnageants de culture et dans des fragments d'os est détecté avec BLI, comme illustré sur la figure 5. Un schéma de migration vers robuste surnageants de culture dérivés des trois fragments d'un échantillon donné de THR est représenté sur la figure 5A, qui illustre la migration augmentée dans les puits contenant des os surnageant de tissu par rapport à un milieu témoin. Bien que tous les modèles de migration sont pas ce robuste, la migration vers surnageants d'os est généralement plus grande que vers le milieu témoin dans la plupart des expériences. Un motif de migration typique dans des fragments d'os à partir d'un échantillon donné de THR est représenté sur la figure 5B.
Analyse des Flushed courges
En outre, nous montrons que les cellules de moelle peuvent être envoyés à partir de fragments colonisés, et que les cellules de cancer du sein rincée peut être détecté chez ces cellules par cytométrie de flux (figure 6B), BLI (figure 6C), et / ou la microscopie à fluorescence (Figure 6D) .
Viabilité de mesure
Figure 1: Mise en place d'expériences de migration. (A) Dans des expériences de migration "en avant", les puits de plaques de récepteur sont générés précédemment rempli de surnageants de culture de tissu osseux. des cellules de cancer du sein qui sont ensemencées sur les surfaces supérieures intérieures des membranes Transwell cupules d'insertion dans DME contenant 10% de FBS-migrent à travers les membranes et se attachent au fond des puits de détection par BLI. 
Figure 2: Identification des fragments de tissus provenant de têtes fémorales. (A) l'extraction des fragments d'os trabéculaire utilisant un rongeur chirurgicale. (B) histologie du fragment fixe immédiatement après l'extraction à partir de tissus du fémur minéralisée (flèche blanche) et de la moelle (flèche noire) des compartiments montrant. Fragments d'os (C) trabéculaires extraites de deux différents têtes fémorales démontrant variation vs rouge contenu de moelle jaune. 
Figure 3: les cellules du cancer du sein co-culture adjacents à des fragments d'os de la poitrine mesurer la prolifération cellulaire en utilisant l'imagerie par bioluminescence. (A) d'installation de la plaque Culture pour MDA-MB-231-Fluc-EGFP cellules co-culture de cancer du sein adjacentes à des fragments d'os immobilisés, comme indiqué par des flèches: taches de cellules (bleu), la cire osseuse (noir), et fragment d'os (rouge ). La position de la cire osseuse est également noté par un cercle en pointillé noir. La plaque est indiqué avant l'addition de milieu. Les trois premiers puits contiennent des fragments d'os attachés à la cire en os et les trois derniers puits contient de la cire d'os seulement. (B) BLI de la plaque à 24 h. (C) La quantification de signaux BLI pour les cellules MDA-MB-231-Fluc-EGFP croître en présence (barres pourpres) vs absence (barres vertes) Des fragments de trois spécimens THR cultivées comme décrit. Pour chaque spécimen THR, barres représentent les valeurs moyennes mesurées BLI travers trois fragments contenant - 3 puits de contrôle contre. Ce résultat démontre niveaux plus élevés de prolifération en présence vs absence de fragments d'os. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard (p <0,01). Reproduit avec la permission 44. 
Figure 4: Détection de cellules de cancer du sein ensemencés directement sur les fragments d'os. (A) La colonisation des cellules MCF-7-Fluc-EGFP ensemencées directement sur des fragments de tissu osseux détecté par BLI à 24 h, montrant signal associé à la densité de semis baisse diminué. (B) fragment Directement tête de série à 48 h après l'ensemencement, et 24 h étiquetage de poste avec fluorescent réactif biphosophonate. La microscopie à fluorescence révèle cellules EGFP + cancer du seinciés avec un spicule minéralisée (flèche verte), et avec des cellules adipeuses dans le compartiment de la moelle (flèches blanches). Ces patrons de colonisation sont également révélés dans fragments directement graines traitées pour la coloration immunohistochimique avec un anticorps pan-cytokératine AE1 / AE3 suivante 72 heures de co-culture (C) et (D). En (C) des cellules de cancer du sein cytokératine-positives, désignées par des flèches, sont observés adjacente à adipocytes dans le compartiment de moelle osseuse. En (D) d'une cellule de cancer du sein cytokératine-positives est observée fixé à un spicule minéralisée. (C) et (D) 44 reproduits avec permission. 
Figure 5:. Mesure de la migration des cellules du cancer du sein à des fragments de tissus osseux et des surnageants de cultures de fragments d'os migration des cellules MDA-MB-231cellules -fLuc-EGFP à travers les membranes de migration poreuses vers tissu osseux surnageants de culture et en fragments d'os détecté à 24 h avec BLI. (A) signal de BLI révélant améliorées migration vers surnageants de culture provenant d'un THR donnée spécimen vs milieu témoin. (B ) signal de BLI démontrant motif de la migration des cellules de cancer du sein en trois fragments d'os d'un seul spécimen THR. des fragments de tissu osseux sont désignés par des cercles en pointillés blancs. Les puits témoins contenant des billes de verre sont représentés sur le fond. 
Figure 6:.. Détection de cellules MDA-MB-231fLUC-EGFP dans courgettes vidées de fragments colonisés (A) Fragments sans (à gauche) et avec (à droite) colonisé cellules de cancer du sein, détectée par BLI (B) Analyse des courges rincé de fragments (A) en ffaible cytométrie. Des cellules de cancer du sein EGFP-positives ont été détectées dans la moelle rincé à partir du fragment BLI-positive, mais pas le fragment BLI-négatif. (C) BLI détection de colonies de cellules de cancer du sein résultant de la culture de moelle balayé à partir d'un fragment BLI-positif. (D) La microscopie à fluorescence du compartiment de moelle balayé à partir d'un fragment d'BLI-positif, montrant des cellules MDA-MB-231fLUC-EFGP dans un champ de cellules de moelle. 
Figure 7:. Les viabilités pour mesurer la viabilité des cellules de moelle rincées à partir de fragments de tissus isolées à partir de quatre spécimens THR immédiatement après la collecte et à 24, 48, 72 h et 6 jours de culture dans du DMEM-FBS à 10%. Le milieu a été changé à 24 et 72 heures.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mehra et al. Ont déjà décrit la collecte et l'analyse des échantillons d'os post-mortem de patients métastatiques de cancer de la prostate récoltés au moment de l'autopsie, révélant des tissus de haute qualité et de valider l'utilisation des échantillons d'os humains pour étudier le processus métastatique 47. Ici, nous avons décrit les protocoles pour la collecte, le traitement et l'utilisation de fragments de tissus osseux humains obtenus à partir de têtes fémorales au rebut après la chirurgie THR dans un système de co-culture à court terme pour étudier la migration des cellules du sein, de la colonisation et de la prolifération. Environ 300 000 chirurgies de remplacement de la hanche sont effectuées chaque année aux États-Unis (American Academy of Orthopaedic Surgeons; Orthoinfo.aaos.org), et ces spécimens sont généralement jetés. Une des indications les plus fréquentes pour cette chirurgie est l'arthrose de la hanche, ce qui conduit à la dégradation progressive des surfaces de cartilage couvrant la tête fémorale, qui se traduit par des douleurs articulaires. Pendant rem totale de la hanchechirurgie ent une petite portion de la partie supérieure du fémur est enlevée le long de la tête fémorale. Le fémur est un site commun de métastase du cancer du sein 48, et ces échantillons contient le tissu de l'os trabéculaire, le site de colonisation cellulaire métastatique du sein. La plupart des patients qui subissent une arthroplastie de la hanche sont âgés de 50 à 80 ans, une tranche d'âge que les crochets des années de l'incidence du cancer du sein pointe. Ainsi, ces tissus constituent une ressource précieuse pour l'étude de cancer du sein métastatique osseuse niche.
Il ya plusieurs étapes critiques et les considérations associées à ces techniques. D'abord, un ronguer chirurgicale de bonne qualité est indispensable pour extraire les petits fragments d'os trabéculaire tout en maintenant la tête fémorale dans la main gantée contraire. Forceps ne fonctionnent pas parce qu'ils ne sont pas assez solides pour extraire le tissu trabéculaire contenant spicules minéralisées. Une autre considération importante dans ces essais a trait à la manutention de lignée de cellules du sein et des passages, particument en ce qui concerne les essais de migration. Passage et / ou de la variabilité à long terme dans les procédures de trypsinisation peuvent conduire à la sélection séquentielle des populations plus / moins tenaces de cellules, ce qui pourrait modifier les réponses migratoires dans les expériences. Une autre question a trait à la normalisation des expériences, étant donné la variabilité des tissus obtenus à partir de patients chirurgicaux de différents âges et états pathologiques. Pour y remédier, nous utilisons un modèle expérimental intra-sujet dans lequel toutes les variables sont testés en trois exemplaires (par exemple, à travers trois fragments / puits expérimentaux contre trois puits fragments / de contrôle) en utilisant des fragments de pièce opératoire d'un patient donné. Les variables peuvent être testés en utilisant cette conception sur des spécimens provenant de plusieurs patients, et analysés pour la signification statistique en utilisant le test t apparié pour les données en moyenne par rapport aux répétitions, et / ou un aller-simple intra-sujets ANOVA pour les données de plus de répétitions. Et enfin, une première limite de cette méthode est la courte fenêtre d'viabilité cours Explant.
Nos mesures ont révélé viabilités de moelle de ~ 90% le jour de la collecte, conformément aux mesures de viabilité obtenus à partir de ponctions de moelle osseuse 49. Au fil du temps, cependant, nous avons observé une baisse progressive au fil des jours deux et trois, avec une perte dramatique de la viabilité par jour 6. Bien que nous ne avons pas mesuré la viabilité du compartiment minéralisée, observations qualitatives suggèrent qu'il ya une baisse similaire de la viabilité de ostéoblastes et ostéocytes os doublure, comme on le voit dans la figure 4D. Sur la base de ces expériences, nous avons limité nos expériences de culture à des études à court terme effectuées plus de 48 ou 72 heures. Des expériences préliminaires (non incluses) ont indiqué que la viabilité peut être améliorée en utilisant les médias disponibles dans le commerce formulé pour soutenir les cellules de moelle. Cependant nous ne avons pas caractérisé les populations de cellules de la moelle dans ces expériences, et je ne sais pas si les résultats de viabilité amélioration de la sélectionnéeexcroissance de certaines sous-populations de cellules de moelle osseuse. Le développement de protocoles pour soutenir et prolonger la viabilité de ces explants sera important pour faire avancer ce système modèle.
Bien que ce modèle est limité à de courtes périodes, de ses avantages essentiels par rapport aux autres procédés comprennent les caractéristiques suivantes: 1) intacts les tissus trois dimensions portant des types de cellules pertinents qui constituent le microenvironnement osseux humain, 2) l'accessibilité au microenvironnement osseux pour la surveillance et les interactions dynamiques perturbateurs, 3) un grand nombre de fragments par échantillon pour expériences répétées, et 4) faible coût par rapport à des modèles animaux.
Bien que nous ayons décrit des essais pour étudier la métastase du cancer du sein à l'os, ces spécimens et les approches peuvent être facilement étendus à l'étude d'autres tumeurs malignes de l'os à la recherche telles que le cancer de la prostate, ainsi que d'autres pathologies osseuses. Bien que nous avons utilisé les têtes fémorales rebut principalement comme un soiurce de fragments de tissus, ces spécimens constituent également une source supplémentaire de moelle osseuse humaine, qui est traditionnellement recueillies par l'aspiration de la moelle osseuse de jeunes volontaires. Et finalement, alors que nous avons décrit les approches utilisant des lignées cellulaires modifiées pour bioluminescence et de fluorescence, la plupart des procédures peuvent être modifiées pour une utilisation avec d'autres cellules si ces lignées cellulaires et / ou plates-formes d'imagerie ne sont pas disponibles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Ces études ont été financées, en partie, par des subventions de la Fondation Alternative recherche et développement (107 588), l'Institut national de la santé (1U54CA136465-04S1), et le Programme de recherche sur le cancer du sein en Californie (201B-0141). Nous remercions les Drs. Andrew Wilber et R. Scott McIvor pour le don généreux de leur
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (1X) + GlutaMAX-l | Life Technologies | 10569-010 | Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| McCoy's 5A Medium (1X) | Life Technologies | 16600-082 | Supplement all McCoy's with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillen Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Blastocidin (10 mgl/ml) | InvivoGen | ant-bl | Supplement media used for transfected cell lines. |
| Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size) | Corning Incorporated | 353097 | |
| Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate | Corning Incorporated | 353504 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells* | Invitrogen Detection Technologies | L-3224 | |
| FluoroBrite DMEM | Life Technologies | A18967-01 | |
| D-luciferin firefly, potassium salt 5 g (30 mg/ml) | Life Technologies | L-8220 | |
| Sterile Cell Strainer 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3516 | |
| 12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3513 | |
| 24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3526 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Bone wax | Surgical Specialties Corporation | 903 | |
| IVIS 50 Imaging Platform | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | ||
| Living Image Software Program | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | 133026 | |
| EVOS FL Imaging System | Life Technologies | Version 4.2 | |
| OsteoSense 680 EX | PerkinElmer | NEV10020EX | |
| MCF-7 breast cancer cells | ATCC | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | HTB-26 | |
| Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody | DAKO Cytomation | Clone (AE1/AE3) |
References
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13, 227 (2011).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
- Bissell, M. J., Radisky, D. Putting tumours in context. Nat Rev Cancer. 1, 46-54 (2001).
- Coleman, R. E., Rubens, R. D. The clinical course of bone metastases from breast cancer. British journal of cancer. 55, 61-66 (1987).
- Mundy, G. R. Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities. Nat Rev Cancer. 2, 584-593 (2002).
- Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
- Clarke, B. Normal bone anatomy and physiology. Clin J Am Soc Nephrol. 3, Suppl 3. S131-S139 (2008).
- Weatherholt, A. M., Fuchs, R. K., Warden, S. J. Specialized connective tissue: bone, the structural framework of the upper extremity. Journal of hand therapy : official journal of the American Society of Hand Therapists. 25, 123-131 (2012).
- Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicologic pathology. 34, 548-565 (2006).
- Casimiro, S., Guise, T. A., Chirgwin, J. The critical role of the bone microenvironment in cancer metastases. Molecular and cellular endocrinology. 310, 71-81 (2009).
- Patel, L. R., Camacho, D. F., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. Mechanisms of cancer cell metastasis to the bone: a multistep process. Future Oncol. 7, 1285-1297 (2011).
- Goldstein, R. H., Weinberg, R. A., Rosenblatt, M. Of mice and (wo)men: mouse models of breast cancer metastasis to bone. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 25, 431-436 (2010).
- Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochemical and biophysical research communications. 394, 443-447 (2010).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212 (2006).
- Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer metastasis reviews. 33, 721-735 (2014).
- Schiller, K. R., et al. Secretion of MCP-1 and other paracrine factors in a novel tumor-bone coculture model. BMC Cancer. 9, 45 (2009).
- Curtin, P., Youm, H., Salih, E. Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex-vivo co-cultures of live calvarial bones and cancer cells. Biomaterials. 33, 1065-1078 (2012).
- Krishnan, V., et al. Dynamic interaction between breast cancer cells and osteoblastic tissue: comparison of two- and three-dimensional cultures. Journal of cellular physiology. 226, 2150-2158 (2011).
- Krishnan, V., Vogler, E. A., Sosnoski, D. M., Mastro, A. M. In vitro mimics of bone remodeling and the vicious cycle of cancer in bone. Journal of cellular physiology. 229, 453-462 (2014).
- Bussard, K. M., Venzon, D. J., Mastro, A. M. Osteoblasts are a major source of inflammatory cytokines in the tumor microenvironment of bone metastatic breast cancer. Journal of cellular biochemistry. 111, 1138-1148 (2010).
- Sosnoski, D. M., Krishnan, V., Kraemer, W. J., Dunn-Lewis, C., Mastro, A. M. Changes in Cytokines of the Bone Microenvironment during Breast Cancer Metastasis. International journal of breast cancer. 2012, 160265 (2012).
- Bussard, K. M., et al. Localization of osteoblast inflammatory cytokines MCP-1 and VEGF to the matrix of the trabecula of the femur, a target area for metastatic breast cancer cell colonization. Clinical & experimental metastasis. 27, 331-340 (2010).
- Kuperwasser, C., et al. A mouse model of human breast cancer metastasis to human bone. Cancer research. 65, 6130-6138 (2005).
- Rosenblatt, M. A tale of mice and (wo)men: development of and insights from an 'all human' animal model of breast cancer metastasis to bone. Transactions of the American Clinical and Climatological Association. 123, 135-150 (2012).
- Oh, H. S., et al. Bone marrow stroma influences transforming growth factor-beta production in breast cancer cells to regulate c-myc activation of the preprotachykinin-I gene in breast cancer cells. Cancer research. 64, 6327-6336 (2004).
- Moharita, A. L., et al. SDF-1alpha regulation in breast cancer cells contacting bone marrow stroma is critical for normal hematopoiesis. Blood. 108, 3245-3252 (2006).
- Koro, K., et al. Interactions between breast cancer cells and bone marrow derived cells in vitro define a role for osteopontin in affecting breast cancer cell migration. Breast cancer research and treatment. 126, 73-83 (2011).
- Pohorelic, B., et al. Role of Src in breast cancer cell migration and invasion in a breast cell/bone-derived cell microenvironment. Breast cancer research and treatment. 133, 201-214 (2012).
- Nicola, M. H., et al. Breast cancer micrometastases: different interactions of carcinoma cells with normal and cancer patients' bone marrow stromata. Clinical & experimental metastasis. 20, 471-479 (2003).
- Korah, R., Boots, M., Wieder, R. Integrin alpha5beta1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer research. 64, 4514-4522 (2004).
- Martin, F. T., et al. Potential role of mesenchymal stem cells (MSCs) in the breast tumour microenvironment: stimulation of epithelial to mesenchymal transition (EMT). Breast cancer research and treatment. 124, 317-326 (2010).
- Kapoor, P., Suva, L. J., Welch, D. R., Donahue, H. J. Osteoprotegrin and the bone homing and colonization potential of breast cancer cells. Journal of cellular biochemistry. 103, 30-41 (2008).
- Chen, X., Lu, J., Ji, Y., Hong, A., Xie, Q. Cytokines in osteoblast-conditioned medium promote the migration of breast cancer cells. Tumour biology : the journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine. 35, 791-798 (2014).
- Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35, 2454-2461 (2014).
- Marlow, R., et al. A novel model of dormancy for bone metastatic breast cancer cells. Cancer research. 73, 6886-6899 (2013).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Hutmacher, D. W., et al. Can tissue engineering concepts advance tumor biology research. Trends in biotechnology. 28, 125-133 (2010).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature reviews. Molecular cell biology. 7, 211-224 (2006).
- Hutmacher, D. W. Biomaterials offer cancer research the third dimension. Nature. 9, 90-93 (2010).
- Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in cancer biology. 15, 365-377 (2005).
- Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology advances. 32, 1256-1268 (2014).
- Dhurjati, R., Krishnan, V., Shuman, L. A., Mastro, A. M., Vogler, E. A. Metastatic breast cancer cells colonize and degrade three-dimensional osteoblastic tissue in vitro. Clinical & experimental metastasis. 25, 741-752 (2008).
- Mastro, A. M., Vogler, E. A. A three-dimensional osteogenic tissue model for the study of metastatic tumor cell interactions with bone. Cancer research. 69, 4097-4100 (2009).
- Contag, C. H., et al. Monitoring dynamic interactions between breast cancer cells and human bone tissue in a co-culture model. Molecular imaging and biology : MIB : the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 16, 158-166 (2014).
- Multhaup, M., et al. Cytotoxicity associated with artemis overexpression after lentiviral vector-mediated gene transfer. Human gene therapy. 21, 865-875 (2010).
- Thorne, S. H., et al. CNOB/ChrR6, a new prodrug enzyme cancer chemotherapy. Mol Cancer Ther. 8, 333-341 (2009).
- Mehra, R., et al. Characterization of bone metastases from rapid autopsies of prostate cancer patients. Clin Cancer Res. 17, 3924-3932 (2011).
- Riccio, A. I., Wodajo, F. M., Malawer, M. Metastatic carcinoma of the long bones. Am Fam Physician. 76, 1489-1494 (2007).
- Ahmann, G. J., et al. Effect of tissue shipping on plasma cell isolation, viability, and RNA integrity in the context of a centralized good laboratory practice-certified tissue banking facility. Cancer epidemiology, biomarkers & prevention : a publication of the American Association for Cancer Research, cosponsored by the American Society of Preventive Oncology. 17, 666-673 (2008).
