Summary
Protokoller er beskrevet for å studere brystkreft cellemigrering, proliferasjon og kolonisering i en human bone vevseksplantatet modellsystem.
Abstract
Bone er den mest vanlige område av brystkreft metastase. Selv om det er allment akseptert at mikromiljøet påvirker kreftcelle atferd, er lite kjent om brystkreft celle egenskaper og atferd innenfor den opprinnelige mikromiljøet av menneskelig benvev. Vi har utviklet metoder for å spore, kvantifisere og modulerer menneskelige brystkreft celler innenfor mikromiljøet av dyrkede humane bein vevfragmenter isolert fra kasserte femoral hoder følgende totale hip erstatning surgeries. Ved hjelp av brystkreft celler konstruert for luciferase og forbedrede grønt fluorescerende protein (EGFP) uttrykk, er vi i stand til reproduserbart quantitate migrasjon og spredning mønstre ved hjelp Bioluminescens bildebehandling (BLI), spor celle interaksjoner innenfor bein fragmenter som bruker fluorescens mikroskopi, og evaluere bryst celler etter kolonisering med flowcytometri. De viktigste fordelene med denne modellen inkluderer: 1) en innfødt, arkitektonisk intakt vev microenvironment som inkluderer relevante humane celletyper, og 2) direkte tilgang til mikromiljøet, som muliggjør hurtig kvantitativ og kvalitativ overvåking og forstyrrelse av bryst og bein celle egenskaper, atferd og interaksjoner. En primær begrensning, i dag, er den endelige levedyktighet av vevfragmenter som begrenser vinduet i studien til korttidskultur. Anvendelser av modellsystemet omfatter å studere den grunnleggende biologi av brystkreft og andre bein-søkende maligniteter i metastatisk nisje, og utvikling av terapeutiske strategier for effektivt å målrette brystkreftceller i benvev.
Introduction
Svulsten mikromiljøet er anerkjent som en kritisk faktor for kreft celle oppførsel under brystkreft progresjon og metastatisk spre 1-3. Målet med fremgangsmåten presentert her er å forenkle studiet av brystkreftceller i mikromiljøet av humant benvev, den hyppigste stedet for brystkreft metastase 4-6. Bein består av mineralisert og marg avdelinger 7-9, som begge bærer på celler og skilles faktorer involvert i metastatisk progresjon 10,11. Selv om mye brukt in vivo musemodeller lette systemiske studier av metastatisk prosess 12-15, celle interaksjoner innenfor skjelettet er ikke lett tilgjengelig for observasjon og direkte forstyrrelse. Modellsystem for å studere og dyrking mus bein vev og mus marg cellene gi bedre tilgang og har gitt mange innsikt om crosstalk og mekanismene bak brystkreft celle metastasis i muse skjelett 16-22. Men studier har antydet at det kan være artsspesifikke mønstre av osteotropism for benvev 23,24. Disse mønstrene kan reflektere iboende artsspesifikke forskjeller i beinvevet egenskaper, forskjeller som følge av endrede benmargs populasjoner i immun-mangelfull mus 11, og / eller den relativt ung alder av mus brukt i eksperimenter, som alle er sannsynlige faktorer som bestemmer beinet mikromiljøet.
In vitro tilnærminger for å studere brystkreft celler i menneskelige bein co-kulturer har vanligvis fokusert på bestemte bein celletyper som marg-avledet osteoblaster eller stromale celler dyrket som monolayers eller innen utviklet tre-dimensjonale modellsystemer 25-35. Selv om to-dimensjonale cellekultur modeller har dannet bærende for in vitro tilnærminger for kreftforskning, har det lenge vært kjent at celle atferd er fundamentalt endret på monolayer kultursystemer 18,36,37. Dette har ført til utvikling av konstruerte mikromiljøer som etterligner kompleksiteten av 3-dimensjonale levende vev, inkludert matrise- og stillabaserte modeller sammensatt av naturlige materialer slik som kollagen eller syntetiske polymerer podet med spesifikke celletyper for å lage vev-lignende microenvironments 36-41. Konstruert tilnærminger har også omfattet bruk av bioreaktor plattformer for å kontrollere og studere den hormonelle miljøet av mikromiljøet 18,19,41-43. Selv biomimetic modeller og bioreaktorer gi mange elementer av en kompleks vev mikromiljøet i et kontrollert miljø, og har blitt brukt til å fremme studiet av brystkreft metastaser til bein 18,19,35,42,43, trenger konstruerte modellsystemer generelt ikke innlemme det fulle spektrum av celletyper og ekstracellulære matriks-komponenter som er tilstede i naturlig ben miljø.
Inntil nylig, brystkreftceller har ikke blitt studert innenfor de innfødte, intakt, 3-dimensjonal mikromiljøet av menneskelige bein vev. Vi har nylig rapportert utviklingen av en co-kultur modell ved hjelp av menneskelige bein vevfragmenter isolert fra total hofteprotese (THR) kirurgi eksemplarer 44. Disse prøvene havna både mineralisert og marg avdelinger er nødvendig for å studere mekanismene bak mikrometastaser i kort sikt kultur. I tidligere arbeid etablerte vi proof-of-prinsippet for å bruke Bioluminescens imaging (BLI) for å overvåke spredning av luciferase-uttrykke brystkreftceller (MDA-MB-231-Fluc) co-dyrket med bein fragmenter 44. Her presenterer vi detaljerte eksperimentelle protokoller for å studere bryst celle kreft spredning, kolonisering, og migrasjon innenfor rammen av den opprinnelige mikromiljøet ved hjelp av menneskelig benvev eksplantater.
Først presenterer vi en protokoll for co-dyrking brystkreftceller som grenser til bein fragmenter å måle brystcelleproliferasjon bruker BLI. I denne delen er bryst cellesuspensjoner seeded som celle flekker i seks-brønns plater i tilknytning til bein fragmenter, som er immobilisert av biter av bein voks. Kontrollbrønner inneholder ben voks, men ingen benfragment. Når celle flekker feste, er medium tilsatt og platen blir dyrket i 24 timer, hvoretter bioluminescent signalintensitet (assosiert med cellenummer) måles med BLI. I det neste trinn presenteres fremgangsmåter for co-dyrkning av brystkreftceller sådd direkte på beinfragmenter for å studere kolonisering og proliferasjon. Her brystcellesuspensjoner blir pipettert direkte på benvevet fragmenter, som overvåkes i kultur av BLI og fluorescensmikroskopi over tid for å spore kolonisering og cellenummeret. I denne metoden, kan margen rommet spyles fra benfragmentene som helst punkt for analyse av koloniserte brystcancerceller ved strømningscytometri, eller marg levedyktighet assays.
I tillegg har vi deskriftlærd to ulike tilnærminger for å måle brystkreft celle migrasjon. I den første metoden trinnene er beskrevet for måling av migrering mot benvev kultursupernatanter. I denne protokoll brystkreftcellene sådd ut på den indre, øvre overflater av Transwell sette membraner med 8 um porestørrelse (som vist i figur 1A). Innsatsene blir deretter plassert inn i en mottaker plate med brønner inneholdende benvev supernatant eller kontrollmedium. I løpet av en 20-timers inkuberingsperiode, små antall av brystkreft celler migrerer gjennom innsatsen membraner ned i de lavere vevs kulturbrønner hvor de fester for deteksjon av BLI. I den andre overføringsmetode brystkreftcellene sådd ut på den nedre, ytre overflater av Transwell insert membraner. Benvev fragmenter plasseres i innsatsen kopper og brystkreft celler migrerer opp gjennom membranene til å kolonisere benfragmentene (som vist på figur 1B), hvilkeblir deretter avbildes med BLI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Femoral hoder ble samlet inn fra pasienter som gjennomgår elektiv THR kirurgi ved Institutt for ortopedisk kirurgi ved Stanford University School of Medicine. Alle vev ble samlet som avidentifiserte prøver i henhold til forskrifter om Stanford University Research Compliance Office.
1. Velge en Breast Cancer Cell linje (r)
- Innhente eller transfektere den ønskede brystkreft-cellelinje (r) med en luciferase-GFP reporter-konstruksjonen. De følgende eksperimenter ble utført ved anvendelse av MDA-MB-231 og MCF-7 brystkreftcellelinjer konstruert for stabil ekspresjon av ildflueluciferase (Fluc) og forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) ved transfeksjon med Tornerose transposon plasmid pKT2 / LuBiG og transposase plasmid pK / hUbiC-SB11 45,46.
MERK: De transfekterte cellelinjer er referert til som MDA-MB-231-Fluc-EGFP, og MCF-7-Fluc-EGFP.
2. Isolere Tissue Fragments fra Lårarterier Heads
- Etter THR kirurgi, samle forkastet lårbenshodet i en steril beholder fylt med fysiologisk saltvann. Overfør prøven til laboratoriet og behandle den i løpet av 1-3 timer av kirurgi. Merk: Hvis det er en forsinkelse i behandlingen, plassere prøven ved 4 ° C.
- Forberede et arbeidsområde ved å plassere følgende elementer på et absorberende matte i en laminær vev kultur hette: sterile hansker, kirurgisk rongeur, tang, beger med 70% isopropanol å skylle instrumenter, og vev kultur fartøy som angitt nedenfor for hver type eksperiment .
- Iført en steril kirurgisk hanske å holde runde femur hodet i den ene hånden, bruker rongeur i den andre hånden til å trekke trabekulære bein fragmenter av ønsket størrelse (~ 2-5 mm) fra konkurranseutsatt øvre skaftet av lårbenet. Overfør benfragmenter i kulturbeholderen (f.eks, 6-, 12- eller 24-brønners vevskulturplate eller migrasjon kammer), avhengig av typen av proliferasjon, colonization eller migrasjon forsøket, som er beskrevet i trinn 3, 4 eller 5.
MERK: benvev fragmenter bør høstes som beskrevet ovenfor etter å ha fullført de første trinnene for hver spesifikk spredning, kolonisering eller migrasjon analysen. Fragmenter vil variere i størrelse som vist i figur 2. Fragmenter kan veies før eller etter eksperimenter med henblikk på standardisering.
3. Co-dyrking brystkreft celler Tilstøtende til bein fragmenter for å måle Breast Cell Proliferation Bruke BLI
- Før eksperimentet, fremstille en suspensjon inneholdende 2 x 10 5 brystkreft celler / 50 ul, og forberede plugger av beinvoks for å immobilisere benfragmenter i kultur. Skjær et P200 mikropipette tips i 3 stykker og bruke den smale enden av det største stykket i en "cookie cutter" måte å skjære små (~ 35 mg) biter av bein voks. Bruk den brede enden av den minste stykke å løse ut beinet voks plugger inn i en petriskålfor lagring.
- Legg et stykke bein voks på 12 o'clock posisjonen til hver brønn og trykk forsiktig ned med en steril-hansker pekefinger.
- Pipetter 50 ul av cellesuspensjonen inneholdende 1 x 10 5 brystkreft celler i DMEM-10% FBS + Pen-Strep i midten av hver brønn i en 6-brønns plate. (Alternativt frø celler i et spredt mønster hvis ønskelig.) Sett platen i en 37 ° C vevsdyrkningsinkubator i 45 min for å fremme celle vedlegg.
- Plassere en beinfragment på ett stykke bein voks for hver eksperimentell godt og trykk forsiktig med rongeur å sikre det. Utføre forsøk in triplo, slik at tre beinfragmenter fra en gitt THR prøven blir plassert inn i de tre øverste brønner, mens de nederste tre brønner inneholder ben voks bare som kontroller.
- Ved hjelp av en 5 ml pipette, forsiktig og langsomt levere 5 ml DMEM-10% FBS til siden av hver brønn for å unngå å flytte brystceller eller benfragmenter. Plassere platen i en 3776; C vevskultur-inkubator i 20-24 timer.
- For å utføre Bioluminescens imaging (BLI) fjerne platen fra inkubatoren og tilsett luciferin substrat (for å oppnå en konsentrasjon på 300 ug / ml) til hver brønn. Bilde platen umiddelbart på en IVIS Imaging Platform med følgende parametere: f-stop på 1, liten binning, eksponeringstid på 1 sek, nivå D. Mål signalstyrken for hver brønn som gjennomsnittlig utstråling (fotoner / andre / kvadratcentimeter / steradian).
- Bruke bildebehandlingsprogrammer å definere regioner av interesse (ROI) for å kvantifisere den gjennomsnittlige stråleglans for alle eksperimentelle og kontrollbrønner. Eksport gjennomsnittlig utstråling verdier til et Excel-ark for å utføre statistikk og generere grafer.
4. Co-dyrking brystkreft celler Seeded direkte på bein fragmenter for å studere Colonization og Cell Number
- Bruk pinsett til å plassere benfragmenter direkte inn i de tomme brønner i en 24-brønners vevskulturplate (1 fragment / brønn).
- PipEtte en 50 ul cellesuspensjon dråpe med DMEM-10% FBS inneholdende 1 X 3 til 6 oktober brystkreftceller direkte på toppen av hvert benfragment. Plassere platen i en 37 ° C vevskultur-inkubator i 45 minutter for å fremme cellefesting. Tilsett 1-2 ml DMEM-10% FBS i siden av hver brønn slik at fragmentet er fullstendig neddykket i medium. Inkuber platen i en 37 ° C-vevskultur-inkubator i 20-24 timer.
- Etter inkubasjon bruke pinsett til å overføre hver benvev fragment til en frisk 24-brønners plate inneholdende 1 ml DMEM-10% FBS i hver brønn. Å utføre BLI, følger du trinn 3.6 til 3.7 ovenfor. I tillegg kan fragmenter vises ved hjelp av et fluorescens-mikroskop, eller tømmes for å oppnå marg populasjonen for analyser av brystkreft celletall og egenskaper som beskrevet i trinn 6.
- For å forberede de intakte fragmenter for kvalitativ vurdering av fluorescensmikropskopi følgende BLI, pipette 5 mL av fluorescerende merking bisfosfonat løsning (prelignet henhold til produsentens anvisninger) i hver brønn for å merke miner spicules av bein fragmenter. Inkuber platen i vevskultur-inkubator i ytterligere 24 timer.
- Etter 24 timers kultur i fluorescerende merking bisfosfonat løsning, benyttes tang for å overføre fragmentene til vevskultur-plater inneholdende fenol rød-fritt medium og vis ved hjelp av et fluorescensmikroskop konfigurert til bilde GFP (485 nm) og bisfosfonat etikett (680 nm).
5. Måling Migrasjon av brystkreft celler til benvev Fragmenter og Cultured Bone Fragment Supernatanter
- Migrering mot benvev kultursupernatant.
MERK: Utfør eksperimenter i tre eksemplarer slik at tre fragmenter fra en gitt THR prøven brukes til å generere 3 Supernatantene. For hvert forsøk, er migrasjon sammenlignet over tre brønner som inneholder bein Supernatantene kontra tre brønner som inneholder kontrollmedium bare.- Generere bein tissue supernatanter ved å plassere beinfragmenter inn i brønnene til en 12-brønns plate som inneholdt 2,2 ml DMEM-10% FBS per brønn. Kultur i en 37 ° C vevskultur-inkubator i 24 timer. Trekke medium på 24 timer og erstatte med 2,2 ml frisk DMEM-10% FBS. Treat kontrollbrønner inneholdende DMEM-10% FBS på samme måte.
MERK: Mediet er endret på 24 timer for å fjerne faktorer som utskilles i respons til vev traumer som følge av kirurgi. Fordi benvevet supernatanter blir generert i FBS-inneholdende medium, brønner inneholdende FBS-inneholdende medium bare er inkludert for å kontrollere for bidragene fra FBS til brystkreftcellemigrering. - I 48 timer, samle 0,9 ml av hver supernatant / kontrollmedium og pipetten inn i brønnene til en mottakerplaten. Skjærene vil senere bli plassert i disse brønnene. Inkuber mottaker plate i vevskultur-inkubator mens poding innsatsene. Merk: De resterende supernatant (~ 1 ml etter fordampning) kan samles for analyse av secretome factors om ønskelig 44.
- Å seede de Transwell innsatser, plassere dem i en standard, tom 24-brønners vevkulturplate. Pipetter 350 ul cellesuspensjon inneholdende 1 x 10 5 brystkreft celler i DMEM-10% FBS på den øvre, indre overflate av hver membran innsatsen som vist i figur 1A. Plasser 24-brønners plate inneholdende de kimsatte innsatser inn i 37 ° C vevskultur-inkubator i 45 minutter for å fremme festing.
- Når cellene er festet til innsatsene ved å bruke tangen for å overføre innsatsene til mottakerplaten i henhold til produsentens instruksjoner. Vinkel hver innsats når du plasserer den til mottakeren godt å hindre bobledannelse mellom innsatsen membran og mottakeren godt supernatant. Inkuber mottakeren plate med innsatser i 20 timer i en 37 ° C-vevskultur-inkubator.
MERK: Sjekk undersiden av mottakeren plate for bobler mellom innsatsen membran og mottakeren godt supernatant. Hvis bobler er synlige, fjerne spesifikke innsatser og plassere dem igjen i mottakeren godt til det ikke er luftbobler. - Etter 20 timers bruk tang for å fjerne innsatsene fra mottakerplaten. Ved hjelp av fremgangsmåten i trinn 3.6 til 3.7 utføre BLI å avbilde celler som har migrert inn i og festet til bunnen av mottakeren platebrønnene.
- Generere bein tissue supernatanter ved å plassere beinfragmenter inn i brønnene til en 12-brønns plate som inneholdt 2,2 ml DMEM-10% FBS per brønn. Kultur i en 37 ° C vevskultur-inkubator i 24 timer. Trekke medium på 24 timer og erstatte med 2,2 ml frisk DMEM-10% FBS. Treat kontrollbrønner inneholdende DMEM-10% FBS på samme måte.
- Migrasjon mot benvev fragmenter.
MERK: Utfør eksperimenter i tre eksemplarer slik at tre fragmenter fra en gitt THR prøven er plassert i tre separate innsatser, og tre glassperler er plassert i tre separate innsatser som kontroller.- Forberede mottaker plate ved å pipettere 0,9 ml DMEM-10% FBS i hver brønn. Plassere den i vevsdyrkningsinkubator mens han forberedte innleggene.
- Å frø innsatsene, invertere dem på overflaten av en plast mikrosentrifugerør boks som har et lokk. Pipetter en 50 ul cellesuspensjon dråpe med DMEM-10% FBS inneholdende 1 x 10 5 brystkreftceller directly på den ytre, nedre overflate av hver innsats membran (som vender opp på de inverterte inserts). Dekk mikrofugerør boksen med lokket sprakk åpne og overføre den til 37 ° C vev inkubator i 45 min for å fremme celle vedlegg.
- Overfør mikrosentrifugerør boksen til hetten vevskultur, og bruke tang for å skru de kimsatte innsatser med rett side opp og overføre dem til brønnene av mottakerplaten. Pipette 0.450 ml DMEM-10% FBS i hver insert cup. Bruk pinsett, overføre en benvev fragment (~ 3 mm) i hver forberedt innsats cup. Eventuelt bruke glassperler som negative kontroller i flere brønner. Plassere platen i en vevskultur-inkubator i 20 timer.
- For å måle migrering fremstille en standard 24-brønns vevskulturplate inneholdende 1 ml DMEM-10% FBS per brønn. Ta av mottaker plate fra inkubatoren og bruke tang for å overføre bein fragmenter og perler fra hver sette i separate brønner på standard plate. Legg luciferinsubstrat (for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 300 ug / ml) til hver brønn og utføre BLI ved hjelp av fremgangsmåten i trinn 3.6 til 3.7.
6. Ytterligere pre- og post eksperimentelle analyser
- Analyse av bluss marg.
- Overføre et benfragment i en 70 um cellefilter plassert på toppen av en 50 ml konisk rør. Bruke en 10 ml sprøyte med en 25 G nål til kraftig skylle fragment med 10 ml PBS for å oppnå en suspensjon av margceller i den koniske tube. Sentrifuger cellesuspensjonen i 3 min ved 300 x g og 21 ° C, å suge supernatanten og resuspender de pelleterte celler i PBS eller annen ønsket oppløsning for strømningscytometri.
MERK: resuspensjon volumer vil variere avhengig av størrelsen på cellepellet etter sentrifugering, og anvendelse. - For levedyktighet analyser ~ 75-300 mL volumer av PBS er hensiktsmessig, og disse suspensjonene kan analyseres ved hjelp av kommersielt tilgjengelig fluorescence basert levedyktighet analyser i henhold til produsentens instruksjoner, ble pipettert inn i en konvensjonell hemocytometer, og tellet ved bruk av et invertert fluorescensmikroskop.
- For strømningscytometrisk analyse eller sortering basert på deteksjon av GFP-positiv brystkreft celler, cellepelleten suspenderes i 1 ml PBS inneholdende 2% FBS, 2 mM EDTA og 10 mM HEPES, slik at konsentrasjonen er 1 x 10 6 celler / ml.
- Overføre et benfragment i en 70 um cellefilter plassert på toppen av en 50 ml konisk rør. Bruke en 10 ml sprøyte med en 25 G nål til kraftig skylle fragment med 10 ml PBS for å oppnå en suspensjon av margceller i den koniske tube. Sentrifuger cellesuspensjonen i 3 min ved 300 x g og 21 ° C, å suge supernatanten og resuspender de pelleterte celler i PBS eller annen ønsket oppløsning for strømningscytometri.
- H & E Farging og Immunohistokjemi.
- Å behandle de fragmenter for hematoxylin og eosin (H & E) flekker og / eller immunhistokjemi, plassere fragmenter i plast kassetter merket med et nummer 2 blyant, og senk i en beholder fylt med 10% bufret formalin i 24 timer.
- Prosess vev for parafin embedding, seksjonering og flekker ved hjelp av rutinemessige protokoller som inkluderer en avkalking skritt for å redegjøre for de miner spicules innenfor hvert fragment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolere Tissue Fragmenter fra Lårarterier Heads
Femoral hoder ble samlet inn fra like mange mannlige og kvinnelige pasienter (44-90 år) som gjennomgår elektiv total hofteprotesekirurgi ved Institutt for ortopedisk kirurgi ved Stanford University School of Medicine. Hver kastes lårbenshodet inneholder en liten del av det øvre lårbenet, som havner trabekulært ben vev sammensatt av mineralisert spicules og marg. Dette vev er tilgjengelig gjennom kirurgisk eksponert tverrsnitt av skaftet (figur 2A) ved hjelp av en kirurgisk rongeur for å trekke ut små fragmenter. Histologi av de utpakkede brikkene er vist i figur 2B, avslører de mineraliserte og marg komponenter. Utseendet av de ekstraherte biter varierer mellom femorale hodet oppnådd fra forskjellige pasienter, som strekker seg fra gult til rødt, avhengig av adipocytt-innholdet i margen, som vist i figur 2C. We demonstrere bruken av disse bein vevfragmenter i kortsiktige analyser for å måle dynamiske interaksjoner med brystkreft celler konstruert for luciferase og EGFP uttrykk.
Co-dyrking brystkreft celler tilstøtende til bein fragmenter for å måle Breast Cell Proliferation hjelp Bioluminesens Imaging
Kulturen plate oppsett for co-dyrkning av MDA-MB-231-Fluc EGFP-brystcancerceller i tilknytning til immobilisert bein fragmenter for å måle bryst celleproliferasjon ved hjelp BLI er vist i figur 3A. BLI av platen i 24 timer er vist på figur 3B, og BLI signal fra tre eksperimenter som demonstrerer forbedret celleformering i nærvær vs. fravær av benfragmenter er vist i figur 3C.
Co-dyrking brystkreft celler Seeded direkte på bein fragmenter for å studere Colonization og Cell Number
Kolonisering av MCF-7-Fluc-EGFP calen sådd direkte på benvev fragmenter som målt via BLI ved 24 timer er vist på figur 4A, som viser redusert signal forbundet med synkende seeding tetthet. En direkte-seeded fragment er vist i 48 timer i 4B, etter merking med fluorescerende biphosophonate reagens, som avbildes ved fluorescens mikroskopi for å avsløre kolonisering av brystkreftceller i løpet av de mineraliserte og marg avdelinger. Disse kolonisering mønstre er også avdekket i direkte-seeded fragmenter bearbeidet post-eksperimentelt for immunhistokjemisk farging med cytokeratin antistoff (Tall 4C og 4D).
Måling Migrasjon av brystkreft celler til benvev Fragmenter og Cultured Bone Fragment Supernatanter
Migrasjon av MDA-231-Fluc-EGFP celler på tvers porøse migrasjons membraner mot benvev kultursupernatanter og inn bein fragmenter blir oppdaget med BLI som vist i figur 5. En robust migreringsmønster mot kultursupernatanter avledet fra tre fragmenter av en gitt THR prøven er vist i figur 5A, som viser økt migrasjon inn i brønner inneholdende benvev supernatanten sammenlignet med kontrollmediet. Selv om ikke alle flyttemønster er denne robuste, migrasjon mot bein Supernatantene er typisk større enn mot kontrollmedium i de fleste eksperimenter. En typisk migreringsmønster inn i beinfragmenter fra en gitt THR prøven er vist i figur 5B.
Analyse av blussgresskar
I tillegg, viser vi at margceller kan spyles fra koloniserte fragmenter, og at det spyles brystkreft celler kan påvises blandt disse cellene ved flowcytometri (figur 6B), BLI (figur 6C), og / eller fluorescens mikroskopi (figur 6D) .
Måling Livskraftig
Figur 1: Sett opp av migrasjons eksperimenter. (A) I "forover migrering" eksperimenter, er mottakeren plate brønnene fylt med tidligere genererte benvev kultursupernatanter. Brystcancer-celler som er sådd ut på den indre, øvre overflater av Transwell membraner i innsats kopper inneholdende DME-10% FBS migrerer gjennom membranene, og fester seg til bunnen av brønnene for deteksjon av BLI. 
Figur 2: Isolere vevfragmenter fra femoral hoder. (A) Trekke fragmenter av trabekulær bein ved hjelp av en kirurgisk rongeur. (B) Histologi av fragment løst umiddelbart etter ekstraksjon fra femur vev viser mineralisert (hvit pil) og marg (svart pil) avdelinger. (C) trabekulær bein fragmenter hentet fra to forskjellige femoral hoder som viser variasjon i rød vs. gul marg innhold. 
Figur 3: Co-dyrking brystkreftceller som grenser til bein fragmenter å måle bryst celleproliferasjon hjelp Bioluminescens bildebehandling. (A) Kultur plateoppsettet for co-dyrking MDA-MB-231-Fluc-EGFP brystkreftceller som grenser til immobilisert bein fragmenter, som indikert med piler: celle flekker (blå), bein voks (svart), og beinfragment (rød ). Posisjonen av benet voks er også kjent ved en svart stiplet sirkel. Platen er vist før tilsetning av mediet. De 3 beste brønner inneholde bein fragmenter tjoret til beinet voks og de nederste tre brønner inneholde bare bein voks. (B) BLI av platen på 24 timer. (C) Kvantifisering av BLI signaler for MDA-MB-231-Fluc-EGFP celler vokser i nærvær (lilla søyler) vs. fravær (grønne søyler) Av fragmenter fra tre THR eksemplarer dyrket som beskrevet. For hver THR prøven, barer representerer gjennomsnitts BLI verdier målt over tre fragmentholdig - vs. tre kontrollbrønner. Dette resultatet demonstrerer høyere nivåer av proliferasjon i nærvær vs. fravær av beinfragmenter. Feilstolpene representerer standardfeil (p <0,01). Gjengitt med tillatelse 44. 
Figur 4: Påvisning av brystkreft celler sådd direkte på bein fragmenter. (A) Kolonisering av MCF-7-Fluc-EGFP celler sådd direkte på bein vev fragmenter som oppdages av BLI på 24 timer, som viser redusert signal assosiert med synkende seeding tetthet. (B) Direkte-seeded fragment på 48 timer etter seeding, og 24 timer etter merking med fluorescerende biphosophonate reagens. Fluorescens mikroskopi avslører EGFP + brystkreftceller somsiert med en mineralisert Spikul (grønn pil), og med adipose celler i margen rommet (hvite piler). Disse kolonisering mønstre er også avdekket i direkte-seeded fragmenter behandlet for immunhistokjemisk farging med en AE1 / AE3 pan-cytokeratin antistoff etter 72 timer av co-kultur (C) og (D). I (C) cytokeratin-positiv brystkreft celler, merket med piler, er observert i tilknytning til adipocytter i margen rommet. I (D) et cytokeratin-positiv brystkreft celle observeres festet til en mineralisert Spikul. (C) og (D) gjengis med tillatelse 44. 
Fig. 5: Måling av migrering av brystkreftceller til benvev fragmenter og dyrkede benfragment supernatanter Migrering av MDA-MB-231-fLuc-EGFP celler på tvers av porøse migrasjons membraner mot benvev kultursupernatanter og inn bein fragmenter som er oppdaget ved 24-timers med BLI. (A) BLI signal avslørende forbedret migrasjon mot dyrkningssupernatanter avledet fra en gitt THR prøve vs. kontroll medium. (B ) BLI signal demonstrere vandringsmønster av brystkreft celler i tre beinfragmenter fra en enkelt THR prøven. Bein vevfragmenter er merket med hvite stiplede sirkler. Kontrollbrønner som inneholder glassperler vises på bunnen. 
Figur 6:.. Påvisning av MDA-MB-231fLUC-EGFP celler i marrows spyles fra koloniserte fragmenter (A) Fragmenter uten (til venstre) og med (høyre) kolonisbrystkreftceller, som oppdaget av BLI (B) Analyse av gresskar spyles fra fragmenter (A) ved flav cytometri. EGFP-positive brystkreft celler ble oppdaget i marg spylt fra BLI-positive fragment, men ikke den BLI-negative fragment. (C) BLI deteksjon av brystkreft cellekolonier som følge av kulturen i margen spyles fra en BLI-positiv fragment. (d) fluorescens-mikroskopi av margrommet spyles fra en BLI-positive fragment, som viser MDA-MB-231fLUC-EFGP celler i et felt av margceller. 
Fig. 7: Måling levedyktighet viabilities for margceller spyles fra vev fragmenter isolert fra 4 THR eksemplarer umiddelbart etter innsamling og ved 24, 48, 72 timer og 6 dagers dyrking i DMEM-10% FBS. Mediet ble skiftet ved 24 og 72 timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mehra et al., Har tidligere beskrevet en postmortem innsamling og analyse av prøver fra beinmetastatisk prostata kreftpasienter høstet ved tidspunktet for autopsi, avslører høykvalitets vev og validere anvendelse av humane ben prøver for å studere den metastatiske prosess 47. Her har vi beskrevet protokoller for innsamling, bearbeiding og bruk av menneskelige bein vev fragmenter hentet fra kasserte femoral hoder følgende THR kirurgi i et kortsiktig co-kultur system for å studere bryst celle migrasjon, kolonisering og spredning. Ca 300.000 hip erstatning surgeries utføres årlig i USA (American Academy of Orthopaedic Surgeons, Orthoinfo.aaos.org), og disse prøvene er vanligvis forkastet. En av de hyppigste indikasjoner for denne operasjonen er slitasjegikt i hofteleddet, som fører til gradvis nedbryting av brusk flater dekker lårbenshodet, noe som resulterer i leddsmerter. Under total hip replacement kirurgi en liten del av det øvre lårbenet blir fjernet sammen med lårbenshodet. Femur er et felles nettsted for brystkreft metastaser 48, og disse prøvene inneholder trabecular benvev, stedet for metastatisk brystkreft celle kolonisering. De fleste pasienter som gjennomgår hofteprotese er 50-80 år gammel, en aldersgruppe som brak årene med topp brystkreft forekomst. Dermed disse vev utgjør en verdifull ressurs for å studere brystkreft beinmetastatisk nisje.
Det er flere viktige skritt og hensyn knyttet til disse teknikkene. Først, er en god kvalitet kirurgisk ronguer avgjørende for å trekke ut de små trabekulære bein fragmenter mens du holder lårbenshodet i motsatt, hansker hånd. Pinsett vil ikke fungere fordi de ikke er solid nok til å trekke trabecular vev som inneholder miner spicules. En annen viktig faktor i disse analysene gjelder brystkreft cellelinje håndtering og passaging, spesisielt i forhold til trekk analyser. Langsiktig passasje og / eller variasjon i trypsinering prosedyrer kan føre til sekvensiell utvalg av mer / mindre seig celle populasjoner, potensielt endre trekk responser i eksperimenter. En annen problemstilling er knyttet til standardisering av eksperimenter, gitt variasjonen av kirurgiske vev innhentet fra pasienter i ulike aldre og sykdomstilstander. For å løse dette, ansetter vi en intra-faget eksperimentell design der alle variabler er testet i tre eksemplarer (f.eks, over tre fragmenter / eksperimentelle brønner kontra tre fragmenter / kontrollbrønner) ved hjelp av fragmenter fra en gitt pasientens kirurgiske prøven. Variabler kan testes ved hjelp av dette designet på prøver fra flere pasienter, og analysert for statistisk signifikans ved hjelp av paret T-test for data, fordelt på gjentak, og / eller en innenfor-fagene enveis ANOVA for data over replikater. Og til slutt, er en primær begrensning av denne metode den korte vindu av viability under eksplantat kultur.
Våre målinger avslørte marg viabilities av ~ 90% på dagen av samlingen, i tråd med levedyktighet målinger innhentet fra benmarg aspirates 49. Over tid vil imidlertid, ble det observert en gradvis nedgang i løpet av dager, to og tre, med dramatisk tap av levedyktighet ved dag 6. Selv om vi ikke har målt levedyktighet av mineralisert rommet, kvalitative observasjoner tyder på at det er en tilsvarende nedgang i levedyktigheten ben-fôr osteoblaster og osteocytter, som sett i figur 4D. Basert på disse eksperimentene, har vi begrenset våre kultur eksperimenter til korttidsstudier utført i løpet av 48 eller 72 timer. Innledende forsøk (ikke inkludert) indikerte at levedyktighet kan forbedres ved hjelp av kommersielt tilgjengelige medier formulert for å opprettholde marg cellene. Men vi har ikke preget marg cellepopulasjoner i disse eksperimentene, og vet ikke om de forbedrede levedyktighet resultatene fra den valgteutvekst av visse marg celle subpopulasjoner. Utvikling av protokoller for å opprettholde og forlenge levedyktigheten til disse explants vil være viktig for å fremme denne modellsystem.
Selv om denne modellen er begrenset til korte tidsperioder, dets viktige fordeler i forhold til andre metoder inkluderer følgende funksjoner: 1) intakte 3-dimensjonale vev skjuler relevante celletyper som utgjør den menneskelige bein mikromiljøet, 2) tilgjengelighet til beinet mikromiljø for overvåking og forstyrrende dynamiske interaksjoner, 3) høyt antall fragmenter per eksemplar for gjentatte forsøk, og 4) lav pris i forhold til dyremodeller.
Mens vi har beskrevet analyser for å studere brystkreft metastaser i ben, kan disse preparater og metoder lett bli utvidet til studiet av andre bensøkende ondartede sykdommer slik som prostatakreft, samt andre bein patologier. Selv om vi har brukt de kasserte femoral hoder først og fremst som en såurce av vev fragmenter, disse prøvene utgjør også en ekstra kilde til menneskelig benmarg, som tradisjonelt samlet inn gjennom benmarg aspirasjon fra unge frivillige. Og til slutt, mens vi har beskrevet fremgangsmåter ved bruk av cellelinjer konstruert for bioluminescens og fluorescens, de fleste av fremgangsmåtene kan bli modifisert for bruk med andre celler hvis disse cellelinjer og / eller avbildningsplattformer er ikke tilgjengelige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Disse studiene ble finansiert delvis med tilskudd fra Alternativ Research and Development Foundation (107 588), National Institute of Health (1U54CA136465-04S1), og den California Breast Cancer Research Program (201B-0141). Vi takker legene. Andrew Wilber og R. Scott McIvor for den generøse donasjon av deres
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (1X) + GlutaMAX-l | Life Technologies | 10569-010 | Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| McCoy's 5A Medium (1X) | Life Technologies | 16600-082 | Supplement all McCoy's with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillen Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Blastocidin (10 mgl/ml) | InvivoGen | ant-bl | Supplement media used for transfected cell lines. |
| Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size) | Corning Incorporated | 353097 | |
| Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate | Corning Incorporated | 353504 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells* | Invitrogen Detection Technologies | L-3224 | |
| FluoroBrite DMEM | Life Technologies | A18967-01 | |
| D-luciferin firefly, potassium salt 5 g (30 mg/ml) | Life Technologies | L-8220 | |
| Sterile Cell Strainer 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3516 | |
| 12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3513 | |
| 24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3526 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Bone wax | Surgical Specialties Corporation | 903 | |
| IVIS 50 Imaging Platform | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | ||
| Living Image Software Program | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | 133026 | |
| EVOS FL Imaging System | Life Technologies | Version 4.2 | |
| OsteoSense 680 EX | PerkinElmer | NEV10020EX | |
| MCF-7 breast cancer cells | ATCC | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | HTB-26 | |
| Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody | DAKO Cytomation | Clone (AE1/AE3) |
References
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13, 227 (2011).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
- Bissell, M. J., Radisky, D. Putting tumours in context. Nat Rev Cancer. 1, 46-54 (2001).
- Coleman, R. E., Rubens, R. D. The clinical course of bone metastases from breast cancer. British journal of cancer. 55, 61-66 (1987).
- Mundy, G. R. Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities. Nat Rev Cancer. 2, 584-593 (2002).
- Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
- Clarke, B. Normal bone anatomy and physiology. Clin J Am Soc Nephrol. 3, Suppl 3. S131-S139 (2008).
- Weatherholt, A. M., Fuchs, R. K., Warden, S. J. Specialized connective tissue: bone, the structural framework of the upper extremity. Journal of hand therapy : official journal of the American Society of Hand Therapists. 25, 123-131 (2012).
- Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicologic pathology. 34, 548-565 (2006).
- Casimiro, S., Guise, T. A., Chirgwin, J. The critical role of the bone microenvironment in cancer metastases. Molecular and cellular endocrinology. 310, 71-81 (2009).
- Patel, L. R., Camacho, D. F., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. Mechanisms of cancer cell metastasis to the bone: a multistep process. Future Oncol. 7, 1285-1297 (2011).
- Goldstein, R. H., Weinberg, R. A., Rosenblatt, M. Of mice and (wo)men: mouse models of breast cancer metastasis to bone. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 25, 431-436 (2010).
- Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochemical and biophysical research communications. 394, 443-447 (2010).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212 (2006).
- Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer metastasis reviews. 33, 721-735 (2014).
- Schiller, K. R., et al. Secretion of MCP-1 and other paracrine factors in a novel tumor-bone coculture model. BMC Cancer. 9, 45 (2009).
- Curtin, P., Youm, H., Salih, E. Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex-vivo co-cultures of live calvarial bones and cancer cells. Biomaterials. 33, 1065-1078 (2012).
- Krishnan, V., et al. Dynamic interaction between breast cancer cells and osteoblastic tissue: comparison of two- and three-dimensional cultures. Journal of cellular physiology. 226, 2150-2158 (2011).
- Krishnan, V., Vogler, E. A., Sosnoski, D. M., Mastro, A. M. In vitro mimics of bone remodeling and the vicious cycle of cancer in bone. Journal of cellular physiology. 229, 453-462 (2014).
- Bussard, K. M., Venzon, D. J., Mastro, A. M. Osteoblasts are a major source of inflammatory cytokines in the tumor microenvironment of bone metastatic breast cancer. Journal of cellular biochemistry. 111, 1138-1148 (2010).
- Sosnoski, D. M., Krishnan, V., Kraemer, W. J., Dunn-Lewis, C., Mastro, A. M. Changes in Cytokines of the Bone Microenvironment during Breast Cancer Metastasis. International journal of breast cancer. 2012, 160265 (2012).
- Bussard, K. M., et al. Localization of osteoblast inflammatory cytokines MCP-1 and VEGF to the matrix of the trabecula of the femur, a target area for metastatic breast cancer cell colonization. Clinical & experimental metastasis. 27, 331-340 (2010).
- Kuperwasser, C., et al. A mouse model of human breast cancer metastasis to human bone. Cancer research. 65, 6130-6138 (2005).
- Rosenblatt, M. A tale of mice and (wo)men: development of and insights from an 'all human' animal model of breast cancer metastasis to bone. Transactions of the American Clinical and Climatological Association. 123, 135-150 (2012).
- Oh, H. S., et al. Bone marrow stroma influences transforming growth factor-beta production in breast cancer cells to regulate c-myc activation of the preprotachykinin-I gene in breast cancer cells. Cancer research. 64, 6327-6336 (2004).
- Moharita, A. L., et al. SDF-1alpha regulation in breast cancer cells contacting bone marrow stroma is critical for normal hematopoiesis. Blood. 108, 3245-3252 (2006).
- Koro, K., et al. Interactions between breast cancer cells and bone marrow derived cells in vitro define a role for osteopontin in affecting breast cancer cell migration. Breast cancer research and treatment. 126, 73-83 (2011).
- Pohorelic, B., et al. Role of Src in breast cancer cell migration and invasion in a breast cell/bone-derived cell microenvironment. Breast cancer research and treatment. 133, 201-214 (2012).
- Nicola, M. H., et al. Breast cancer micrometastases: different interactions of carcinoma cells with normal and cancer patients' bone marrow stromata. Clinical & experimental metastasis. 20, 471-479 (2003).
- Korah, R., Boots, M., Wieder, R. Integrin alpha5beta1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer research. 64, 4514-4522 (2004).
- Martin, F. T., et al. Potential role of mesenchymal stem cells (MSCs) in the breast tumour microenvironment: stimulation of epithelial to mesenchymal transition (EMT). Breast cancer research and treatment. 124, 317-326 (2010).
- Kapoor, P., Suva, L. J., Welch, D. R., Donahue, H. J. Osteoprotegrin and the bone homing and colonization potential of breast cancer cells. Journal of cellular biochemistry. 103, 30-41 (2008).
- Chen, X., Lu, J., Ji, Y., Hong, A., Xie, Q. Cytokines in osteoblast-conditioned medium promote the migration of breast cancer cells. Tumour biology : the journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine. 35, 791-798 (2014).
- Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35, 2454-2461 (2014).
- Marlow, R., et al. A novel model of dormancy for bone metastatic breast cancer cells. Cancer research. 73, 6886-6899 (2013).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Hutmacher, D. W., et al. Can tissue engineering concepts advance tumor biology research. Trends in biotechnology. 28, 125-133 (2010).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature reviews. Molecular cell biology. 7, 211-224 (2006).
- Hutmacher, D. W. Biomaterials offer cancer research the third dimension. Nature. 9, 90-93 (2010).
- Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in cancer biology. 15, 365-377 (2005).
- Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology advances. 32, 1256-1268 (2014).
- Dhurjati, R., Krishnan, V., Shuman, L. A., Mastro, A. M., Vogler, E. A. Metastatic breast cancer cells colonize and degrade three-dimensional osteoblastic tissue in vitro. Clinical & experimental metastasis. 25, 741-752 (2008).
- Mastro, A. M., Vogler, E. A. A three-dimensional osteogenic tissue model for the study of metastatic tumor cell interactions with bone. Cancer research. 69, 4097-4100 (2009).
- Contag, C. H., et al. Monitoring dynamic interactions between breast cancer cells and human bone tissue in a co-culture model. Molecular imaging and biology : MIB : the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 16, 158-166 (2014).
- Multhaup, M., et al. Cytotoxicity associated with artemis overexpression after lentiviral vector-mediated gene transfer. Human gene therapy. 21, 865-875 (2010).
- Thorne, S. H., et al. CNOB/ChrR6, a new prodrug enzyme cancer chemotherapy. Mol Cancer Ther. 8, 333-341 (2009).
- Mehra, R., et al. Characterization of bone metastases from rapid autopsies of prostate cancer patients. Clin Cancer Res. 17, 3924-3932 (2011).
- Riccio, A. I., Wodajo, F. M., Malawer, M. Metastatic carcinoma of the long bones. Am Fam Physician. 76, 1489-1494 (2007).
- Ahmann, G. J., et al. Effect of tissue shipping on plasma cell isolation, viability, and RNA integrity in the context of a centralized good laboratory practice-certified tissue banking facility. Cancer epidemiology, biomarkers & prevention : a publication of the American Association for Cancer Research, cosponsored by the American Society of Preventive Oncology. 17, 666-673 (2008).
