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Medicine

संवर्धन मानव जांध की हड्डी ऊतक Explants के लिए तरीके Metastatic आला की स्तन कैंसर कोशिका औपनिवेशीकरण अध्ययन करने के लिए

Published: March 15, 2015 doi: 10.3791/52656
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 1
1Department of Pediatrics, Stanford University School of Medicine, 2Department of Orthopaedic Surgery, Stanford University School of Medicine

Summary

प्रोटोकॉल एक मानव हड्डी के ऊतकों explant मॉडल प्रणाली में स्तन कैंसर के सेल प्रवास, प्रसार और उपनिवेशवाद के अध्ययन के लिए वर्णित हैं।

Abstract

अस्थि स्तन कैंसर मेटास्टेसिस का सबसे आम साइट है। यह व्यापक रूप से microenvironment प्रभावों कैंसर सेल व्यवहार स्वीकार किया है कि हालांकि, छोटे से मानव हड्डी के ऊतकों की देशी microenvironment भीतर स्तन कैंसर कोशिका के गुण और व्यवहार के बारे में जाना जाता है। हम ट्रैक, यों और की microenvironment के भीतर मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं को व्यवस्थित करना दृष्टिकोण विकसित किया है कुल हिप रिप्लेसमेंट सर्जरी निम्नलिखित त्याग और्विक सिर से अलग सुसंस्कृत मानव अस्थि ऊतक टुकड़े। स्तन कैंसर की कोशिकाओं luciferase के लिए इंजीनियर और हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) अभिव्यक्ति बढ़ाया का उपयोग करना, हम reproducibly के बाद स्तन कोशिकाओं प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग हड्डी के टुकड़े के भीतर bioluminescence इमेजिंग का उपयोग प्रवास और प्रसार पैटर्न (BLI), ट्रैक सेल बातचीत quantitate, और मूल्यांकन करने में सक्षम हैं फ्लो के साथ बसाना। इस मॉडल की कुंजी लाभ में शामिल हैं: 1) एक देशी, वास्तुकला बरकरार ऊतक microeप्रासंगिक मानव कोशिका प्रकार शामिल हैं, और तेजी से मात्रात्मक और गुणात्मक निगरानी और स्तन और हड्डी सेल गुण, व्यवहार और बातचीत की गड़बड़ी की सुविधा जो microenvironment, 2) सीधी पहुँच कि nvironment। एक प्राथमिक सीमा, वर्तमान में, अल्पकालिक संस्कृति के अध्ययन की खिड़की किनारा जो ऊतक टुकड़े, के परिमित व्यवहार्यता है। मॉडल प्रणाली के आवेदन मेटास्टैटिक आला के भीतर स्तन कैंसर और अन्य हड्डी की मांग दुर्दमताओं के बुनियादी जीव विज्ञान का अध्ययन, और प्रभावी ढंग से हड्डी के ऊतकों में स्तन कैंसर की कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए चिकित्सकीय रणनीति विकसित करने में शामिल हैं।

Introduction

ट्यूमर microenvironment व्यापक रूप से स्तन कैंसर की प्रगति और मेटास्टेटिक दौरान कैंसर सेल व्यवहार का एक महत्वपूर्ण निर्धारक के रूप में मान्यता प्राप्त है 1-3 फैल गया। यहाँ प्रस्तुत पद्धति का लक्ष्य मानव हड्डी के ऊतकों, स्तन कैंसर मेटास्टेसिस 4-6 की सबसे लगातार साइट की microenvironment भीतर स्तन कैंसर की कोशिकाओं के अध्ययन की सुविधा के लिए है। अस्थि मेटास्टैटिक प्रगति 10,11 में फंसा कोशिकाओं और स्रावित कारकों बंदरगाह, जो दोनों के mineralized और मज्जा डिब्बों 7-9, के शामिल है। व्यापक रूप से विवो माउस मॉडल में इस्तेमाल किया यद्यपि मेटास्टैटिक प्रक्रिया 12-15 के प्रणालीगत अध्ययन की सुविधा, कंकाल के भीतर सेल बातचीत अवलोकन और प्रत्यक्ष गड़बड़ी के लिए आसानी से सुलभ नहीं हैं। अध्ययन और माउस हड्डी के ऊतकों और माउस मज्जा कोशिकाओं संवर्धन के लिए मॉडल प्रणाली बेहतर पहुंच और स्तन कैंसर सेल एम अंतर्निहित कई crosstalk के बारे में अंतर्दृष्टि और तंत्र झुकेंगेmurine कंकाल 16-22 की etastasis। हालांकि, अध्ययन की हड्डी के ऊतकों 23,24 के लिए osteotropism की प्रजाति विशिष्ट पैटर्न वहाँ हो सकता है कि सुझाव दिया है। इन नमूनों की हड्डी की संभावना निर्धारक हैं, जो सभी के निहित प्रजाति विशेष के अस्थि ऊतक गुणों में मतभेद, प्रतिरक्षा की कमी चूहों 11 में बदल अस्थि मज्जा आबादी से उत्पन्न मतभेद, और / या प्रयोगों में इस्तेमाल चूहों के अपेक्षाकृत कम उम्र, प्रतिबिंबित कर सकता है माइक्रोएन्वायरमेंट।

इन विट्रो में आम तौर पर इस तरह के मज्जा व्युत्पन्न अस्थिकोरक या monolayers के रूप में सुसंस्कृत stromal कोशिकाओं के रूप में या इंजीनियर तीन आयामी मॉडल प्रणाली 25-35 के भीतर विशिष्ट हड्डी प्रकार की कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित किया है मानव हड्डी सह संस्कृतियों में स्तन कैंसर की कोशिकाओं के अध्ययन के लिए दृष्टिकोण। दो आयामी सेल संस्कृति मॉडल में इन विट्रो का मुख्य आधार का गठन कैंसर अनुसंधान के लिए दृष्टिकोण है, यद्यपि यह लंबे समय तक सेल व्यवहार मौलिक मीटर में बदल दिया है कि मान्यता प्राप्त किया गया हैसंस्कृति प्रणालियों 18,36,37 onolayer। इस matrix- और ऐसे कोलेजन के रूप में प्राकृतिक सामग्री से बना पाड़ आधारित मॉडल सहित तीन आयामी जीवित ऊतकों की जटिलता, कि नकल इंजीनियर microenvironments के विकास के लिए नेतृत्व किया गया है, या सिंथेटिक पॉलिमर ऊतक की तरह microenvironments बनाने के लिए विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त 36-41। इंजीनियर दृष्टिकोण भी नियंत्रित करने और microenvironment 18,19,41-43 का हार्मोनल परिवेश का अध्ययन करने के बायोरिएक्टर प्लेटफार्मों का उपयोग भी शामिल है। Biomimetic मॉडल और बायोरिएक्टर एक नियंत्रण स्थापित करने में एक जटिल ऊतक microenvironment के कई तत्व प्रदान करते हैं, और सफलतापूर्वक हड्डी 18,19,35,42,43 को स्तन कैंसर मेटास्टेसिस के अध्ययन के लिए अग्रिम के लिए लागू किया गया है, इंजीनियर मॉडल प्रणाली आम तौर पर शामिल नहीं है देशी हड्डी पर्यावरण के भीतर मौजूद प्रकार की कोशिकाओं और बाह्य मैट्रिक्स घटकों का पूरा स्पेक्ट्रम।

अभी हाल तक, स्तन कैंसरकोशिकाओं से मानव हड्डी के ऊतकों की देशी, अक्षत, तीन आयामी microenvironment के भीतर का अध्ययन नहीं किया गया है। हमने हाल ही में (THR) सर्जरी 44 नमूनों कुल हिप रिप्लेसमेंट से अलग मानव अस्थि ऊतक टुकड़े का उपयोग कर एक सह संस्कृति मॉडल के विकास की सूचना दी। इन नमूनों दोनों अल्पकालिक संस्कृति में सूक्ष्म मेटास्टेसिस अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए आवश्यक mineralized और मज्जा डिब्बों बंदरगाह। पिछले काम में हम हड्डी के टुकड़े 44 के साथ (एमडीए MB-231-fLuc) के सह-सुसंस्कृत luciferase व्यक्त स्तन कैंसर कोशिकाओं के प्रसार की निगरानी के लिए bioluminescence इमेजिंग (BLI) प्रयोग करने के लिए सबूत की सिद्धांत की स्थापना की। यहाँ हम मानव अस्थि ऊतक explants का उपयोग कर देशी microenvironment के संदर्भ में स्तन सेल कैंसर प्रसार, उपनिवेशन, और प्रवास के अध्ययन के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल विस्तृत प्रस्तुत करते हैं।

पहले हम स्तन को मापने के लिए हड्डी के टुकड़े करने के लिए आसन्न सह संवर्धन स्तन कैंसर की कोशिकाओं के लिए एक प्रोटोकॉल पेशBLI का उपयोग करते हुए सेल प्रसार। इस खंड में, स्तन सेल निलंबन हड्डी मोम के टुकड़े से स्थिर हैं, जो हड्डी के टुकड़े, से सटे 6 अच्छी तरह प्लेटें में सेल धब्बे के रूप में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं। नियंत्रण कुओं हड्डी मोम, लेकिन कोई हड्डी टुकड़ा होते हैं। सेल स्पॉट देते हैं एक बार, मध्यम जोड़ा और प्लेट BLI से मापा जाता है bioluminescent संकेत तीव्रता (सेल नंबर के साथ जुड़े), जिसके बाद 24 घंटा, के लिए सुसंस्कृत है। अगले चरण में हम उपनिवेशवाद और प्रसार का अध्ययन करने के लिए हड्डी के टुकड़े पर सीधे वरीयता प्राप्त सह संवर्धन स्तन कैंसर की कोशिकाओं के लिए तरीके प्रस्तुत करते हैं। यहाँ स्तन सेल निलंबन बसाना और सेल नंबर ट्रैक करने के लिए समय के साथ BLI और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा संस्कृति में निगरानी कर रहे हैं जो अस्थि ऊतक टुकड़े, पर सीधे pipetted हैं। इस विधि में, मज्जा डिब्बे प्रवाह cytometry द्वारा उपनिवेश स्तन कैंसर की कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए किसी भी समय बिंदु पर हड्डी के टुकड़े से प्लावित, या मज्जा व्यवहार्यता assays के किया जा सकता है।

इसके अलावा, हम डीस्तन कैंसर के सेल प्रवास को मापने के लिए मुंशी दो अलग अलग दृष्टिकोण। पहली विधि में चरणों की हड्डी के ऊतकों संस्कृति supernatants की ओर प्रवास को मापने के लिए रेखांकित कर रहे हैं। Transwell के भीतरी, ऊपरी सतहों एक 8 माइक्रोन रोमकूप आकार के साथ झिल्ली डालने पर (चित्रा 1 ए में दिखाया गया है) इस प्रोटोकॉल में स्तन कैंसर की कोशिकाओं वरीयता प्राप्त कर रहे हैं। सम्मिलित करता है तो हड्डी के ऊतकों पर तैरनेवाला या नियंत्रण मध्यम युक्त कुओं के साथ एक रिसीवर थाली में रखा जाता है। एक 20 घंटा ऊष्मायन अवधि के दौरान, स्तन कैंसर की कोशिकाओं की कम संख्या के नीचे वे BLI द्वारा पता लगाने के लिए देते हैं, जहां कम टिशू कल्चर कुओं में डालने झिल्ली के माध्यम से विस्थापित। दूसरा माइग्रेशन विधि में स्तन कैंसर की कोशिकाओं को Transwell डालने झिल्ली के निचले, बाहरी सतहों पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं। , अस्थि ऊतक टुकड़े डालने कप में रखा जाता है और स्तन कैंसर की कोशिकाओं (चित्रा 1 बी में दिखाया गया है) हड्डी के टुकड़े उपनिवेश स्थापित करने की झिल्ली के माध्यम से ऊपर की ओर पलायन जोतो BLI का उपयोग imaged कर रहे हैं।

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Protocol

और्विक सिर मेडिसिन के स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय के स्कूल में हड्डी रोग सर्जरी विभाग में वैकल्पिक टीहृदय सर्जरी के दौर से गुजर रोगियों से एकत्र किए गए थे। सभी ऊतकों स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय के अनुसंधान अनुपालन कार्यालय के नियमों के अनुसार डे-पहचान नमूनों के रूप में एकत्र किए गए थे।

1। एक स्तन कैंसर कोशिका लाइन (एस) का चयन

  1. प्राप्त या एक luciferase-GFP संवाददाता निर्माण के साथ वांछित स्तन कैंसर कोशिका लाइन (एस) के transfect। निम्नलिखित प्रयोगों स्लीपिंग ब्यूटी transposon प्लाज्मिड pKT2 / LuBiG साथ अभिकर्मक से एमडीए MB-231 और MCF 7 स्तन कैंसर कोशिका लाइनों जुगनू luciferase के स्थिर अभिव्यक्ति के लिए इंजीनियर (fLuc) और बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) का उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया गया और transposase प्लाज्मिड पी / hUbiC-SB11 45,46।
    नोट: ट्रांसफ़ेक्ट सेल लाइनों एमडीए MB-231-fLuc-EGFP, और MCF 7-fLuc-EGFP के रूप में करने के लिए भेजा जाता है।

2. अलग ऊतक एफऔर्विक सिर से ragments

  1. टीहृदय सर्जरी के बाद, शारीरिक खारा से भरा एक बाँझ कंटेनर में खारिज और्विक सिर इकट्ठा। प्रयोगशाला के लिए नमूना स्थानांतरण और सर्जरी के 1-3 घंटा के भीतर यह प्रक्रिया। नोट: प्रसंस्करण में देरी होती है, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना जगह है।
  2. प्रयोग के प्रत्येक प्रकार के लिए नीचे दिए गए निर्धारित बाँझ दस्ताने, सर्जिकल rongeur, संदंश, बीकर 70% isopropanol के साथ उपकरणों, और टिशू कल्चर जहाजों कुल्ला करने के लिए: एक लामिना का प्रवाह टिशू कल्चर हुड में एक शोषक चटाई पर निम्न आइटम रखकर एक क्षेत्र में काम करने को तैयार ।
  3. एक बाँझ सर्जिकल दस्ताने पहने हुए, एक हाथ में गोल फीमर सिर पकड़ फीमर के उजागर ऊपरी शाफ्ट से वांछित आकार (~ 2-5 मिमी) की घरनदार हड्डी के टुकड़े को निकालने के लिए दूसरे हाथ में rongeur उपयोग करने के लिए। संस्कृति पोत में हड्डी के टुकड़े हस्तांतरण (जैसे, 6-, 12-, या टिशू कल्चर प्लेट या प्रवास चैम्बर 24 अच्छी तरह से), प्रसार के प्रकार पर निर्भर करता है, कर्नलonization या प्रवास प्रयोग, चरण 3, 4 या 5 में वर्णित है।
    नोट: प्रत्येक विशिष्ट प्रसार, उपनिवेशन या प्रवास परख के लिए प्रारंभिक चरणों को पूरा करने के बाद ऊपर वर्णित के रूप में अस्थि ऊतक टुकड़े काटा जाना चाहिए। चित्रा 2 में दिखाया गया है टुकड़े आकार में लेकर जाएगा। टुकड़े से पहले या मानकीकरण के प्रयोजन के लिए प्रयोगों के बाद तौला जा सकता है।

हड्डी के टुकड़े से सटे 3. सह संवर्धन स्तन कैंसर की कोशिकाओं BLI का प्रयोग स्तन सेल प्रसार करने के लिए उपाय

  1. पहले प्रयोग करने के लिए, 2 एक्स 10 5 स्तन कैंसर की कोशिकाओं / 50 μl युक्त निलंबन तैयार करते हैं, और संस्कृति में हड्डी के टुकड़े immobilizing के लिए हड्डी मोम के प्लग तैयार करते हैं। तीन टुकड़ों में एक P200 micropipette टिप कट और हड्डी मोम के छोटे (~ 35 मिलीग्राम) टुकड़ों में कटौती के लिए एक "कुकी कटर" तरीके में सबसे बड़ा टुकड़ा की संकीर्ण अंत का उपयोग करें। एक पेट्री डिश में हड्डी मोम प्लग बेदखल करने के लिए छोटी से छोटी टुकड़ा के व्यापक अंत का प्रयोग करेंभंडारण के लिए।
  2. प्रत्येक अच्छी तरह से 00:00 के स्थान पर हड्डी मोम का एक टुकड़ा रखें और धीरे से एक बाँझ-दस्ताने तर्जनी के साथ नीचे दबाएँ।
  3. पिपेट 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह के केंद्र में DMEM-10% FBS के + पेन Strep में 1 एक्स 10 5 स्तन कैंसर की कोशिकाओं से युक्त सेल निलंबन के 50 μl। (वैकल्पिक रूप से, अगर वांछित एक छितरी पैटर्न में बीज कोशिकाओं।) सेल लगाव को बढ़ावा देने के लिए 45 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में थाली प्लेस।
  4. प्रत्येक प्रयोगात्मक लिए अच्छी तरह से हड्डी मोम के एक टुकड़े पर एक हड्डी टुकड़ा प्लेस और यह सुरक्षित करने के लिए rongeur साथ कोमल दबाव लागू होते हैं। नीचे तीन कुओं केवल नियंत्रण के रूप में हड्डी मोम होते हैं, जबकि एक दिया टीहृदय नमूना से ऐसी है कि तीन हड्डी के टुकड़े शीर्ष तीन कुओं में रखा जाता है तीन प्रतियों में प्रयोगों प्रदर्शन।
  5. एक 5 मिलीलीटर विंदुक का प्रयोग, धीरे और धीरे धीरे स्तन कोशिकाओं या हड्डी के टुकड़े dislodging से बचने के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक की ओर करने के लिए DMEM-10% FBS की 5 मिलीलीटर उद्धार। एक 37 में थाली प्लेस76, 20-24 घंटे के लिए सी टिशू कल्चर इनक्यूबेटर।
  6. Bioluminescence इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए (BLI) इनक्यूबेटर से थाली निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए (300 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल के एक एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए) luciferin सब्सट्रेट जोड़ें। छवि निम्नलिखित मानकों का उपयोग कर एक IVIS इमेजिंग मंच पर तुरंत प्लेट: 1 की एफ बंद करो, छोटे binning, 1 सेकंड का समय जोखिम के स्तर डी संकेत प्रत्येक की तीव्रता में अच्छी तरह से औसत चमक (फोटॉनों / दूसरा / वर्ग सेंटीमीटर / उपाय steradian)।
  7. सभी प्रयोगात्मक और नियंत्रण कुओं के लिए औसत चमक quantitate के लिए ब्याज (आरओआई) के क्षेत्रों को परिभाषित करने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें। एक एक्सेल शीट को निर्यात औसत चमक मूल्यों आँकड़े प्रदर्शन और रेखांकन उत्पन्न करने के लिए।

हड्डी के टुकड़े पर सीधे वरीयता प्राप्त 4. सह संवर्धन स्तन कैंसर की कोशिकाओं औपनिवेशीकरण और सेल नंबर का अध्ययन करने के लिए

  1. 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट के खाली कुओं में सीधे हड्डी के टुकड़े जगह (1 टुकड़ा / अच्छी तरह से) संदंश का प्रयोग करें।
  2. रंजसीधे प्रत्येक हड्डी टुकड़ा के शीर्ष पर एक एक्स 03-06 अक्टूबर को स्तन कैंसर कोशिकाओं से युक्त DMEM-10% FBS की एक 50 μl सेल निलंबन छोटी बूंद ette। सेल लगाव को बढ़ावा देने के लिए 45 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में थाली प्लेस। धीरे टुकड़ा पूरी तरह से मध्यम में डूबे हुए है कि हर अच्छी तरह से इस तरह के पक्ष में 1-2 मिलीलीटर DMEM-10% FBS के जोड़ें। 20-24 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में थाली सेते हैं।
  3. ऊष्मायन के बाद, प्रत्येक कुएं में एक मिलीलीटर DMEM-10% FBS युक्त एक ताजा 24 अच्छी तरह से थाली करने के लिए प्रत्येक हड्डी के ऊतकों टुकड़ा हस्तांतरण करने के लिए संदंश का उपयोग करें। BLI प्रदर्शन करने के लिए, कदम 3.6-3.7 से ऊपर का पालन करें। इसके अतिरिक्त, टुकड़े एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करके देखा, या चरण 6 में वर्णित के रूप में स्तन कैंसर के सेल नंबर और गुणों का विश्लेषण के लिए मज्जा आबादी प्राप्त करने के लिए प्लावित हो सकता है।
  4. BLI, पिपेट फ्लोरोसेंट बिसफ़ॉस्फ़ोनेट लेबलिंग समाधान के 5 μl (पूर्व निम्न प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा गुणात्मक मूल्यांकन के लिए बरकरार टुकड़े तैयार करने के लिएहड्डी के टुकड़े की mineralized spicules लेबल करने के लिए प्रत्येक कुएं में) निर्माता के निर्देशों के अनुसार मुकाबले। एक और 24 घंटे के लिए टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में थाली सेते हैं।
  5. फ्लोरोसेंट बिसफ़ॉस्फ़ोनेट लेबलिंग समाधान में संस्कृति के 24 घंटा के बाद, छवि GFP (485 एनएम) और बिसफ़ॉस्फ़ोनेट लेबल (680 एनएम) करने के लिए विन्यस्त एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग फिनोल लाल मुक्त मध्यम और देखें युक्त टिशू कल्चर प्लेटों के टुकड़े हस्तांतरण करने के लिए संदंश का उपयोग करें।

5. अस्थि ऊतक टुकड़े और सुसंस्कृत अस्थि टुकड़ा Supernatants को स्तन कैंसर की कोशिकाओं के प्रवासन मापने

  1. अस्थि ऊतक संस्कृति सतह पर तैरनेवाला की ओर प्रवासन।
    नोट: तीन प्रतियों में एक दिया टीहृदय नमूना से ऐसी है कि तीन टुकड़े प्रयोगों प्रदर्शन तीन supernatants उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। एक प्रयोग के लिए, माइग्रेशन हड्डी supernatants बनाम नियंत्रण मध्यम केवल युक्त तीन कुओं से युक्त तीन कुओं भर तुलना में है।
    1. हड्डी आज़ादी उत्पन्नअच्छी तरह से प्रति 2.2 मिलीलीटर DMEM-10% FBS युक्त एक 12 अच्छी तरह से थाली के कुओं में हड्डी के टुकड़े रखकर supernatants के खिलाफ मुकदमा। 24 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में संस्कृति। 24 घंटा में मध्यम वापस लेने और 2.2 मिलीलीटर ताजा DMEM-10% FBS के साथ की जगह। DMEM-10% FBS के एक ही तरह से युक्त दावत नियंत्रण कुओं।
      नोट: मध्यम सर्जरी से उत्पन्न ऊतक आघात के जवाब में स्रावित कारकों को दूर करने के लिए 24 घंटे में बदल गया है। हड्डी के ऊतकों supernatants में उत्पन्न कर रहे हैं क्योंकि केवल स्तन कैंसर के सेल प्रवास के लिए FBS की योगदान के लिए नियंत्रित करने के लिए शामिल किए गए हैं FBS के युक्त मध्यम युक्त मध्यम, कुओं FBS के युक्त।
    2. 48 घंटा में, एक रिसीवर थाली के कुओं में हर सतह पर तैरनेवाला / नियंत्रण मध्यम और पिपेट की 0.9 मिलीलीटर इकट्ठा। आवेषण बाद में इन कुओं में रखा जाएगा। आवेषण बोने जबकि टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में रिसीवर थाली सेते हैं। नोट: शेष सतह पर तैरनेवाला (~ वाष्पीकरण के बाद 1 मिलीलीटर) secretome कार्योत्तर के विश्लेषण के लिए एकत्र किया जा सकता हैरुपये अगर 44 वांछित।
    3. Transwell आवेषण बीज के लिए, एक मानक, खाली 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर थाली में उन्हें जगह है। चित्रा 1 ए में दिखाया गया के रूप में प्रत्येक डालने के ऊपरी, भीतरी झिल्ली की सतह पर DMEM-10% FBS के में 1 एक्स 10 5 स्तन कैंसर की कोशिकाओं से युक्त पिपेट 350 μl सेल निलंबन। लगाव को बढ़ावा देने के लिए 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में वरीयता प्राप्त आवेषण युक्त 24 अच्छी तरह से थाली रखें।
    4. कोशिकाओं आवेषण के साथ संलग्न किए जाने के बाद, निर्माता के निर्देशों के अनुसार रिसीवर थाली करने के लिए सम्मिलित करता है हस्तांतरण करने के लिए संदंश का उपयोग करें। एंगल डालने झिल्ली और अच्छी तरह से सतह पर तैरनेवाला रिसीवर के बीच बुलबुला बनने से रोकने के लिए अच्छी तरह से रिसीवर में रखकर जब प्रत्येक डालने। एक 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 20 घंटे के लिए आवेषण के साथ रिसीवर थाली सेते हैं।
      नोट: डालने झिल्ली और अच्छी तरह से supernatan रिसीवर के बीच बुलबुले के लिए रिसीवर प्लेट के नीचे की ओर जाँचेंटी। बुलबुले दिखाई दे रहे हैं, तो विशिष्ट आवेषण को हटा दें और कोई बुलबुले मौजूद हैं जब तक अच्छी तरह से रिसीवर में फिर उन्हें जगह है।
    5. 20 घंटा उपयोग संदंश के बाद रिसीवर थाली से सम्मिलित करता है हटाने के लिए। चरणों में प्रक्रियाओं का उपयोग 3.6-3.7 छवि के लिए में चले गए और रिसीवर थाली कुओं के नीचे से जुड़ी कोशिकाओं है कि BLI प्रदर्शन करते हैं।
  2. अस्थि ऊतक टुकड़े की ओर प्रवासन।
    नोट: तीन प्रतियों में एक दिया टीहृदय नमूना से ऐसी है कि तीन टुकड़े प्रयोगों प्रदर्शन तीन अलग आवेषण में रखा जाता है, और तीन गिलास मोती नियंत्रण के रूप में तीन अलग आवेषण में रखा जाता है।
    1. अच्छी तरह से प्रत्येक में 0.9 मिलीलीटर DMEM-10% FBS के pipetting द्वारा रिसीवर थाली तैयार है। आवेषण तैयार करते समय टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में रखें।
    2. आवेषण बीज के लिए, एक ढक्कन है कि एक प्लास्टिक microfuge ट्यूब बॉक्स की सतह पर उन्हें पलटना। 1 एक्स 10 5 स्तन कैंसर की कोशिकाओं को घ युक्त DMEM-10% FBS की एक 50 μl सेल निलंबन छोटी बूंद पिपेटirectly (उल्टे सम्मिलित करता है पर ऊपर का सामना करना पड़ रहा है) प्रत्येक डालने झिल्ली के बाहरी, नीचे की सतह पर। ढक्कन के साथ microfuge ट्यूब बॉक्स खुला फटा कवर और सेल लगाव को बढ़ावा देने के लिए 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस ऊतक इनक्यूबेटर को हस्तांतरण।
    3. टिशू कल्चर हुड के लिए microfuge ट्यूब बॉक्स स्थानांतरण, और दाईं ओर ऊपर वरीयता प्राप्त आवेषण बारी और रिसीवर थाली के कुओं में उन्हें स्थानांतरित करने के लिए संदंश का उपयोग करें। प्रत्येक डालने कप में पिपेट 0.450 मिलीलीटर DMEM-10% FBS के। संदंश का प्रयोग, प्रत्येक तैयार डालने कप में एक हड्डी के ऊतकों टुकड़ा (~ 3 मिमी) हस्तांतरण। वैकल्पिक रूप से, अतिरिक्त कुओं में कांच के मोती के रूप में नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करें। 20 घंटे के लिए एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में थाली प्लेस।
    4. माइग्रेशन मापने के लिए, अच्छी तरह से प्रति एक मिलीलीटर DMEM-10% FBS युक्त एक मानक 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट तैयार करते हैं। इनक्यूबेटर से रिसीवर थाली निकालें और मानक थाली की अलग कुओं में से प्रत्येक से सम्मिलित हड्डी के टुकड़े और मोती हस्तांतरण करने के लिए संदंश का उपयोग करें। Luciferin जोड़ेंसब्सट्रेट अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए (300 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए) और कदम 3.6-3.7 में प्रक्रियाओं का उपयोग BLI प्रदर्शन करते हैं।

6. अतिरिक्त पूर्व और बाद प्रयोगात्मक विश्लेषण

  1. प्लावित मज्जा का विश्लेषण।
    1. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के शीर्ष पर रखा एक 70 माइक्रोन सेल झरनी में एक हड्डी टुकड़ा स्थानांतरण। सख्ती शंक्वाकार ट्यूब में मज्जा कोशिकाओं के निलंबन प्राप्त करने के लिए पीबीएस के 10 एमएल के साथ टुकड़ा फ्लश करने के लिए एक 25 जी सुई के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग करें। अपकेंद्रित्र सेल निलंबन 300 XG पर 3 मिनट और 21 डिग्री सेल्सियस के लिए, सतह पर तैरनेवाला aspirate और पीबीएस में pelleted कोशिकाओं या फ्लो के लिए अन्य वांछित समाधान resuspend।
      नोट: Resuspension संस्करणों centrifugation के, और आवेदन के बाद सेल गोली के आकार के आधार पर अलग अलग होंगे।
    2. व्यवहार्यता assays के लिए पीबीएस के ~ 75-300 μl संस्करणों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध fluorescenc का उपयोग कर उपयुक्त हैं, और इन निलंबन का विश्लेषण किया जा सकता हैई आधारित व्यवहार्यता assays के निर्माता के निर्देशों के अनुसार, एक पारंपरिक hemocytometer में pipetted, और एक औंधा प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग गिना।
    3. प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए या GFP पॉजिटिव स्तन कैंसर की कोशिकाओं का पता लगाने पर आधारित छँटाई, 2% FBS के, 2mm EDTA युक्त 1 मिलीलीटर पीबीएस में सेल गोली resuspend, और 10 एकाग्रता 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल है मिमी HEPES ऐसा है कि।
  2. एच एंड ई धुंधला और immunohistochemistry।
    1. Hematoxylin और eosin (एच एंड ई) धुंधला और / या immunohistochemistry के लिए टुकड़ों को संसाधित करने के लिए, एक नंबर 2 पेंसिल के साथ लेबल प्लास्टिक कैसेट में टुकड़े जगह है, और 24 घंटे के लिए 10% बफर formalin से भरा एक कंटेनर में डूब।
    2. आयल embedding के लिए प्रक्रिया ऊतकों, सेक्शनिंग और प्रत्येक टुकड़ा के भीतर mineralized spicules के लिए खाते में एक विकैल्सीकरण कदम भी शामिल है कि दिनचर्या प्रोटोकॉल का उपयोग धुंधला हो जाना।

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Representative Results

और्विक सिर से ऊतक टुकड़े को अलग-थलग

और्विक सिर पुरुष और मेडिसिन के स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय के स्कूल में हड्डी रोग सर्जरी विभाग में वैकल्पिक विषय के कुल हिप रिप्लेसमेंट सर्जरी के दौर से गुजर महिला रोगियों (उम्र के 44-90 वर्ष) के बराबर संख्या से एकत्र किए गए थे। प्रत्येक त्याग और्विक सिर mineralized spicules और मज्जा से बना घरनदार हड्डी के ऊतकों बंदरगाहों जो ऊपरी फीमर, के एक छोटे से हिस्से में शामिल है। इस ऊतक छोटे टुकड़े को निकालने के लिए एक शल्य rongeur का उपयोग कर शाफ्ट (2A चित्रा) की शल्य चिकित्सा द्वारा उजागर पार अनुभाग के माध्यम से सुलभ है। निकाले टुकड़े के ऊतक विज्ञान mineralized और मज्जा घटकों का खुलासा, चित्रा 2B में दिखाया गया है। चित्रा -2 के रूप में दिखाया निकाले टुकड़े की उपस्थिति मज्जा की adipocyte सामग्री के आधार पर पीले रंग से लाल से लेकर विभिन्न रोगियों से प्राप्त और्विक सिर, भर में बदलता है। डब्ल्यूई luciferase और EGFP अभिव्यक्ति के लिए इंजीनियर स्तन कैंसर कोशिकाओं के साथ गतिशील बातचीत को मापने के लिए लघु अवधि के assays में इन अस्थि ऊतक टुकड़े का उपयोग प्रदर्शित करता है।

आसन्न हड्डी के टुकड़े करने के लिए सह संवर्धन स्तन कैंसर की कोशिकाओं Bioluminescence इमेजिंग का उपयोग स्तन सेल प्रसार करने के लिए उपाय

BLI का उपयोग कर स्तन सेल प्रसार को मापने के लिए स्थिर हड्डी के टुकड़े करने के लिए आसन्न सह संवर्धन एमडीए MB-231-fLuc-EGFP के स्तन कैंसर की कोशिकाओं के लिए संस्कृति की थाली सेटअप चित्रा 3A में दिखाया गया है। हड्डी के टुकड़े के अभाव चित्रा -3 सी में दिखाया गया है बनाम 24 घंटा में थाली के BLI उपस्थिति में बढ़ाया सेल प्रसार का प्रदर्शन, तीन प्रयोगों से BLI संकेत 3B चित्रा में सचित्र, और कर रहा है।

हड्डी के टुकड़े पर सीधे वरीयता प्राप्त सह संवर्धन स्तन कैंसर की कोशिकाओं औपनिवेशीकरण और सेल नंबर का अध्ययन करने के लिए

एमसीएफ-7-fLuc-EGFP सी का औपनिवेशीकरणचित्रा -4 ए में सचित्र है 24 घंटा में BLI के माध्यम के रूप में मापा एल गिरते बोने घनत्व के साथ जुड़े संकेत कमी आई प्रदर्शन, अस्थि ऊतक टुकड़े पर सीधे वरीयता प्राप्त। एक सीधे-वरीयता प्राप्त टुकड़ा mineralized और मज्जा डिब्बों के भीतर स्तन कैंसर की कोशिकाओं की बसाना प्रकट करने के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged के रूप में, फ्लोरोसेंट biphosophonate अभिकर्मक के साथ लेबलिंग के बाद, 4B चित्रा में 48 घंटा में दिखाया गया है। ये बसाना पैटर्न भी cytokeratin एंटीबॉडी (आंकड़े 4C और 4D) के साथ immunohistochemical धुंधला के लिए पोस्ट-प्रयोगात्मक संसाधित सीधे वरीयता प्राप्त टुकड़ों में पता चला रहे हैं।

अस्थि ऊतक टुकड़े और सुसंस्कृत अस्थि टुकड़ा Supernatants को स्तन कैंसर की कोशिकाओं के प्रवासन मापने

अस्थि ऊतक संस्कृति supernatants की ओर और हड्डी के टुकड़े में झरझरा प्रवास झिल्ली भर में एमडीए-231-fLuc-EGFP कोशिकाओं के प्रवास बी के साथ पाया जाता हैचित्रा 5 में दिखाया ली के रूप में एक दिया THR के नमूना के तीन टुकड़े से व्युत्पन्न संस्कृति supernatants की ओर एक मजबूत प्रवास पैटर्न नियंत्रण मध्यम बनाम अस्थि ऊतक सतह पर तैरनेवाला युक्त कुओं में प्रवास में वृद्धि हुई दर्शाया गया है जो चित्रा 5 ए, में दिखाया गया है। नहीं सभी माइग्रेशन पैटर्न हालांकि हड्डी supernatants की ओर इस मजबूत, माइग्रेशन सबसे प्रयोगों में नियंत्रण मध्यम की ओर से आम तौर पर अधिक से अधिक है। एक दिया टीहृदय नमूना से हड्डी के टुकड़े में एक ठेठ प्रवास पैटर्न चित्रा 5 ब में दिखाया गया है।

प्लावित marrows का विश्लेषण

इसके अलावा, हम मज्जा कोशिकाओं उपनिवेश टुकड़े से प्लावित किया जा सकता है कि उदाहरण देकर स्पष्ट करना, और कहा कि प्लावित स्तन कैंसर की कोशिकाओं फ्लो (चित्रा 6B), BLI (चित्रा 6C) द्वारा इन कोशिकाओं के बीच में पता लगाया जा सकता है, और / या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (चित्रा 6D) ।

मापने व्यवहार्यता

7 चित्र में दिखाया जाता है के बाद 4 THR के नमूनों से अस्थि ऊतक टुकड़े से प्लावित मज्जा की कोशिकाओं के लिए विशिष्ट viabilities।

चित्र 1

चित्रा 1: माइग्रेशन प्रयोगों के सेट करें। "आगे माइग्रेशन" प्रयोगों में (ए), रिसीवर थाली कुओं पहले से उत्पन्न अस्थि ऊतक संस्कृति supernatants से भर रहे हैं। डीएमई-10% FBS युक्त डालने कप में Transwell झिल्ली के भीतर की ऊपरी सतहों पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं कि स्तन कैंसर की कोशिकाओं की झिल्ली के माध्यम से विस्थापित और BLI द्वारा पता लगाने के लिए कुओं की तह तक देते हैं।

चित्र 2
चित्रा 2: और्विक सिर से ऊतक टुकड़े अलग। (ए) के एक शल्य rongeur का उपयोग कर घरनदार हड्डी के टुकड़े निकालने। (बी) प्रोटोकॉल फीमर ऊतक से निकालने के बाद तुरंत तय टुकड़ा की mineralized (सफेद तीर) और मज्जा (काला तीर) डिब्बों दिखा। (सी) trabecular हड्डी के टुकड़े दो अलग से निकाला लाल बनाम पीले मज्जा सामग्री में भिन्नता का प्रदर्शन और्विक सिर। (बी) अनुमति 44 के साथ reproduced।

चित्र तीन
चित्रा 3: bioluminescence इमेजिंग का उपयोग कर स्तन सेल प्रसार को मापने के लिए हड्डी के टुकड़े करने के लिए आसन्न सह संवर्धन स्तन कैंसर की कोशिकाओं। (ए) के सह संवर्धन तीर द्वारा संकेत के रूप में स्थिर हड्डी के टुकड़े करने के लिए आसन्न एमडीए MB-231-fLuc-EGFP के स्तन कैंसर की कोशिकाओं, के लिए संस्कृति की थाली स्थापना: सेल स्पॉट (नीला), हड्डी मोम (काला), और हड्डी टुकड़ा (लाल )। हड्डी मोम की स्थिति भी एक काला बिंदीदार चक्र से उल्लेख किया है। थाली मध्यम के अलावा पहले दिखाया गया है। शीर्ष तीन कुओं 24 घंटा में थाली की हड्डी मोम ही। (बी) BLI होते हड्डी मोम और नीचे तीन कुओं के लिए सीमित हड्डी के टुकड़े होते हैं। एमडीए MB-231-fLuc-EGFP कोशिकाओं के लिए BLI संकेतों के (सी) Quantitation (अनुपस्थिति बनाम उपस्थिति (बैंगनी सलाखों) में हरे रंग की सलाखों से बढ़ रहा है) के रूप में वर्णित टीहृदय सुसंस्कृत नमूनों तीन से टुकड़े की। बनाम 3 नियंत्रण कुओं - प्रत्येक THR के नमूना के लिए, सलाखों 3 टुकड़ा युक्त भर में मापा औसत BLI मूल्यों का प्रतिनिधित्व। इस परिणाम हड्डी के टुकड़े के अभाव बनाम उपस्थिति में प्रसार के उच्च स्तर को दर्शाता है। त्रुटि सलाखों के मानक त्रुटि (पी <0.01) का प्रतिनिधित्व करते हैं। अनुमति 44 के साथ reproduced।

चित्रा 4
चित्रा 4: हड्डी के टुकड़े पर सीधे वरीयता प्राप्त स्तन कैंसर की कोशिकाओं की जांच। 24 घंटा में BLI द्वारा पता लगाया के रूप में अस्थि ऊतक टुकड़े पर सीधे वरीयता प्राप्त MCF 7-fLuc-EGFP कोशिकाओं की (ए) औपनिवेशीकरण, 48 घंटा पद बोने पर। सीधे वरीयता प्राप्त टुकड़ा (बी) के गिरते बोने घनत्व के साथ जुड़े संकेत कमी आई है, और दिखा रहा है फ्लोरोसेंट biphosophonate अभिकर्मक के साथ 24 घंटे बाद लेबलिंग। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी EGFP + स्तन कैंसर की कोशिकाओं के रूप में पता चलता हैsociated एक mineralized spicule (हरा तीर) के साथ, और मज्जा कम्पार्टमेंट (सफेद तीर) में वसा कोशिकाओं के साथ। ये बसाना पैटर्न भी 72 सह संस्कृति (सी) के मानव संसाधन और (डी) के बाद एक AE1 / AE3 अखिल cytokeratin एंटीबॉडी के साथ immunohistochemical धुंधला के लिए कार्रवाई सीधे वरीयता प्राप्त टुकड़ों में पता चला रहे हैं। तीर से चिह्नित (सी) cytokeratin पॉजिटिव स्तन कैंसर की कोशिकाओं में, मज्जा डिब्बे में adipocytes से सटे मनाया जाता है। (घ) एक cytokeratin पॉजिटिव स्तन कैंसर के सेल एक mineralized spicule से जुड़ी मनाया जाता है। (सी) और (डी) की अनुमति के 44 के साथ reproduced।

चित्रा 5
चित्रा 5:। के अस्थि ऊतक टुकड़े और सुसंस्कृत हड्डी टुकड़ा supernatants को स्तन कैंसर की कोशिकाओं का प्रवास मापने प्रवासन एमडीए MB-231अस्थि ऊतक संस्कृति supernatants की ओर और BLI के साथ 24 घंटा में पता चला के रूप में हड्डी के टुकड़े में झरझरा प्रवास झिल्ली भर -fLuc-EGFP कोशिकाओं। (ए) BLI संकेत एक दिया टीहृदय से व्युत्पन्न संस्कृति supernatants की ओर प्रवास नियंत्रण मध्यम बनाम नमूना बढ़ाया खुलासा। (बी ) एक एकल टीहृदय नमूना से तीन हड्डी के टुकड़े में स्तन कैंसर की कोशिकाओं की माइग्रेशन पैटर्न का प्रदर्शन BLI संकेत। अस्थि ऊतक टुकड़े सफेद बिंदीदार हलकों से चिह्नित हैं। कांच के मोती युक्त नियंत्रण कुओं तल पर दिखाए जाते हैं।

चित्रा 6
चित्रा 6:।। प्लावित marrows का उपनिवेश टुकड़े से प्लावित marrows में एमडीए MB-231fLUC-EGFP कोशिकाओं का पता लगाने (बाएं) के बिना (ए) के टुकड़े और BLI द्वारा पता लगाया के रूप में (दाएं), स्तन कैंसर की कोशिकाओं को उपनिवेश के साथ (बी) के विश्लेषण एफ द्वारा टुकड़े (ए) सेकम cytometry। EGFP पॉजिटिव स्तन कैंसर की कोशिकाओं को BLI पॉजिटिव टुकड़ा से प्लावित मज्जा में पाया गया है, लेकिन नहीं BLI नकारात्मक टुकड़ा। एक BLI पॉजिटिव टुकड़ा से प्लावित मज्जा की संस्कृति से उत्पन्न स्तन कैंसर सेल कालोनियों के (सी) BLI का पता लगाने। मज्जा कोशिकाओं के एक क्षेत्र में एमडीए MB-231fLUC-EFGP कोशिकाओं दिखा एक BLI पॉजिटिव टुकड़ा से प्लावित मज्जा डिब्बे, (डी) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी।

चित्रा 7
चित्रा 7:। व्यवहार्यता मापने viabilities 4 टीहृदय से अलग ऊतक टुकड़े से प्लावित मज्जा कोशिकाओं के लिए इकट्ठा करने के बाद और कम से तुरंत नमूनों 24, 48, 72 घंटा, और DMEM-10% FBS के में संस्कृति के 6 दिन। मध्यम 24 और 72 घंटा में बदल गया था।

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Discussion

मेहरा एट अल। पहले से उच्च गुणवत्ता वाले ऊतकों खुलासा और मेटास्टैटिक प्रक्रिया 47 अध्ययन करने के लिए मानव हड्डी नमूने के उपयोग को मान्य, शव परीक्षा के समय में काटा मेटास्टेटिक प्रोस्टेट कैंसर रोगियों से पोस्टमार्टम संग्रह और हड्डी के नमूनों के विश्लेषण का वर्णन किया है। यहाँ हम, संग्रह, प्रसंस्करण और स्तन सेल प्रवास, उपनिवेशन और प्रसार का अध्ययन करने के लिए एक अल्पकालिक सह संस्कृति प्रणाली में thr सर्जरी के बाद खारिज कर दिया और्विक सिर से प्राप्त मानव अस्थि ऊतक टुकड़े का उपयोग कर के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया है। लगभग 300,000 हिप रिप्लेसमेंट सर्जरी अमेरिका (हड्डी रोग सर्जन के अमेरिकन अकादमी, Orthoinfo.aaos.org) में सालाना प्रदर्शन कर रहे हैं, और इन नमूनों को आम तौर पर खारिज कर रहे हैं। इस सर्जरी के लिए सबसे लगातार संकेत में से एक जोड़ों के दर्द में जो परिणाम और्विक सिर को कवर उपास्थि सतहों के क्रमिक टूटने के लिए अग्रणी, संयुक्त कूल्हे के पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस है। कुल हिप replacem के दौरानईएनटी सर्जरी ऊपरी फीमर के एक छोटे से हिस्से और्विक सिर के साथ हटा दिया जाता है। फीमर स्तन कैंसर मेटास्टेसिस 48 की एक आम साइट है, और इन नमूनों घरनदार हड्डी के ऊतकों, मेटास्टैटिक स्तन सेल उपनिवेशन के स्थल होते हैं। हिप रिप्लेसमेंट से गुजरने वाले अधिकांश रोगियों, शिखर स्तन कैंसर के बढ़ते मामलों के वर्ष कोष्ठक कि एक उम्र सीमा 50-80 साल पुराने हैं। इस प्रकार, इन ऊतकों स्तन कैंसर हड्डी मेटास्टैटिक आला अध्ययन के लिए एक मूल्यवान संसाधन का गठन।

इन तकनीकों के साथ जुड़े कई महत्वपूर्ण कदम और विचार कर रहे हैं। सबसे पहले, एक अच्छी गुणवत्ता शल्य ronguer विपरीत, दस्ताने हाथ में और्विक सिर पकड़ जबकि छोटे घरनदार हड्डी के टुकड़े को निकालने के लिए आवश्यक है। वे mineralized spicules युक्त घरनदार ऊतक निकालने के लिए पर्याप्त मजबूत नहीं कर रहे हैं क्योंकि संदंश काम नहीं करेगा। इन assays में एक अन्य महत्वपूर्ण विचार स्तन सेल लाइन से निपटने और passaging, खासकर से संबंधित हैमाइग्रेशन assays के संबंध में larly। Trypsinization प्रक्रियाओं में लंबी अवधि बीतने और / या परिवर्तनशीलता संभावित प्रयोगों में प्रवासी प्रतिक्रियाओं में फेरबदल, अधिक / कम दृढ़ सेल आबादी के अनुक्रमिक चयन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। एक और मुद्दा अलग अलग उम्र और बीमारी राज्यों के रोगियों से प्राप्त की शल्य चिकित्सा के ऊतकों की परिवर्तनशीलता को देखते हुए प्रयोगों के मानकीकरण से संबंधित है। यह पता करने के लिए, हम सभी चर तीन प्रतियों में जांच की जाती है, जिसमें एक अंतर-विषय प्रयोगात्मक डिजाइन को रोजगार (जैसे, तीन टुकड़े / प्रयोगात्मक कुओं बनाम तीन टुकड़े / नियंत्रण कुओं भर में) एक दिया रोगी की शल्य नमूना से टुकड़े का उपयोग कर। चर कई रोगियों से नमूनों पर इस डिजाइन का उपयोग कर परीक्षण किया है, और डेटा प्रतिकृति पर औसतन लिए बनती टी परीक्षण का उपयोग सांख्यिकीय महत्व के लिए विश्लेषण, और / या एक के भीतर-विषयों के एक तरह से एनोवा प्रतिकृति पर डेटा के लिए किया जा सकता है। और अंत में, इस विधि के एक प्राथमिक सीमा viab की छोटी खिड़की हैexplant संस्कृति दौरान ility।

हमारे माप अस्थि मज्जा रेस्पायरेट्रस 49 से प्राप्त व्यवहार्यता माप के साथ ध्यान में रखते हुए, संग्रह के दिन पर 90% ~ की मज्जा viabilities का पता चला। हम mineralized के डिब्बे की व्यवहार्यता मापा नहीं किया है हालांकि समय के साथ, तथापि, हम दिन 6. द्वारा व्यवहार्यता के नाटकीय हानि के साथ, दिन दो और तीन पर एक क्रमिक बूंद मनाया, गुणात्मक टिप्पणियों की व्यवहार्यता में एक समान गिरावट है कि वहाँ का सुझाव चित्रा 4D के रूप में देखा हड्डी-अस्तर अस्थिकोरक और osteocytes,। इन प्रयोगों के आधार पर, हम 48 या 72 घंटा से अधिक प्रदर्शन लघु अवधि के अध्ययन के लिए हमारी संस्कृति प्रयोगों सीमित है। प्रारंभिक प्रयोगों (शामिल नहीं) व्यवहार्यता मज्जा कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए तैयार की व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मीडिया का उपयोग कर सुधार किया जा सकता है कि संकेत दिया है। हालांकि हम इन प्रयोगों में मज्जा सेल आबादी की विशेषता नहीं है, और अगर तुम नहीं जानते चयनित से सुधार व्यवहार्यता परिणामकुछ मज्जा सेल उप-जनसंख्या का परिणाम। को बनाए रखने और इन explants की व्यवहार्यता का विस्तार करने के लिए प्रोटोकॉल के विकास के इस मॉडल प्रणाली अग्रिम करने के लिए महत्वपूर्ण होगा।

निगरानी के लिए हड्डी microenvironment के लिए, 2) एक्सेसिबिलिटी मानव हड्डी माइक्रोएन्वायरमेंट का गठन कि प्रासंगिक प्रकार की कोशिकाओं को शरण 1) बरकरार तीन आयामी ऊतकों: इस मॉडल को कम समय अवधि तक ही सीमित है, हालांकि, अन्य तरीकों के संबंध में अपनी प्रमुख लाभ निम्नलिखित विशेषताएं शामिल और perturbing गतिशील बातचीत, 3) को दोहराने के प्रयोगों के लिए नमूना प्रति टुकड़े की उच्च संख्या, और 4) कम लागत पशु मॉडलों की तुलना में।

हम हड्डी को स्तन कैंसर मेटास्टेसिस के अध्ययन के लिए assays के वर्णन किया है, वहीं इन नमूनों और दृष्टिकोण आसानी से इस तरह के प्रोस्टेट कैंसर है, साथ ही अन्य हड्डी विकृतियों के रूप में अन्य हड्डी की मांग दुर्दमताओं का अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। हम एक इतनी के रूप में मुख्य रूप से खारिज कर दिया और्विक सिर का इस्तेमाल किया हैऊतक टुकड़े की urce, इन नमूनों को भी परंपरागत रूप से युवा स्वयंसेवकों से अस्थि मज्जा आकांक्षा के माध्यम से एकत्र किया जाता है जो मानव अस्थि मज्जा, का एक अतिरिक्त स्रोत का गठन। हम bioluminescence और प्रतिदीप्ति के लिए इंजीनियर सेल लाइनों का उपयोग दृष्टिकोण का वर्णन किया है, जबकि इन सेल लाइनों और / या इमेजिंग प्लेटफार्मों उपलब्ध नहीं हैं और अगर अंत में, प्रक्रियाओं के अधिकांश अन्य कोशिकाओं के साथ उपयोग के लिए संशोधित किया जा सकता है।

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Acknowledgments

इन अध्ययनों से वैकल्पिक अनुसंधान एवं विकास फाउंडेशन (107,588), स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (1U54CA136465-04S1), और कैलिफोर्निया स्तन कैंसर रिसर्च प्रोग्राम (201B-0141) से अनुदान द्वारा, भाग में, वित्त पोषित किया गया। हम डीआरएस धन्यवाद। के उदार दान के लिए एंड्रयू विल्बर और आर स्कॉट McIvor उनके transponson और पी / hUbiC-SB11 transposase प्लास्मिड। हम कृतज्ञता जॉन Tamaresis, पीएच.डी. स्वीकार करते हैं सांख्यिकीय तरीकों पर सलाह के लिए, टिमोथी ब्राउन प्रवाह cytometry प्रदर्शन के लिए, माइग्रेशन assays के बारे में सलाह के लिए Georgette Henrich, और नैन्सी Bellagamba के लिए THR के नमूनों के संग्रह की सुविधा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM (1X) + GlutaMAX-l Life Technologies 10569-010 Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep
McCoy's 5A Medium (1X) Life Technologies 16600-082 Supplement all McCoy's  with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep
Fetal bovine serum Life Technologies 16000-044
Penicillen Streptomycin Life Technologies 15140-122
Blastocidin (10 mgl/ml) InvivoGen  ant-bl Supplement media used for transfected cell lines.
Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size) Corning Incorporated 353097
Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate Corning Incorporated 353504
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells* Invitrogen Detection Technologies L-3224
FluoroBrite DMEM Life Technologies A18967-01
D-luciferin firefly, potassium salt 5 g (30 mg/ml) Life Technologies L-8220
Sterile Cell Strainer 70 μm Fisher Scientific 22363548
6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster Corning Incorporated 3516
12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster Corning Incorporated 3513
24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster Corning Incorporated 3526
Friedman-Pearson Rongeur Fine Science Tools 16021-14
Bone wax Surgical Specialties Corporation 903
IVIS 50 Imaging Platform Caliper Life Sciences/PerkinElmer
Living Image Software Program  Caliper Life Sciences/PerkinElmer 133026
EVOS FL Imaging System Life Technologies Version 4.2
OsteoSense 680 EX PerkinElmer NEV10020EX
MCF-7 breast cancer cells ATCC HTB-22
MDA-MB-231 breast cancer cells ATCC HTB-26
Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody DAKO Cytomation Clone (AE1/AE3)

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Templeton, Z. S., Bachmann, M. H.,… More

Templeton, Z. S., Bachmann, M. H., Alluri, R. V., Maloney, W. J., Contag, C. H., King, B. L. Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche. J. Vis. Exp. (97), e52656, doi:10.3791/52656 (2015).

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