Summary
Protokoller er beskrevet til at studere brystcancercelle migration, proliferation og kolonisering i et humant knoglevæv eksplantatet modelsystem.
Abstract
Bone er den mest almindelige sted for brystkræft metastaser. Selv om det er almindeligt accepteret, at mikromiljø påvirker kræft celle adfærd, er lidt om brystkræft celle egenskaber og adfærd inden for native mikromiljø af humant knoglevæv. Vi har udviklet metoder til at spore, kvantificere og modulerer humane brystkræftceller i mikromiljø dyrkede humane knogle vævsfragmenter isoleret fra kasserede femurhoveder efter total hoftealloplastik operationer. Brug af brystkræftceller manipuleret for luciferase og forbedrede grønt fluorescerende protein (EGFP) udtryk, er vi i stand til at reproducerbart kvantificere migration og spredning mønstre ved hjælp af bioluminescens imaging (BLI), spor celleinteraktioner inden knoglerester ved hjælp af fluorescens mikroskopi, og evaluere brystceller efter kolonisering med flowcytometri. De vigtigste fordele ved denne model omfatter: 1) en indfødt, arkitektonisk intakt væv microenvironment der omfatter relevante humane celletyper, og 2) direkte adgang til mikromiljø, hvilket letter hurtig kvantitativ og kvalitativ overvågning og forstyrrelse af bryst og ben celle egenskaber, adfærd og samspil. En primær begrænsning, på nuværende tidspunkt, er det endelige levedygtighed vævsfragmenter, der begrænser vinduet i studiet til kortsigtet kultur. Anvendelser af modelsystemet omfatter studere den grundlæggende biologi brystkræft og andre knogle-søger maligniteter i metastatisk niche, og udvikle terapeutiske strategier til effektivt målrettet brystkræftceller i knoglevæv.
Introduction
Tumoren mikromiljø er bredt anerkendt som en kritisk faktor for kræft celle opførsel under brystkræft progression og metastatisk spredning 1-3. Målet med fremgangsmåden fremlagt her er at lette undersøgelsen af brystcancerceller i mikromiljøet af humant knoglevæv, den hyppigste sted for brystkræft metastase 4-6. Bone består af mineraliseret og marv rum 7-9, som begge huser celler og secernerede faktorer impliceret i metastatisk progression 10,11. Selvom meget udbredt i vivo musemodeller lette systemiske undersøgelser af den metastatiske proces 12-15, celle interaktioner inden skelettet er ikke let tilgængelige for observation og direkte forstyrrelse. Modelsystemer til at studere og dyrkning mus knoglevæv og mus marv celler giver bedre adgang og har givet mange indsigter om krydstale og mekanismer der ligger til grund brystkræft celle metastasis af det murine skelet 16-22. Men undersøgelser har antydet, at der kan være artsspecifikke mønstre af osteotropism for knoglevæv 23,24. Disse mønstre kan afspejle iboende artsspecifikke forskelle i knoglevæv egenskaber, forskelle som følge af ændrede knoglemarv befolkninger i immun-mangel mus 11, og / eller den relativt unge alder af mus anvendes til forsøg, som alle er sandsynlige determinanter for knoglen mikromiljø.
In vitro fremgangsmåder til at studere brystcancerceller i humane knogler co-kulturer har typisk fokuseret på specifikke knogle celletyper såsom marvafledte osteoblaster eller stromale celler dyrket som monolag eller inden manipulerede 3-dimensionel model systemer 25-35. Selvom 2-dimensional cellekulturmodeller har dannet grundlaget for in vitro metoder til kræftforskning, har det længe været anerkendt, at celle adfærd fundamentalt ændres hos monolayer dyrkningssystemer 18,36,37. Dette har ført til udvikling af manipulerede mikromiljøer, som efterligner kompleksiteten af 3-dimensionelle levende væv, herunder matrix- og scaffold-baserede modeller sammensat af naturlige materialer såsom collagen, eller syntetiske polymerer podet med specifikke celletyper til at skabe vævslignende mikromiljøer 36-41. Udviklet tilgange har også brugen af bioreaktor platforme til at kontrollere og studere hormonale miljø i mikromiljø 18,19,41-43. Selv biomimetiske modeller og bioreaktorer giver mange elementer af et komplekst væv mikromiljø i en kontrolleret indstilling, og er blevet anvendt med held til at fremme studiet af brystkræft metastase til knogle 18,19,35,42,43, behøver konstruerede modelsystemer generelt ikke optage det fulde spektrum af celletyper og ekstracellulære matrixbestanddele til stede i det native knogle miljø.
Indtil for nylig, brystcancerceller er ikke blevet undersøgt i det native, intakte, 3-dimensionelle mikromiljø humane knoglevæv. Vi har for nylig rapporteret udvikling af en co-kultur model ved hjælp af menneskelige knogle vævsfragmenter isoleret fra total hoftealloplastik (THR) kirurgi prøver 44. Disse prøver havnen både de mineraliserede og marv rum, der er nødvendige for at studere mekanismerne bag mikro-metastaser på kort sigt kultur. I tidligere arbejde etablerede vi proof-of-principle for brug af bioluminescens imaging (BLI) til at overvåge udbredelsen af luciferase-udtrykkende brystkræftceller (MDA-MB-231-Fluc) co-dyrket med knoglerester 44. Her præsenterer vi detaljerede forsøgsprotokoller til at studere brystkræft celle kræft proliferation, kolonisering, og migration inden for rammerne af den native mikromiljø ved anvendelse af human knogle vævseksplantater.
Først præsenterer vi en protokol for co-dyrkning brystkræftceller støder op til knoglerester til at måle brystcelleproliferation ved hjælp BLI. I dette afsnit er bryst-suspensioner seedet som celle pletter i 6-brønds plader støder op til knoglerester, som er immobiliseret ved stykker af knogle voks. Kontrolbrønde indeholder knoglevoks, men ingen knogle fragment. Når celle spots vedhæfte tilsættes medium og pladen dyrkes i 24 timer, hvorefter bioluminescerende signal intensitet (associeret med celle nummer) måles med BLI. I det næste trin præsenteres metoder til co-dyrkning af brystcancerceller podet direkte på knoglerester at studere kolonisering og proliferation. Her bryst cellesuspensioner pipetteres direkte på knoglevævet fragmenter, som overvåges i kultur ved BLI og fluorescensmikroskopi tiden at spore kolonisering og celleantal. Ved denne fremgangsmåde kan marven rum skylles fra knoglerester på ethvert tidspunkt til analyse af koloniserede brystcancerceller ved flowcytometri eller marv levedygtighed assays.
Derudover har vi deaktiveresScribe to forskellige tilgange til måling brystkræft celle migration. Ved den første metode er skitseret trin til måling af migrering til knoglevæv kultursupernatanter. I denne protokol brystcancercellerne podes på den indre, øvre overflader af Transwell indsætte membraner med en 8 um porestørrelse (som vist i figur 1A). Skærene bliver derefter anbragt i en modtager plade med brønde indeholdende knoglevæv supernatant eller kontrol medie. I løbet af en 20 timers inkubationsperiode lille antal brystcancerceller migrerer gennem indsatsen membraner ned i de nedre vævskulturbrønde hvor de er tilsluttet til påvisning af BLI. I den anden overførselsmetode brystcancercellerne podes på de nedre, ydre overflader af Transwell insert membraner. Bone vævsfragmenter anbringes i insert bægre og brystcancerceller migrerer op gennem membranerne til at kolonisere knoglerester (som vist i figur 1B), somderefter filmede med BLI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Femurhoveder blev indsamlet fra patienter, der gennemgår elektiv THR kirurgi i Ortopædkirurgisk Afdeling på Stanford University School of Medicine. Alle væv blev indsamlet som de identificerede fælder i overensstemmelse med reglerne i Stanford University Research compliancefunktion.
1. Valg af en brystcancercellelinie (s)
- Opnå eller transficere den ønskede brystcancer-cellelinie (r) med en luciferase-GFP reporter konstrukt. De følgende eksperimenter blev udført under anvendelse af MDA-MB-231 og MCF-7-brystcancercellelinier manipuleret til stabil ekspression af ildflue-luciferase (Fluc) og et forstærket grønt fluorescerende protein (EGFP) ved transfektion med Sleeping Beauty transposon plasmid pKT2 / LuBiG og transposasen plasmid PK / hUbiC-SB11 45,46.
BEMÆRK: De transficerede cellelinier benævnes MDA-MB-231-Fluc-EGFP og MCF-7-Fluc-EGFP.
2. Isolering Tissue Fragments fra femurhoveder
- Efter THR kirurgi, indsamle det kasserede lårbenshovedet i en steril beholder fyldt med fysiologisk saltvand. Prøven overføres til laboratoriet og behandle den inden 1-3 timer af operationen. Bemærk: Hvis der er en forsinkelse i behandlingen, skal du placere prøven ved 4 ° C.
- Forbered et arbejdsområde ved at placere følgende ting på et absorberende mat i en laminar strømning vævskultur hætte: sterile handsker, kirurgisk rongeur, pincet, bæger med 70% isopropanol at skylle instrumenter og vævskultur fartøjer som anført nedenfor for hver type eksperiment .
- Iført en steril kirurgisk handske til at holde runde lårbenshovedet i den ene hånd, bruge rongeur i den anden hånd til at udtrække trabekulær knogle fragmenter af ønsket størrelse (~ 2-5 mm) fra den blotlagte øvre aksel lårbenet. Overfør knoglefragmenter i dyrkningsbeholderen (f.eks, 6-, 12- eller 24-brønds vævskulturplade eller migration kammer), afhængigt af typen af proliferation, colonization eller migration eksperiment som beskrevet i trin 3, 4 eller 5.
BEMÆRK: knoglevæv fragmenter skal høstes som beskrevet ovenfor efter afslutningen af den indledende trin for hver specifik proliferation, kolonisering eller migration assay. Fragmenter vil variere i størrelse som vist i figur 2. Fragmenter kan vejes før eller efter forsøg med henblik på standardisering.
3. samdyrkning Breast Cancer Cells Tilstødende til knoglerester at måle Breast Cell Proliferation Brug BLI
- Forud for forsøget, udarbejder en suspension indeholdende 2 x 10 5 brystkræftceller / 50 pi, og forberede propper af knogle voks til immobilisering knoglerester i kultur. Skær en P200 mikropipettespids i 3 stykker og bruge den smalle ende af det største stykke i en "cookie cutter" måde at skære små (~ 35 mg) benstykker voks. Brug den brede ende af den mindste at skubbe knoglevoks stik i en petriskåltil opbevaring.
- Læg et stykke knogle voks ved 12:00 position hver brønd og tryk forsigtigt ned med en steril-behandsket pegefinger.
- Pipette 50 pi cellesuspension indeholdende 1 x 10 5 brystcancerceller i DMEM-10% FBS + pen-strep i midten af hver brønd i en 6-brønds plade. (Alternativt frø celler i en spredt mønster, hvis det ønskes.) Pladen anbringes i et 37 ° C vævsdyrkningsinkubator i 45 min for at fremme cellebinding.
- Placer 1 knogle fragment på 1 stykke knogle voks for hver eksperimentel godt og tryk forsigtigt med rongeur at sikre det. Udfør eksperimenter i triplikat, således at 3 knoglerester fra en given THR prøven placeres i de øverste tre brønde, mens de nederste tre brønde indeholder knoglevoks kun som kontroller.
- Anvendelse af en 5 ml pipette, forsigtigt og langsomt afgiver 5 ml DMEM-10% FBS til den side af hver brønd for at undgå løsner bryst celler eller knoglerester. Pladen anbringes i et 3776; C vævskultur inkubator i 20-24 timer.
- For at udføre bioluminescens imaging (BLI) at fjerne pladen fra inkubatoren og tilføj luciferin substrat (for at opnå en koncentration på 300 ug / ml) til hver brønd. Billede pladen straks på en IVIS Imaging Platform anvendelse af følgende parametre: f-stop på 1, lille binning, eksponeringstid på 1 sek, niveau D. Mål signal intensitet hver samt gennemsnitlig radians (fotoner / sekund / kvadratcentimeter / steradian).
- Brug imaging software til at definere områder af interesse (ROI) for at kvantificere den gennemsnitlige udstråling for alle eksperimentelle og kontrol brønde. Eksport gennemsnitlige udstråling værdier til et Excel ark til at udføre statistiske og generere grafer.
4. Co-dyrkning Breast Cancer Cells Udsåede direkte på knoglerester at studere kolonisering og Cell Antal
- Brug pincet til at placere knoglefragmenter direkte ind i de tomme brønde i en 24-brønds vævskulturplade (1 fragment / brønd).
- Pipette en 50 pi cellesuspension dråbe DMEM-10% FBS indeholdende 1 X oktober 3-06 brystcancerceller direkte på toppen af hver knogle fragment. Pladen anbringes i en 37 ° C vævskultur inkubator i 45 min for at fremme cellebinding. Forsigtigt tilføje 1-2 ml DMEM-10% FBS i siden af hver brønd, således at fragmentet fuldstændigt er neddykket i medium. Inkubér pladen i en 37 ° C vævskultur inkubator i 20-24 timer.
- Efter inkubation bruge pincet til at overføre hver knoglevæv fragment til en frisk 24-brønds plade indeholdende 1 ml DMEM-10% FBS i hver brønd. For at udføre BLI følge trin 3,6-3,7 ovenfor. Derudover kan fragmenter ses ved hjælp af en fluorescens mikroskop, eller skylles for at opnå marven befolkning til analyser af brystkræft celletal og egenskaber som beskrevet i trin 6.
- For at forberede de intakte fragmenter til kvalitativ evaluering ved fluorescens mikroskopi efter BLI, pipette 5 pi fluorescerende mærkning bisfosfonat opløsning (præforhold i overensstemmelse med producentens anvisninger) til hver brønd for at mærke de mineraliserede spikler fra knoglerester. Inkubér pladen i vævskultur inkubator i yderligere 24 timer.
- Efter 24 timer af kultur i fluorescerende mærkning bisphosphonat opløsning pincet til at overføre fragmenterne til vævskulturplader indeholdende phenolrødt-frit medium og visning ved hjælp af et fluorescensmikroskop konfigureret til billedet GFP (485 nm) og bisphosphonat etiket (680 nm).
5. Måling Migration for brystkræft celler til knoglevæv Fragmenter og dyrket Bone Fragment Supernatanter
- Migrering til knoglevæv kultursupernatanten.
BEMÆRK: Udfør eksperimenter i triplikat, således at 3-fragmenter fra en given THR prøve anvendes til at generere 3-supernatanter. For hvert forsøg, er migration sammenlignes på tværs af tre brønde indeholdende knogle supernatanter vs. tre brønde, der kun indeholder kontrol medium.- Generer knogle tissue supernatanter ved at placere knoglefragmenter i brøndene på en 12-brønds plade indeholdende 2,2 ml DMEM-10% FBS per brønd. Kultur i en 37 ° C vævskultur inkubator i 24 timer. Træk mediet ved 24 timer og erstatte med 2,2 ml frisk DMEM-10% FBS. Treat kontrolbrønde indeholdende DMEM-10% FBS på samme måde.
BEMÆRK: Mediet ændres på 24 timer for at fjerne faktorer udskilles som respons på væv traumer som følge af kirurgi. Fordi knogle væv supernatanter genereres i FBS medium, brønde indeholdende FBS medium kun er medtaget for at kontrollere for bidrag FBS til brystkræft celle migration. - Ved 48 timer, indsamle 0,9 ml af hver supernatant / kontrolmedium og pipette i brøndene på en modtager plade. Indsatserne vil senere blive placeret i disse brønde. Inkubér modtageren pladen i vævsdyrkningsinkubator mens podning inserterne. Bemærk: Den resterende supernatant (~ 1 ml efter fordampning) kan opsamles til analyse af secretome factors om ønsket 44.
- Til frø Transwell skær, placere dem i en standard, tom 24-brønds vævskulturplade. Pipette 350 pi cellesuspension indeholdende 1 x 10 5 brystcancerceller i DMEM-10% FBS på den øvre, indre membran overflade af hver indsats som vist i figur 1A. Placer 24-brønds plade indeholdende de podede skær i 37 ° C vævskultur inkubator i 45 min for at fremme vedhæftning.
- Når cellerne er bundet til indsatsene pincet til at overføre indsatserne til modtageren plade ifølge producentens anvisninger. Vinkel hver indsats når det lægges i modtageren godt for at forhindre bobledannelse mellem indsatsen membranen og modtageren godt supernatant. Inkubér modtageren plade med skær i 20 timer i et 37 ° C vævsdyrkningsinkubator.
BEMÆRK: Kontroller bunden af modtageren plade for bobler mellem indsatsen membranen og modtageren godt supernatant. Hvis bobler er synlige, skal du fjerne de specifikke indsatser og placere dem igen i modtageren godt, indtil der ikke er luftbobler. - Efter 20 timers brug pincet til at fjerne indsatserne fra modtageren plade. Under anvendelse af fremgangsmåderne i trin 3,6-3,7 udføre BLI til afbildning af celler, der har migreret ind i og fastgjort til bunden af receiveren brønde.
- Generer knogle tissue supernatanter ved at placere knoglefragmenter i brøndene på en 12-brønds plade indeholdende 2,2 ml DMEM-10% FBS per brønd. Kultur i en 37 ° C vævskultur inkubator i 24 timer. Træk mediet ved 24 timer og erstatte med 2,2 ml frisk DMEM-10% FBS. Treat kontrolbrønde indeholdende DMEM-10% FBS på samme måde.
- Migration mod knogle vævsfragmenter.
BEMÆRK: Udfør eksperimenter i triplikat, således at 3-fragmenter fra en given THR prøve anbringes i 3 separate indsatser, og 3 glasperler er placeret i 3 separate indsatser som kontroller.- Forbered modtageren plade ved pipettering 0,9 ml DMEM-10% FBS til hver brønd. Placer den i vævsdyrkningsinkubator samtidig forbereder indsatserne.
- Til frø indsatserne vendes dem på overfladen af en plastikmikrofugerør boks, der har et låg. Pipette en 50 pi cellesuspension dråbe DMEM-10% FBS indeholdende 1 x 10 5 brystkræftceller directly på den ydre, nedre overflade af hver indsats membran (som vender opad på de omvendte skær). Dæk mikrofugerøret kasse med låget revnede og overføre den til 37 ° C væv inkubator i 45 minutter for at fremme cellebinding.
- Overfør mikrofugerøret boksen til vævskultur hætte og bruge pincet til at dreje podede skær højre side op og overføre dem i brøndene på modtageren plade. Pipette 0.450 ml DMEM-10% FBS i hver indsats kop. Ved hjælp af en pincet, overføre et knoglevæv fragment (~ 3 mm) i hver forberedt insert kop. Eventuelt bruge glasperler som negative kontroller i yderligere brønde. Pladen anbringes i en vævsdyrkningsinkubator i 20 timer.
- Til måling migration, udarbejde en standard 24-brønds vævskulturplade indeholdende 1 ml DMEM-10% FBS per brønd. Fjern modtageren plade fra inkubatoren og bruge pincet til at overføre knoglerester og perler fra hver indsats i separate brønde i standard plade. Tilføj luciferinsubstrat (for at opnå en slutkoncentration på 300 ug / ml) til hver brønd og udføre BLI anvendelse af procedurerne i trin 3,6-3,7.
6. Yderligere før og efter eksperimentelle analyser
- Analyse af skyllet marv.
- Overfør et knoglefragment i en 70 um cellefilter placeret på toppen af en 50 ml konisk rør. Brug en 10 ml sprøjte med en 25 G nål til at skylle kraftigt fragmentet med 10 ml PBS til opnåelse af en suspension af marvceller i den koniske rør. Centrifugeres cellesuspensionen i 3 minutter ved 300 xg og 21 ° C, aspireres supernatanten og resuspender de pelleterede celler i PBS eller anden ønsket løsning til flowcytometri.
BEMÆRK: Resuspension mængder vil variere afhængigt af størrelsen af cellepellet efter centrifugering, og anvendelse. - For levedygtighed assays volumener PBS ~ 75-300 pi er hensigtsmæssige, og disse suspensioner kan analyseres ved hjælp af kommercielt tilgængelige fluorescence baserede levedygtighed assays ifølge producentens anvisninger, pipetteret i et konventionelt hæmocytometer og talt under anvendelse af et inverteret fluorescensmikroskop.
- For flowcytometrisk analyse og sortering baseret på påvisning af GFP-positive brystcancerceller, resuspender cellepelleten i 1 ml PBS indeholdende 2% FBS, 2 mM EDTA og 10 mM HEPES, således at koncentrationen er 1 x 10 6 celler / ml.
- Overfør et knoglefragment i en 70 um cellefilter placeret på toppen af en 50 ml konisk rør. Brug en 10 ml sprøjte med en 25 G nål til at skylle kraftigt fragmentet med 10 ml PBS til opnåelse af en suspension af marvceller i den koniske rør. Centrifugeres cellesuspensionen i 3 minutter ved 300 xg og 21 ° C, aspireres supernatanten og resuspender de pelleterede celler i PBS eller anden ønsket løsning til flowcytometri.
- H & E farvning og Immunohistokemi.
- At behandle fragmenter til hematoxylin & eosin (H & E) farvning og / eller immunohistokemi placere fragmenter i plastkassetter mærket med en nummer 2 blyant, og nedsænkes i en beholder fyldt med 10% pufret formalin i 24 timer.
- Proces væv til paraffinindlejring, sektionering og farvning under anvendelse af rutinemæssige protokoller, der omfatter en afkalkning skridt at tage højde for de mineraliserede spikler inden for hvert fragment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolering vævsfragmenter fra femurhoveder
Femurhoveder blev indsamlet fra lige mange mandlige og kvindelige patienter (44-90 år), der gennemgår elektiv total hoftealloplastik i Ortopædkirurgisk Afdeling på Stanford University School of Medicine. Hver kasseret lårbenshovedet indeholder en lille del af den øvre lårben, som huser trabekulære knoglevæv sammensat af mineraliserede spikler og marv. Dette væv er tilgængelige gennem kirurgisk eksponeret tværsnit af akslen (figur 2A) ved hjælp af en kirurgisk rongeur at udtrække små fragmenter. Den histologi af de ekstraherede stykker er vist i figur 2B, afslører mineraliserede og marv komponenter. Udseendet af de ekstraherede stykker varierer femurhoveder opnået fra forskellige patienter, der spænder fra gul til rød, afhængigt af indholdet af marv adipocyt som vist i figur 2C. We demonstrere brugen af disse knogle vævsfragmenter i kortsigtede analyser til at måle dynamiske interaktioner med brystkræftceller manipuleret for luciferase og EGFP udtryk.
Co-dyrkning Breast Cancer Cells tilstødende til knoglerester at måle Breast Cell Proliferation hjælp Bioluminescens Imaging
Dyrkningspladen setup for samdyrkning MDA-MB-231-Fluc-EGFP brystcancerceller tilstødende til immobiliserede knoglerester at måle bryst celleproliferation ved hjælp BLI er vist i figur 3A. BLI af pladen ved 24 timer er vist i figur 3B og BLI signal fra 3 eksperimenter, der viser forøget celleproliferation i nærvær vs. fravær af knoglefragmenter er vist i figur 3C.
Co-dyrkning Breast Cancer Cells Udsåede direkte på knoglerester at studere kolonisering og Cell Antal
Kolonisering af MCF-7-Fluc-EGFP calen podet direkte på knogle vævsfragmenter målt via BLI på 24 timer er vist i figur 4A, der viser nedsat signal forbundet med faldende podningsdensitet. En direkte-podede fragment er vist ved 48 timer i figur 4B, efter mærkning med fluorescerende biphosophonate reagens, som afbildes ved fluorescensmikroskopi til at afsløre koloniseringen af brystcancerceller i mineraliserede og marv rum. Disse kolonisering mønstre er også afsløret i direkte-seedede fragmenter forarbejdede post-eksperimentelt for immunhistokemisk farvning med cytokeratin antistof (figur 4C og 4D).
Måling Migration af brystkræft celler til knoglevæv Fragmenter og dyrket Bone Fragment Supernatanter
Migration af MDA-231-Fluc-EGFP celler i hele porøse migration membraner mod knogle væv dyrkningssupernatanter og ind knoglerester detekteres med BLI, som vist i figur 5. En robust migration mønster mod kultursupernatanter afledt fra tre fragmenter af en given THR modellen er vist i figur 5A, der viser øget migration til brønde indeholdende knoglevæv supernatant versus kontrol medium. Selv om ikke alle migrationsmønstre er denne robuste, migrering til knogle supernatanter er typisk større end i retning af kontrol medium i de fleste eksperimenter. En typisk migration mønster i knoglerester fra en given THR modellen er vist i figur 5B.
Analyse af Skyllede courgetter
Derudover viser vi, at marvceller kan skylles fra koloniserede fragmenter, og at kræft skyllet brystcancerceller kan påvises blandt disse celler ved flowcytometri (figur 6B), BLI (figur 6C), og / eller fluorescensmikroskopi (Figur 6D) .
Måling Levedygtighed
Figur 1: Opsætning af migrationseksperimenter. (A) I "fremad migration" eksperimenter, er receiver brønde fyldt med tidligere genererede knogle væv dyrkningssupernatanter. Brystkræft celler, der er podet på den indre, øvre overflader af Transwell membraner insert gelé, der indeholder DME-10% FBS migrerer gennem membranerne og vedhæfte til bunden af brøndene til detektion af BLI. 
Figur 2: Isolering vævsfragmenter fra femurhoveder. (A) ekstraktion fragmenter af trabekulær knogle ved hjælp af en kirurgisk rongeur. (B) Histologi af fragment fast umiddelbart efter ekstraktion fra lårbenet væv viser mineraliseres (hvid pil) og marv (sort pil) rum. (C) trabekulær knogle fragmenter udvundet fra to forskellige femurhoveder viser variation i rød vs. gul marv indhold. 
Figur 3: Co-dyrkning brystkræftceller støder op til knoglerester til at måle bryst celleproliferation hjælp bioluminescens billeddannelse. (A) Kultur plade setup for co-dyrkning MDA-MB-231-Fluc-EGFP brystkræftceller støder op til immobiliserede knoglerester, som angivet med pile: celle lokationer (blå), knogle voks (sort) og knogle fragment (rød ). Positionen af knoglevoks bemærkes også af en sort stiplet cirkel. Pladen er vist før tilsætning af medium. De øverste 3 brønde indeholder knoglefragmenter tøjret til knogle voks og de nederste tre brønde indeholder kun knoglevoks. (B) BLI af pladen på 24 timer. (C) Kvantificering af BLI signaler for MDA-MB-231-Fluc-EGFP-celler vokser i nærvær (lilla søjler) vs. fravær (grønne søjler) Af fragmenter fra tre THR prøver dyrket som beskrevet. For hver THR prøve, søjler repræsenterer gennemsnitlige BLI værdier målt på tværs af 3 fragment indeholdende - vs. 3 kontrolbrønde. Dette resultat viser højere niveauer af proliferation i nærvær vs. fravær af knoglefragmenter. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen (p <0,01). Gengivet med tilladelse 44. 
Figur 4: Påvisning af brystkræftceller podet direkte på knoglerester. (A) Kolonisering af MCF-7-Fluc-EGFP-celler podet direkte på knoglen vævsfragmenter som påvist ved BLI på 24 timer, viste reduceret signal forbundet med faldende podningsdensitet. (B) Direkte-podede fragment ved 48 timer efter podning, og 24 timer efter mærkning med fluorescerende biphosophonate reagens. Fluorescens mikroskopi afslører EGFP + brystkræftceller somforbundet hermed med en mineraliseret spicule (grøn pil) og med fedtceller i marven rum (hvide pile). Disse kolonisering mønstre er også afsløret i direkte-seedede fragmenter behandles til immunhistokemisk farvning med en AE1 / AE3 pan-cytokeratin antistof efter 72 timer af co-kultur (C) og (D). I (C) cytokeratin-positive brystcancerceller, angivet med pile, observeres der støder op til adipocyter i marven rum. I (D) en cytokeratin-positive brystcancercelle observeres fastgjort til en mineraliseret spicule. (C) og (D) gengivet med tilladelse 44. 
Figur 5:. Måling migration af brystcancerceller til knoglevævet fragmenter og dyrkede knoglefragment supernatanter Migration af MDA-MB-231-fLuc-EGFP celler i hele porøse migration membraner mod knogle væv dyrkningssupernatanter og ind knoglerester opdaget ved 24 timer med BLI. (A) BLI signal afslørende forbedret migrering til dyrkningssupernatanter afledt fra en given THR aftryk vs. kontrol medium. (B ) BLI signal demonstrerer migration mønster af brystkræftceller i 3 knoglerester fra en enkelt THR eksemplar. Bone vævsfragmenter er angivet med hvide stiplede cirkler. Kontrolbrønde indeholdende glasperler er vist på bunden. 
Figur 6:.. Påvisning af MDA-MB-231fLUC-EGFP celler i græskar skylles ud koloniserede fragmenter (A) Fragmenter uden (venstre) og med (til højre) koloniseret brystcancerceller, som påvist ved BLI (B) Analyse af courgetter skyllet fra fragmenter (A) ved flav cytometri. EGFP positive brystcancerceller blev detekteret i knoglemarv skylles fra Bli-positive fragment, men ikke Bli-negative fragment. (C) BLI påvisning af brystkræft cellekolonier følge fra kulturen af marv skylles fra en BLI-positive fragment. (D) Fluorescensmikroskopi af marven rum skylles fra en BLI-positive fragment, der viser MDA-MB-231fLUC-EFGP-celler i et felt af marvceller. 
Figur 7:. Måling levedygtighed levedygtighed for marvceller skylles ud vævsfragmenter isoleret fra 4 THR prøver umiddelbart efter indsamling og ved 24, 48, 72 timer, og 6 dages dyrkning i DMEM-10% FBS. Medium blev ændret ved 24 og 72 timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mehra et al. Har tidligere beskrevet obduktion indsamling og analyse af knogle prøver fra metastatisk prostatacancer patienter høstet på tidspunktet for obduktion, afslørende kvalitet væv høje og validering af anvendelsen af menneskelige knogle prøver at studere den metastatiske proces 47. Her har vi beskrevet protokoller til indsamling, bearbejdning og anvendelse af humane knogle væv fragmenter opnået fra kasserede femurhoveder efter THR kirurgi i en kortsigtet co-kultur for at studere bryst celle migration, kolonisering og proliferation. Ca. 300.000 hofte operationer udføres årligt i USA (American Academy of Orthopaedic Surgeons, Orthoinfo.aaos.org), og disse prøver er typisk kasseres. En af de hyppigste indikationer for denne operation er slidgigt i hofteleddet, hvilket fører til gradvis nedbrydning af brusk overflader dækker lårbenshovedet, hvilket resulterer i ledsmerter. Under total hofte genplaceringent kirurgi en lille del af lårben er fjernet sammen med lårbenshovedet. Lårbenet et fælles sted for brystkræft metastase 48, og disse prøver indeholder trabekulære knoglevæv, stedet for metastatisk brystkræft celle kolonisering. De fleste patienter, der gennemgår hoftealloplastik er 50-80 år, en aldersgruppe, der beslag årene med peak brystkræft incidens. Således disse væv udgør en værdifuld ressource til at studere brystkræft knogle metastatisk niche.
Der er flere kritiske trin og overvejelser forbundet med disse teknikker. Først en god kvalitet kirurgisk ronguer er afgørende for at ekstrahere de små trabekulær knogle fragmenter samtidig holder lårbenshovedet i den modsatte, behandskede hånd. Tang vil ikke arbejde, fordi de ikke er robuste nok til at udtrække trabekulært væv indeholdende mineraliseret spikler. En anden vigtig overvejelse i disse assays angår brystcellelinjen håndtering og passage, særligt i forbindelse med migrationen assays. Langsigtet passage og / eller variation i trypsinering procedurer kan føre til den sekventielle udvælgelse af mere / mindre ihærdige cellepopulationer, potentielt ændre de vandrende reaktioner i forsøg. Et andet spørgsmål vedrører standardisering af eksperimenter, omfatter variationer kirurgiske væv fra patienter i forskellige aldre og sygdomstilstande. For at løse dette, vi ansætter en intra-emne eksperimenterende design, hvor alle variabler testes i tre eksemplarer (fx på tværs af tre fragmenter / eksperimentelle brønde vs. tre fragmenter / kontrolbrønde) ved hjælp af fragmenter fra en given patients kirurgiske eksemplar. Variabler kan testes under anvendelse af dette motiv på prøver fra flere patienter og analyseret for statistisk signifikans ved hjælp af parret t-test for data gennemsnit over gentagelser, og / eller en indenfor-fag envejs ANOVA for data over replikater. Og endelig en primære begrænsning ved denne metode er den korte vindue viaBility under eksplantation kultur.
Vores målinger afslørede marv levedygtighed på ~ 90% på indsamlingsdagen, i overensstemmelse med levedygtighedsmålinger opnået fra knoglemarvsaspirater 49. Over tid, men observerede vi en gradvis nedgang over dage to og tre, med dramatiske tab af levedygtighed ved dag 6. Selv om vi ikke har målt levedygtighed mineraliseret rum, kvalitative observationer tyder på, at der er et tilsvarende fald i levedygtighed knogle-foring osteoblaster og osteocytter, som det ses i figur 4d. På baggrund af disse forsøg har vi begrænset vores kultur eksperimenter til kortsigtede undersøgelser udført i løbet af 48 eller 72 timer. Indledende forsøg (ikke inkluderet) indikerede, at levedygtighed kan forbedres ved anvendelse af kommercielt tilgængelige medier formuleret til at opretholde marvceller. Vi har dog ikke præget marven cellepopulationer i disse forsøg, og ved ikke, om de forbedrede levedygtighed resultater fra det valgteudvækst af visse marv cellesubpopulationer. Udviklingen af protokoller til at opretholde og udvide levedygtighed disse eksplantater vil være vigtigt at fremme denne model system.
Selv om denne model er begrænset til korte perioder, de vigtigste fordele i forhold til andre metoder omfatter følgende funktioner: 1) intakte 3-dimensionelle væv huser relevante celletyper, der udgør den menneskelige knogle mikromiljø, 2) adgangen til benet mikromiljø til overvågning og forstyrrende dynamiske interaktioner, 3) et stort antal fragmenter pr prøve til replikate eksperimenter, og 4) lav pris sammenlignet med dyremodeller.
Mens vi har beskrevet assays til undersøgelse brystkræft metastase til knogle, kan disse prøver og tilgange let udvides til undersøgelse af andre knoglesøgende maligniteter såsom prostatacancer, såvel som andre knogle patologier. Selvom vi har brugt de kasserede femurhoveder primært som såurce af vævsfragmenter, disse prøver udgør også en ekstra kilde til human knoglemarv, som traditionelt indsamlet via knoglemarv aspiration fra unge frivillige. Og endelig, mens vi har beskrevet metoder, der anvender cellelinjer manipuleret for bioluminescens og fluorescens, de fleste af de procedurer, der kan modificeres til brug med andre celler, hvis disse cellelinjer og / eller billeddiagnostiske platforme er ikke tilgængelige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Disse undersøgelser blev finansieret dels ved tilskud fra Alternative forskning og udvikling Foundation (107.588), National Institute of Health (1U54CA136465-04S1), og California Breast Cancer Research Program (201B-0141). Vi takker Drs. Andrew Wilber og R. Scott McIvor for den generøse donation af deres
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (1X) + GlutaMAX-l | Life Technologies | 10569-010 | Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| McCoy's 5A Medium (1X) | Life Technologies | 16600-082 | Supplement all McCoy's with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillen Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Blastocidin (10 mgl/ml) | InvivoGen | ant-bl | Supplement media used for transfected cell lines. |
| Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size) | Corning Incorporated | 353097 | |
| Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate | Corning Incorporated | 353504 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells* | Invitrogen Detection Technologies | L-3224 | |
| FluoroBrite DMEM | Life Technologies | A18967-01 | |
| D-luciferin firefly, potassium salt 5 g (30 mg/ml) | Life Technologies | L-8220 | |
| Sterile Cell Strainer 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3516 | |
| 12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3513 | |
| 24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3526 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Bone wax | Surgical Specialties Corporation | 903 | |
| IVIS 50 Imaging Platform | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | ||
| Living Image Software Program | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | 133026 | |
| EVOS FL Imaging System | Life Technologies | Version 4.2 | |
| OsteoSense 680 EX | PerkinElmer | NEV10020EX | |
| MCF-7 breast cancer cells | ATCC | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | HTB-26 | |
| Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody | DAKO Cytomation | Clone (AE1/AE3) |
References
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13, 227 (2011).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
- Bissell, M. J., Radisky, D. Putting tumours in context. Nat Rev Cancer. 1, 46-54 (2001).
- Coleman, R. E., Rubens, R. D. The clinical course of bone metastases from breast cancer. British journal of cancer. 55, 61-66 (1987).
- Mundy, G. R. Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities. Nat Rev Cancer. 2, 584-593 (2002).
- Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
- Clarke, B. Normal bone anatomy and physiology. Clin J Am Soc Nephrol. 3, Suppl 3. S131-S139 (2008).
- Weatherholt, A. M., Fuchs, R. K., Warden, S. J. Specialized connective tissue: bone, the structural framework of the upper extremity. Journal of hand therapy : official journal of the American Society of Hand Therapists. 25, 123-131 (2012).
- Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicologic pathology. 34, 548-565 (2006).
- Casimiro, S., Guise, T. A., Chirgwin, J. The critical role of the bone microenvironment in cancer metastases. Molecular and cellular endocrinology. 310, 71-81 (2009).
- Patel, L. R., Camacho, D. F., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. Mechanisms of cancer cell metastasis to the bone: a multistep process. Future Oncol. 7, 1285-1297 (2011).
- Goldstein, R. H., Weinberg, R. A., Rosenblatt, M. Of mice and (wo)men: mouse models of breast cancer metastasis to bone. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 25, 431-436 (2010).
- Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochemical and biophysical research communications. 394, 443-447 (2010).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212 (2006).
- Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer metastasis reviews. 33, 721-735 (2014).
- Schiller, K. R., et al. Secretion of MCP-1 and other paracrine factors in a novel tumor-bone coculture model. BMC Cancer. 9, 45 (2009).
- Curtin, P., Youm, H., Salih, E. Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex-vivo co-cultures of live calvarial bones and cancer cells. Biomaterials. 33, 1065-1078 (2012).
- Krishnan, V., et al. Dynamic interaction between breast cancer cells and osteoblastic tissue: comparison of two- and three-dimensional cultures. Journal of cellular physiology. 226, 2150-2158 (2011).
- Krishnan, V., Vogler, E. A., Sosnoski, D. M., Mastro, A. M. In vitro mimics of bone remodeling and the vicious cycle of cancer in bone. Journal of cellular physiology. 229, 453-462 (2014).
- Bussard, K. M., Venzon, D. J., Mastro, A. M. Osteoblasts are a major source of inflammatory cytokines in the tumor microenvironment of bone metastatic breast cancer. Journal of cellular biochemistry. 111, 1138-1148 (2010).
- Sosnoski, D. M., Krishnan, V., Kraemer, W. J., Dunn-Lewis, C., Mastro, A. M. Changes in Cytokines of the Bone Microenvironment during Breast Cancer Metastasis. International journal of breast cancer. 2012, 160265 (2012).
- Bussard, K. M., et al. Localization of osteoblast inflammatory cytokines MCP-1 and VEGF to the matrix of the trabecula of the femur, a target area for metastatic breast cancer cell colonization. Clinical & experimental metastasis. 27, 331-340 (2010).
- Kuperwasser, C., et al. A mouse model of human breast cancer metastasis to human bone. Cancer research. 65, 6130-6138 (2005).
- Rosenblatt, M. A tale of mice and (wo)men: development of and insights from an 'all human' animal model of breast cancer metastasis to bone. Transactions of the American Clinical and Climatological Association. 123, 135-150 (2012).
- Oh, H. S., et al. Bone marrow stroma influences transforming growth factor-beta production in breast cancer cells to regulate c-myc activation of the preprotachykinin-I gene in breast cancer cells. Cancer research. 64, 6327-6336 (2004).
- Moharita, A. L., et al. SDF-1alpha regulation in breast cancer cells contacting bone marrow stroma is critical for normal hematopoiesis. Blood. 108, 3245-3252 (2006).
- Koro, K., et al. Interactions between breast cancer cells and bone marrow derived cells in vitro define a role for osteopontin in affecting breast cancer cell migration. Breast cancer research and treatment. 126, 73-83 (2011).
- Pohorelic, B., et al. Role of Src in breast cancer cell migration and invasion in a breast cell/bone-derived cell microenvironment. Breast cancer research and treatment. 133, 201-214 (2012).
- Nicola, M. H., et al. Breast cancer micrometastases: different interactions of carcinoma cells with normal and cancer patients' bone marrow stromata. Clinical & experimental metastasis. 20, 471-479 (2003).
- Korah, R., Boots, M., Wieder, R. Integrin alpha5beta1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer research. 64, 4514-4522 (2004).
- Martin, F. T., et al. Potential role of mesenchymal stem cells (MSCs) in the breast tumour microenvironment: stimulation of epithelial to mesenchymal transition (EMT). Breast cancer research and treatment. 124, 317-326 (2010).
- Kapoor, P., Suva, L. J., Welch, D. R., Donahue, H. J. Osteoprotegrin and the bone homing and colonization potential of breast cancer cells. Journal of cellular biochemistry. 103, 30-41 (2008).
- Chen, X., Lu, J., Ji, Y., Hong, A., Xie, Q. Cytokines in osteoblast-conditioned medium promote the migration of breast cancer cells. Tumour biology : the journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine. 35, 791-798 (2014).
- Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35, 2454-2461 (2014).
- Marlow, R., et al. A novel model of dormancy for bone metastatic breast cancer cells. Cancer research. 73, 6886-6899 (2013).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Hutmacher, D. W., et al. Can tissue engineering concepts advance tumor biology research. Trends in biotechnology. 28, 125-133 (2010).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature reviews. Molecular cell biology. 7, 211-224 (2006).
- Hutmacher, D. W. Biomaterials offer cancer research the third dimension. Nature. 9, 90-93 (2010).
- Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in cancer biology. 15, 365-377 (2005).
- Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology advances. 32, 1256-1268 (2014).
- Dhurjati, R., Krishnan, V., Shuman, L. A., Mastro, A. M., Vogler, E. A. Metastatic breast cancer cells colonize and degrade three-dimensional osteoblastic tissue in vitro. Clinical & experimental metastasis. 25, 741-752 (2008).
- Mastro, A. M., Vogler, E. A. A three-dimensional osteogenic tissue model for the study of metastatic tumor cell interactions with bone. Cancer research. 69, 4097-4100 (2009).
- Contag, C. H., et al. Monitoring dynamic interactions between breast cancer cells and human bone tissue in a co-culture model. Molecular imaging and biology : MIB : the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 16, 158-166 (2014).
- Multhaup, M., et al. Cytotoxicity associated with artemis overexpression after lentiviral vector-mediated gene transfer. Human gene therapy. 21, 865-875 (2010).
- Thorne, S. H., et al. CNOB/ChrR6, a new prodrug enzyme cancer chemotherapy. Mol Cancer Ther. 8, 333-341 (2009).
- Mehra, R., et al. Characterization of bone metastases from rapid autopsies of prostate cancer patients. Clin Cancer Res. 17, 3924-3932 (2011).
- Riccio, A. I., Wodajo, F. M., Malawer, M. Metastatic carcinoma of the long bones. Am Fam Physician. 76, 1489-1494 (2007).
- Ahmann, G. J., et al. Effect of tissue shipping on plasma cell isolation, viability, and RNA integrity in the context of a centralized good laboratory practice-certified tissue banking facility. Cancer epidemiology, biomarkers & prevention : a publication of the American Association for Cancer Research, cosponsored by the American Society of Preventive Oncology. 17, 666-673 (2008).
