Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

שיטות לExplants רקמות Culturing עצם ירך האדם ללמוד התיישבות תאי סרטן השד גרורתי של הנישה

Published: March 15, 2015 doi: 10.3791/52656

Summary

פרוטוקולים מתוארים ללימוד הגירה של תאי סרטן השד, התפשטות והתנחלות במערכת מודל explant רקמת עצם אנושית.

Abstract

עצם הוא האתר הנפוץ ביותר של גרורות סרטן השד. למרות שזה מקובל שסרטן השפעות מייקרו-סביבת התנהגות התא, מעט מאוד ידוע על מאפייני סרטן שד תא והתנהגויות בתוך מייקרו-הסביבה המקומית של רקמת עצם אנושית. פיתחנו גישות כדי לעקוב אחר, לכמת ולווסת את תאי סרטן השד אנושיים במייקרו-הסביבה של שברים בתרבית רקמת עצם אנושיים מבודדים מראשי הירך הושלכו הבאים כולל ניתוחי החלפת מפרק ירך. שימוש בתאי סרטן השד מהונדס ללוציפראז ומשופר חלבון פלואורסצנטי ביטוי ירוק (EGFP), אנו יכולים לכמת reproducibly דפוסי הגירה והתפשטות שימוש בהדמית פליטת אור (BLI), אינטראקציות תא מסלול בתוך שברי העצמות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ולהעריך את תאי שד לאחר קולוניזציה עם cytometry זרימה. היתרונות העיקריים של מודל זה כוללים: 1) microe ילידים, ארכיטקטוני שלם רקמהnvironment הכולל סוגי תאים אנושיים רלוונטיים, ו- 2) גישה ישירה למייקרו-הסביבה, המאפשר כמותית מהירה וניטור איכותי והפרעות של נכסי שד ותאי עצם, התנהגויות ואינטראקציות. מגבלה העיקרית, כיום, היא הכדאיות סופית של שברי הרקמות, אשר מגביל את החלון של מחקר לתרבות לטווח קצר. יישומים של מערכת המודל כוללים מחקר על הביולוגיה הבסיסית של סרטן השד וגידולים ממאירים המבקש עצם אחרים בתוך הנישה גרורתי, ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות למקד ביעילות תאי סרטן השד ברקמות עצם.

Introduction

מייקרו-הסביבה של הגידול להכרה רחבה כקובע קריטי של תאים סרטניים התנהגות במהלך התקדמות סרטן השד גרורתי והתפשטה 1-3. המטרה של השיטה שהוצגה כאן היא להקל על המחקר של תאי סרטן השד במייקרו-הסביבה של רקמת עצם אנושי, האתר השכיח ביותר לגרורות סרטן השד 4-6. עצם מורכב מתאי mineralized ומח 7-9, אשר שניהם נמל תאים וגורמים מופרשים מעורבים בהתקדמות גרורתי 10,11. למרות שימוש נרחב במודלים של עכברי vivo להקל על מחקרים מערכתיים של התהליך גרורתי 12-15, אינטראקציות תא בתוך השלד אינן נגישים לתצפית והפרעות ישירות. מערכות מודל ללימוד וculturing רקמות עצם עכבר ותאי מח העכבר לספק גישה טובה יותר והניבו תובנות רבות לגבי crosstalk ומנגנונים מ 'תאי סרטן שדetastasis של השלד העכברי 16-22. עם זאת, המחקרים הראו כי ייתכן שיש מינים ספציפיים דפוסי osteotropism לרקמת עצם 23,24. דפוסים אלה יכולים לשקף מינים ספציפיים הגלומים הבדלים במאפייני רקמת עצם, הבדלים הנובעים מאוכלוסיות מח העצם שינו בעכברי חיסון לקוי 11, ו / או גיל צעיר יחסית של עכברים המשמש בניסויים, שכולן עשויים גורמים של העצם מייקרו-סביבה.

במבחנה גישות ללימוד תאי סרטן השד בשיתוף תרבויות עצם אנושיות התמקד בדרך כלל על סוגי תאי עצם ספציפיים כגון osteoblasts-נגזר מח עצם או תאי סטרומה מתורבתים כמו monolayers או בתוך מערכות מודל 3 ממדים מהונדסים 25-35. למרות שמודלי תרבית תאים 2 ממדים יצרו עמוד התווך של במבחנה גישות לחקר סרטן, זה כבר זמן רב הכיר בכך שהתנהגות התא משתנה מן היסוד במ 'onolayer מערכות תרבות 18,36,37. זה הוביל לפיתוח של מייקרו-סביבות מהונדסות המחקות את המורכבות של רקמות חיות 3 ממדים, כולל מטריצה ​​ומודלים מבוססי פיגום המורכב מחומרים טבעיים כמו קולגן, או פולימרים סינטטיים שנזרעו עם סוגי תאים מסוימים ליצירת מייקרו-סביבות כמו רקמה- 36-41. גם גישות מהונדסות כללו שימוש בפלטפורמות bioreactor לשלוט וללמוד את הסביבה ההורמונלית של מייקרו-הסביבה 18,19,41-43. למרות שמודלים וbioreactors biomimetic לספק אלמנטים רבים של מייקרו-סביבת רקמה מורכבת בסביבה מבוקרת, ויושמו בהצלחה על מנת לקדם את המחקר של גרורות סרטן השד לעצם 18,19,35,42,43, מערכות מודל מהונדסות בדרך כלל אינן לשלב הספקטרום המלא של סוגי תאים ורכיבי מטריצה ​​תאיים הנוכחיים בסביבת עצם הילידים.

עד לאחרונה, סרטן השדתאים לא נחקרו במייקרו-הסביבה המקומית, שלם, 3 ממדים של רקמות עצם אנושיות. לאחרונה דיווחו על ההתפתחות של מודל שיתוף תרבות באמצעות שברי רקמה אנושיים עצם מבודד מסך החלפת מפרק ירך ניתוח (THR) דגימות 44. דגימות אלה נמל שני תאי mineralized ומח הצורך ללמוד מנגנוני מיקרו-גרורות בתרבות טווח קצרה. בעבודה קודמת הקמנו הוכחה של עיקרון לשימוש בהדמית פליטת אור (BLI) כדי לפקח על ההתפשטות של תאים (מד"א MB-231-fLuc) שיתוף תרבותי עם שברי עצמות 44 להביע לוציפראז סרטן השד. כאן אנו מציגים מפורטים פרוטוקולי ניסוי ללימוד התפשטות תאי סרטן שד, קולוניזציה, והגירה בהקשר של מייקרו-הסביבה המקומית באמצעות explants רקמת עצם אנושי.

ראשית אנו מציגים פרוטוקול לתאי סרטן שד שיתוף culturing סמוכים לברי עצמות למדוד שדהתפשטות תאים באמצעות BLI. בסעיף זה, השעיות תא שד הם זורעים ככתמי תא 6 צלחות גם בסמוך לברי עצמות, שהם משותקים על ידי חתיכות של שעוות עצם. בארות בקרה מכילות שעוות עצם, אך לא שבר עצם. ברגע שכתמי תא לצרף, בינוני הוא הוסיף את הצלחת היא בתרבית למשך 24 שעות, לאחר שעוצמת אות bioluminescent (הקשורים במספר תא) נמדדת עם BLI. בשלב הבא אנו מציגים שיטות לתאי סרטן שד culturing-שיתוף זרע ישירות על גבי שברי עצמות ללמוד קולוניזציה ושגשוג. כאן השעיות תא השד pipetted ישירות על גבי שברי רקמת העצם, שנמצאים תחת פיקוח בתרבות על ידי BLI ומיקרוסקופ פלואורסצנטי לאורך זמן כדי לעקוב אחר קולוניזציה ומספר תא. בשיטה זו, תא מוח יכול להיות סמוק מברי עצמות בכל נקודה לניתוח של תאי סרטן השד יישבו על ידי זרימת זמן cytometry, או מבחני כדאיות מח.

בנוסף, אנו מבטליםסופר שתי גישות שונות למדידת נדידת תאי סרטן השד. בשיטה הראשונה צעדים מפורטים למדידת הגירה כלפי supernatants תרבית רקמת עצם. בפרוטוקול זה תאי סרטן השד הם זורעים על גבי המשטחים הפנימיים, העליונים של Transwell להכניס קרומים עם גודל נקבובית 8 מיקרומטר (כפי שמוצגים באיור 1 א). לאחר מכן מוסיף ממוקמים לתוך צלחת מקלט עם בארות המכילות supernatant רקמת עצם או בינוני שליטה. במהלך תקופת דגירה 20 שעות, מספר קטן של תאי סרטן השד להעביר דרך הממברנות להכניס לתוך בארות תרבית הרקמה הנמוכות שבו הם מייחסים לגילוי על ידי BLI. בשיטה השנייה הגירת תאי סרטן השד הם זורעים על גבי המשטחים התחתונים, החיצוניים של קרומים להוסיף Transwell. שברי רקמת עצם ממוקמים לתוך הכוסות להוסיף ותאי סרטן השד להעביר דרך ממברנות ליישב את שברי עצמות (כפי שמוצגים באיור 1), שלאחר מכן צילם באמצעות BLI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ראש עצם הירך נאסף מחולים שעברו ניתוח THR בחירה במחלקה לכירורגיה אורטופדיים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת סטנפורד. כל הרקמות נאספו כדגימות זוהתה de בהתאם לתקנות של משרד Compliance מחקר באוניברסיטת סטנפורד.

1. בחירת שורת תאי סרטן השד (ים)

  1. להשיג או transfect הקו הרצוי תאי סרטן השד (ים) עם מבנה כתב בלוציפראז-GFP. הניסויים הבאים בוצעו באמצעות מד"א MB-231 וקווי MCF-7 בסרטן שד תא מהונדס עבור הביטוי היציב של לוציפראז גחלילית (fLuc) וחלבון משופר ירוק ניאון (EGFP) על ידי transfection עם הפלסמיד transposon היפיפה הנרדם pKT2 / LuBiG וPK פלסמיד transposase / hUbiC-SB11 45,46.
    הערה: שורות תאי transfected מכונות מד"א MB-231-fLuc-EGFP, וMCF-7-fLuc-EGFP.

2. רקמות בידוד Fragments מראשי הירך

  1. לאחר ניתוח THR, לאסוף את ראש עצם הירך שהושלך במכל סטרילי המלא בתמיסת מלח פיסיולוגי. העבר את הדגימה למעבדה ולעבד אותו בתוך 1-3 שעות של ניתוח. הערה: אם יש עיכוב בעיבוד, הנח את הדגימה על 4 מעלות צלזיוס.
  2. הכן אזור עבודה על ידי הצבת את הפריטים הבאים על מחצלת סופגת בברדס בתרבית רקמת זרימה למינרית: כפפות סטריליות, rongeur כירורגית, מלקחיים, כוס עם isopropanol 70% כדי לשטוף כלים, וכלי תרבית הרקמה כמפורט להלן עבור כל סוג של ניסוי .
  3. לובש כפפה כירורגית סטרילית להחזיק את הראש עצם הירך העגולה ביד אחת, להשתמש בrongeur ביד השנייה כדי לחלץ עצמות trabecular של גודל רצוי (~ 2-5 מ"מ) מהפיר העליון החשוף של עצם הירך. העבר את שברי עצם לתוך כלי התרבות (למשל, 6, 12, או 24 גם צלחת תרבית רקמה או תא הגירה), בהתאם לסוג של הפצה, colניסוי onization או הגירה, כפי שתואר בשלבי 3, 4 או 5.
    הערה: שברי רקמת עצם צריך להיות שנקטפו כמתואר לעיל לאחר השלמת השלבים הראשוניים של כל assay שגשוג, קולוניזציה או הגירה ספציפית. שברים ינועו בגודל כפי שמוצג באיור 2. אפשר לשקול שברים לפני או אחרי ניסויים לצורך התקינה.

3. תאי סרטן שד culturing-Co בסמוך לברי עצמות כדי למדוד התפשטות תאי שד באמצעות BLI

  1. לפני הניסוי, להכין השעיה המכילה 2 x 10 5 תאי סרטן השד / 50 μl, ולהכין את התקעים של שעוות עצם ללשתק שברי עצמות בתרבות. לחתוך קצה micropipette P200 ל -3 חלקים ולהשתמש בקצה הצר של החתיכה בגודלה באופן "עוגייה מחתך" לחתוך חתיכות קטנות (~ מ"ג 35) של שעוות עצם. השתמש בקצה הרחב של החתיכה הקטנה ביותר כדי להוציא את תקעי שעוות עצם לתוך צלחת פטרילאחסון.
  2. מניחים פיסת שעוות עצם בכיוון השעה 12 כל טוב ולחץ בעדינות כלפי מטה עם אצבע עטויה בכפפה סטרילית-.
  3. פיפטה 50 μl של השעיה תא המכילה 1 x 10 5 תאי סרטן השד בDMEM-10 FBS% + פן-דלקת במרכז היטב בכל צלחת 6-היטב. (לחלופין, תאי זרע בדפוס פיזר אם תרצה בכך.) מניחים את הצלחת בתרבית רקמת חממת 37 ° C במשך 45 דקות כדי לקדם מצורף תא.
  4. הנח בר עצם 1 על 1 חתיכה של שעוות עצם לכל גם ניסיוני ולהפעיל לחץ עדין עם rongeur כדי לאבטח אותו. לבצע ניסויים בשלושה עותקים כך ש3 שברי עצמות מדגימת THR נתון מונחים לשלוש בארות העליונים, בעוד שלוש הבארות התחתונה מכילות שעוות עצם רק כפקדים.
  5. בעזרת פיפטה 5 מיליליטר, בעדינות ובאיטיות לספק 5 מיליליטר של DMEM-10% FBS לצד השני של כל היטב כדי למנוע פירוק תאי שד או שברי עצמות. מניחים את הצלחת ב-3776; תרבית רקמת חממת C עבור 20-24 שעות.
  6. כדי לבצע הדמיה פליטת אור (BLI) להסיר את הצלחת מן החממה ולהוסיף מצע luciferin (כדי להשיג ריכוז של 300 מיקרוגרם / מיליליטר) היטב כל אחד. תמונת הצלחת מייד על IVIS הדמיה פלטפורמה באמצעות הפרמטרים הבאים: f-stop של 1, binning הקטנה, זמן חשיפה של 1 שניות, רמת ד מדוד את עוצמת האות של כל כן זוהר ממוצע (פוטונים / שני / סנטימטר מרובע / סטרדיאן).
  7. השתמש בתוכנת הדמיה להגדיר אזורים של העניין (ROI) לכמת את זוהר הממוצע לכל בארות הניסיוניות ושליטה. ערכי זוהר ממוצע יצוא לגיליון Excel כדי לבצע סטטיסטיקה וליצור גרפים.

4. תאי סרטן שד culturing-Co זרע ישירות על גבי שברי עצמות לחקר התיישבות ומספר נייד

  1. שימוש במלקחיים למקום שברי עצמות ישירות לתוך הבארות הריקות של צלחת תרבית רקמת 24 גם (בר 1 / טובים).
  2. פְּעִיםette אגל השעיה תא 50 μl של DMEM-10% FBS המכיל 1 X 03-6 אוקטובר תאי סרטן השד באופן ישיר על גבי כל בר עצם. מניחים את הצלחת בתרבית רקמת חממת 37 ° C במשך 45 דקות כדי לקדם מצורף תא. בעדינות להוסיף 1-2 מיליליטר DMEM-10% FBS לצד השני של כל גם כזה שהבר הוא שקוע כולו במדיום. דגירה את הצלחת בתרבית רקמת חממת 37 ° C 20-24 שעות.
  3. לאחר דגירה, להשתמש במלקחיים כדי להעביר כל קטע רקמת עצם לצלחת 24 גם טרי המכילה 1 מיליליטר DMEM-10% FBS בכל טוב. כדי לבצע BLI, בצע את השלבים 3.6-3.7 לעיל. בנוסף, ניתן לראות שברים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, או סמוק להשיג את אוכלוסיית מח לניתוחים של מספרי תאי סרטן השד ומאפיינים כמתואר בשלב 6.
  4. כדי להכין את שברים שלמים להערכה איכותית על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי הבא BLI, פיפטה 5 μl של פתרון תיוג בביספוספונטים ניאון (מראשpared על פי הוראות היצרן) לכל אחד גם לתייג spicules mineralized של שברי העצמות. דגירה את הצלחת בתרבית רקמת החממה לשעת 24 נוספת.
  5. בעקבות 24 שעות של התרבות בפתרון תיוג בביספוספונטים ניאון, להשתמש במלקחיים כדי להעביר את שברי צלחות תרבית רקמה המכילות בינוני פנול אדום-חופשית ונוף באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המוגדר GFP תמונה (485 ננומטר) ותווית בביספוספונטים (680 ננומטר).

5. מדידת הגירה של תאי סרטן השד לברי רקמת עצם והעצם בתרבית שבר Supernatants

  1. הגירה לכיוון supernatant תרבית רקמת עצם.
    הערה: בצע ניסויים בשלושה עותקים כך ש3 ברים מדגימת THR נתון משמשות ליצירת 3 supernatants. עבור כל ניסוי, הגירה היא בהשוואה על פני שלוש בארות המכילות supernatants עצם לעומת שלוש בארות המכילות מדיום שליטה בלבד.
    1. צור tis עצםלתבוע supernatants על ידי הנחת שברי עצמות לתוך הבארות של צלחת 12-היטב המכילה 2.2 מיליליטר DMEM-10% FBS בכל טוב. תרבות בתרבית רקמת חממת 37 ° C למשך 24 שעות. לסגת הבינוני ב 24 שעות ולהחליף עם 2.2 מיליליטר טרי FBS% DMEM-10. בארות שליטת פינוק המכילות DMEM-10% FBS באותה הדרך.
      הערה: הבינוני משתנה ב 24 שעות כדי להסיר גורמים מופרשים בתגובה לטראומה לרקמות כתוצאה מניתוח. בגלל supernatants רקמת עצם נוצרת בFBS המכיל בינוניות, בארות המכילות מדיום FBS המכיל רק כלולים לשלוט על תרומתם של FBS לנדידת תאי סרטן שד.
    2. ב 48 שעות, לאסוף 0.9 מיליליטר של כל supernatant / בינוני שליטה ופיפטה לתוך הבארות של צלחת מקלט. מוסיף מאוחר יותר להציב לתוך בארות אלה. דגירה את צלחת המקלט בתרבית רקמת החממה תוך זריעה מוסיף. הערה: supernatant הנותר (~ 1 מיליליטר לאחר אידוי) ניתן לאסוף עבור ניתוח של secretome פקטוrs אם תרצה בכך 44.
    3. זרע מוסיף Transwell, להכניס אותם לתוך סטנדרטי, צלחת תרבית רקמת 24 גם ריקה. ההשעיה פיפטה 350 μl תא המכילה 1 x 10 5 תאי סרטן השד בDMEM-10% FBS על פני השטח העליונים, פנימי קרום של להכניס כל אחד כפי שמוצג באיור 1 א. מניחים את צלחת 24 גם מכילה מוסיף זרע לתרבית רקמת חממת 37 ° C במשך 45 דקות כדי לקדם קובץ מצורף.
    4. ברגע שהתאים מחוברים למוסיף, להשתמש במלקחיים כדי להעביר מוסיף לצלחת המקלט בהתאם להוראות היצרן. זווית להכניס כל אחד בעת ביצוע אותה למקלט גם כדי למנוע היווצרות בועה בין הקרום להוסיף והמקלט גם supernatant. דגירה את צלחת המקלט עם מוסיף במשך 20 שעות בתרבית רקמת חממת 37 ° C.
      הערה: בדוק את הצד התחתון של צלחת המקלט לבועות בין הקרום להוסיף והמקלט גם supernatant. אם בועות גלויות, להסיר את מוסיף הספציפי ומניח אותם שוב לתוך השפופרת היטב עד שאין בועות נמצאות.
    5. אחרי 20 מלקחיים שימוש hr להסיר מוסיף מצלחת המקלט. שימוש בהליכים בצעדים 3.6-3.7 לבצע BLI לתמונת התאים שהגרו ולמחוברים לחלק התחתון של בארות צלחת מקלט.
  2. הגירה לברי רקמת עצם.
    הערה: בצע ניסויים בשלושה עותקים כך ש3 ברים מדגימת THR ניתנה ממוקמות לתוך 3 מוסיף נפרד, ו- 3 חרוזי זכוכית ממוקמים לתוך 3 מוסיף נפרדים כפקדים.
    1. הכן את צלחת המקלט על ידי pipetting 0.9 מיליליטר FBS% DMEM-10 לכל אחד. הנח אותו לתרבית רקמת החממה בעת הכנה מוסיף.
    2. הזרע מוסיף, להפוך אותם על פני השטח של תיבת צינור microfuge פלסטיק שיש לו מכסה. פיפטה טיפת השעיה תא 50 μl של FBS% DMEM-10 המכיל 1 x 10 5 תאי סרטן שד דirectly על פני השטח החיצוניים, תחתית כל קרום כנס (שהוא פונה כלפי מעלה במוסיף ההפוך). לכסות את תיבת צינור microfuge עם המכסה הסדוק פתוחה ולהעביר אותו לחממת רקמת 37 ° C במשך 45 דקות כדי לקדם מצורף תא.
    3. העבר את תיבת צינור microfuge למכסה מנוע תרבית רקמה, ולהשתמש במלקחיים כדי להפוך את מוסיף זרע צד ימין למעלה ולהעביר אותם לתוך הבארות של צלחת המקלט. FBS 0.450 מיליליטר DMEM-10% פיפטה לכל כוס להוסיף. בעזרת מלקחיים, להעביר בר רקמת עצם אחד (~ 3 מ"מ) לכל כוס להכניס מוכנה. לחלופין, להשתמש בחרוזי זכוכית בקרות שליליות כמו בבארות נוספות. מניחים את הצלחת בתרבית רקמת חממה במשך 20 שעות.
    4. כדי למדוד הגירה, להכין צלחת תרבית רקמה סטנדרטית 24 גם המכילה 1 מיליליטר DMEM-10% FBS בכל טוב. הסר את צלחת המקלט מהחממה ולהשתמש במלקחיים כדי להעביר את שברי עצמות וחרוזים מכל להכניס לתוך בארות נפרדות של הצלחת סטנדרטית. להוסיף luciferinמצע (כדי להשיג ריכוז סופי של 300 מיקרוגרם / מיליליטר) היטב כל אחד ולבצע BLI תוך שימוש בנהלים בצעדים 3.6-3.7.

6. ניתוח לפני ואחרי ניסוי נוסף

  1. ניתוח של מח סמוק.
    1. העבר את בר עצם לתוך מסננת תא 70 מיקרומטר ממוקמת בחלק העליון של צינור חרוטי 50 מיליליטר. השתמש במזרק 10 מיליליטר עם מחט 25 G כדי לשטוף נמרצות הבר עם 10 מיליליטר של PBS לקבל השעיה של תאים במח בצינור חרוטי. צנטריפוגה ההשעיה התא 3 דקות ב 300 XG ו -21 מעלות צלזיוס, לשאוב supernatant ו resuspend תאי pelleted בPBS או הפתרון רצוי אחר לזרימה cytometry.
      הערה: כרכי Resuspension ישתנו בהתאם לגודל של התא גלולה לאחר צנטריפוגה, ויישום.
    2. עבור מבחני כדאיות ~ 75-300 כרכי μl של PBS מתאימים, וניתן לנתח השעיות אלה באמצעות fluorescenc זמין מסחרימבחני כדאיות מבוססות דואר על פי הוראות היצרן, pipetted לתוך hemocytometer קונבנציונלי, וספרו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך.
    3. לניתוח cytometric זרימה או מיון המבוסס על זיהוי של תאי סרטן שד GFP חיובי, resuspend התא גלולה ב 1 מיליליטר PBS המכיל 2% FBS, 2 המ"מ EDTA, ו -10 מ"מ HEPES כך שהריכוז הוא 1 x 10 6 תאים / מיליליטר.
  2. H & E מכתים ואימונוהיסטוכימיה.
    1. כדי לעבד את שברים לhematoxylin & eosin (H & E) מכתים ו / או אימונוהיסטוכימיה, למקם את הברים בקלטות פלסטיק שכותרתו עם עיפרון מספר 2, ולצלול במכל המלא עם 10% שנאגרו פורמלין למשך 24 שעות.
    2. רקמות תהליך להטבעת פרפין, חתך ומכתים תוך שימוש בפרוטוקולים שיגרתי הכוללים צעד decalcification כדי להסביר את spicules mineralized בתוך כל בר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בידוד ברי רקמה מראשי הירך

ראש עצם הירך נאסף ממספר שווה של גברים ונשים חולים (44-90 שנים) שעבר ניתוח להחלפת מפרק ירך בחירה במחלקה לכירורגיה אורטופדיים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת סטנפורד. כל ראש עצם הירך הושלך מכיל חלק קטן של עצם הירך העליונה, אשר מטפחת רקמת עצם trabecular המורכבת מspicules ומח mineralized. רקמה זו נגישה באמצעות הסעיף נחשף בניתוח הצולב של הפיר (איור 2 א) באמצעות rongeur כירורגית כדי לחלץ ברים קטנים. היסטולוגיה של החתיכות שחולצו מוצגת באיור 2 ב ', חושפת את רכיבי mineralized ומח. המראה של החתיכות שחולצו משתנה על פני ראש עצם הירך המתקבל ממטופלים שונים, הנע בין צהוב לאדום, בהתאם לתוכן adipocyte של מח כפי שמוצג באיור 2 ג. Wדואר להדגים את השימוש שבברי רקמת עצם אלה במבחנים לטווח קצרים למדוד אינטראקציות דינמיות עם תאי סרטן השד מהונדסים ללוציפראז וביטוי EGFP.

תאי סרטן שד culturing-Co בסמוך לברי עצמות כדי למדוד התפשטות תאי שד באמצעות פליטת אור הדמיה

התקנת צלחת התרבות לתאי סרטן שד culturing-שיתוף מד"א MB-231-fLuc-EGFP סמוכים לברי עצמות משותקים למדוד התפשטות תאי שד באמצעות BLI מוצגת באיור 3 א. BLI של הצלחת ב 24 שעות מודגם באיור 3, ואות BLI מ -3 ניסויים, מפגין התפשטות תאים משופרים בנוכחות לעומת היעדרות של שברי עצמות מוצגת באיור 3 ג.

תאי סרטן שד culturing-Co זרע ישירות על גבי שברי עצמות לחקר התיישבות ומספר נייד

קולוניזציה של MCF-7-fLuc-EGFP גאמות זרע ישירות על גבי שברי רקמת עצם, כפי שנמדדו באמצעות BLI 24 שעות במתוארות באיור 4 א, ​​מדגים ירידת האות קשורה עם צפיפות זריעה בירידה. בר ישירות נזרע מוצג ב48 שעות באיור 4, לאחר תיוג עם מגיב biphosophonate ניאון, כמו הדמיה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לחשוף קולוניזציה של תאי סרטן השד בתוך התאים mineralized ומח. דפוסי התישבות אלה גם מתגלים שבברים ישירות נזרעו מעובד לאחר ניסוי עבור מכתים immunohistochemical עם נוגדן cytokeratin (4C דמויות ו4D).

מדידת הגירה של תאי סרטן השד לברי רקמת עצם והעצם בתרבית שבר Supernatants

נדידה של תאי מד"א-231-fLuc-EGFP פני ממברנות הגירה נקבוביות כלפי supernatants תרבית רקמת עצם ולרסיסי עצם מזוהה עם BLI כפי שמוצג באיור 5. דפוס הגירה חזק לכיוון supernatants תרבות נגזר משלושה שברים של דגימת THR נתון מוצג באיור 5 א ', המתאר את עליית הגירה לבארות המכילות supernatant רקמת עצם לעומת בינוני שליטה. למרות שלא כל דפוסי ההגירה הם חזקה, הגירה זו כלפי supernatants עצם היא בדרך כלל גדולה יותר מאשר לכיוון בינוני שליטה ברוב הניסויים. דפוס הגירה אופייני לברי עצמות מדגימת THR נתון מוצג באיור 5.

ניתוח של קישואים סמוקים

בנוסף, אנו מוכיחים כי יכולים להיות סמוקים תאי מח מרסיסים יישבו, וניתן לאתר שתאי סרטן השד הסמוק בין תאים אלה על ידי cytometry זרימה (איור 6), BLI (איור 6 ג), ו / או מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 6 ד) .

הכדאיות מדידה

באיור 7.

איור 1

איור 1: הגדרה של ניסויי הגירה. (א) בניסויים "הגירה קדימה", בארות צלחת מקלט מלאים בsupernatants תרבית רקמת עצם שנוצר בעבר. תאי סרטן השד שהם זורעים על גבי המשטחים הפנימיים, העליונים של קרום Transwell בכוסות להוסיף מכילות DME-10 FBS% נודדים דרך ממברנות ולצרף לתחתית הבארות לגילוי על ידי BLI.

איור 2
איור 2: בידוד ברי רקמה מראש עצם הירך. (א) חילוץ שברי עצם trabecular באמצעות rongeur כירורגית. (B) היסטולוגיה של בר הקבוע מייד לאחר חילוץ מרקמת עצם ירך מראה mineralized (חץ לבן) ומח (חץ שחור) תאים. שברי עצמות (C) trabecular מופקים משני שונה ראש עצם הירך מדגים וריאציה בתוכן מח צהוב מול אדום. (B) לשכפל באישור 44.

איור 3
איור 3: תאי סרטן שד culturing-Co בסמוך לברי עצמות למדוד התפשטות תאי שד באמצעות הדמיה פליטת אור. כתמי תא (כחול), שעוות עצם (שחור), ושבר עצם (אדום: התקנת תרבות צלחת לתאי culturing-שיתוף מד"א MB-231-fLuc-EGFP סרטן השד בסמוך לברי עצמות משותקים, כפי שצוין על ידי חצים () ). העמדה של שעוות העצם ציינה גם על ידי מעגל מקווקו שחור. הצלחת מוצגת לפני תוספת של מדיום. 3 הבארות העליונים להכיל שברי עצמות קשורים לשעוות עצם ושלוש הבארות התחתונה מכילות שעוות עצם BLI. (ב) רק בצלחת ב 24 שעות. Quantitation (C) של אותות BLI לתאי מד"א MB-231-fLuc-EGFP גדל בנוכחות (ברים סגולים) לעומת היעדרות (פסים ירוקים) של שברים משלושה THR דגימות תרבותי כפי שתואר. עבור כל דגימת THR, ברים מייצגים ערכי BLI ממוצע שנמדדו על פני 3 המכיל בר - בארות 3 שליטה לעומת. תוצאה זו מדגימה רמות גבוהות יותר של שגשוג בנוכחות לעומת היעדרות של שברי עצמות. ברים שגיאה מייצגים סטיית התקן (p <0.01). לשכפל באישור 44.

איור 4
איור 4: זיהוי של תאי סרטן שד זרע ישירות על גבי שברי עצמות. (א) להתישבות של תאי MCF-7-fLuc-EGFP זרע ישירות על גבי שברי רקמת עצם כפי שזוהה על ידי BLI ב 24 שעות, מראה ירידה באות קשורה עם צפיפות זריעה בירידה. (B) בר ישירות נזרע שבלאחר זריעה 48 שעות, ו לאחר תיוג 24 שעות עם מגיב biphosophonate ניאון. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מגלה EGFP + תאי סרטן השד כsociated עם spicule mineralized (חץ ירוק), ועם תאי שומן בתא מח (חצים לבנים). דפוסי התישבות אלה גם מתגלים שבברים ישירות נזרעו מעובד למכתים immunohistochemical עם נוגדן פאן-cytokeratin AE1 / AE3 הבא 72 שעות של התרבות המשותפת (C) ו- (ד). בתאים (C) cytokeratin חיובי סרטן השד, כונה על ידי חצים, הם נצפו בסמוך לתאי שומן בתא מוח. בתאי סרטן שד cytokeratin-חיובי (ד ') הוא ציין מצורף לspicule mineralized. (ג) ו- (ד) לשכפל באישור 44.

איור 5
איור 5:. מדידת נדידה של תאי סרטן השד לברי רקמת עצם וsupernatants בר עצם בתרבית ההגירה של מד"א MB-231תאי -fLuc-EGFP פני ממברנות הגירה נקבוביות כלפי supernatants תרבית רקמת עצם ולרסיסי עצם כפי שזוהה בשעה 24 עם BLI. () אות BLI חושפני משופר הגירה כלפי supernatants תרבות נגזר מTHR נתן דגימה לעומת בינוני שליטה. (B ) אות BLI מפגינה דפוס הגירה של תאי סרטן השד ל -3 שברי עצמות מדגימת THR יחידה. שברי רקמת עצם מסומנים על ידי חוגים מקווקו לבנים. בארות בקרה המכילות חרוזי זכוכית מוצגות בתחתית.

איור 6
איור 6:.. איתור של תאי מד"א-MB-231fLUC-EGFP בקישואים סמוקים מרסיסים יישבו שברים () ללא (משמאל) ועם (מימין) יישב תאי סרטן שד, כפי שזוהה על ידי BLI (B) ניתוח של קישואים סמוקים מרסיסים () על ידי fcytometry הנמוך. תאי סרטן שד EGFP החיוביים אותרו במח סמוק מהבר BLI-חיובי, אבל לא שבר BLI-השלילי. (C) BLI זיהוי של מושבות תאי סרטן השד הנובעות מהתרבות של מח סמוק מבר BLI-חיובי. מיקרוסקופיה (D) הקרינה של תא מוח סמוק מבר BLI-חיובי, מראה תאי מד"א-MB-231fLUC-EFGP בתחום תאי מח.

איור 7
איור 7:. מדידת כדאיות viabilities לתאי מח סמוק מברי רקמה מבודדים מ4 THR דגימות מייד לאחר איסוף וב 24, 48, 72 שעות, ו -6 ימים של התרבות בDMEM-10% FBS. בינוני השתנה ב 24 ו 72 שעות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mehra et al. תיאר בעבר את אוסף הנתיחה שלאחר המוות וניתוח של דגימות עצם של חולי סרטן ערמונית גרורתי שנקטפו בעת הנתיחה שלאחר המוות, חושף רקמות באיכות גבוהות ואימות של השימוש בדגימות עצמות אדם ללמוד את התהליך גרורתי 47. כאן יש לנו תארנו פרוטוקולים לאיסוף, עיבוד ושימוש שבברי רקמה אנושיים עצם המתקבלים מראש עצם הירך שהושלך לאחר ניתוח THR במערכת שיתוף תרבות לטווח קצר כדי ללמוד נדידת תאי שד, קולוניזציה ושגשוג. כ -300,000 ניתוחי החלפת מפרק ירך מבוצעים מדי שנה בארה"ב (האקדמיה האמריקנית לניתוחים אורטופדיים; Orthoinfo.aaos.org), ודגימות אלה מושלכות בדרך כלל. אחת האינדיקציות השכיחות ביותר לניתוח זה הוא דלקת מפרקים ניוונית של מפרק הירך, מה שמוביל להתמוטטות הדרגתית של משטחי הסחוס המכסים את ראש עצם הירך, מה שגורם כאב משותף. במהלך כולל replacem ירךניתוח אף אוזן גרון בחלק קטן של עצם הירך העליונה הוסר יחד עם ראש עצם הירך. עצם הירך הוא אתר משותף של גרורות סרטן השד 48, ודגימות אלה מכילות רקמת עצם trabecular, האתר של קולוניזציה תא שד גרורתי. רוב החולים שעוברים החלפת מפרק ירך הם בני 50-80 שנים, טווח גילים שסוגר השנים של שכיחות סרטן שד שיא. לפיכך, רקמות אלה מהווים משאב יקר ערך ללימוד הנישה גרורתי בעצמות סרטן השד.

ישנם מספר צעדים קריטיים ושיקולים הקשורים בטכניקות אלה. ראשית, ronguer כירורגית באיכות טובה הוא חיוני לחילוץ עצמות trabecular הקטנות תוך החזקת ראש עצם הירך בהפך, היד בכפפה. מלקחיים לא יעבדו, כי הם לא יציב מספיק כדי לחלץ רקמת trabecular מכילה spicules mineralized. שיקול חשוב נוסף במבחנים אלה נוגע לטיפול תא שד קו וpassaging, particularly בנוגע למבחני ההגירה. מעבר לטווח ארוך ו / או שונות בנהלי trypsinization יכול להוביל לבחירה רציפה של אוכלוסיות יותר / פחות עקשניות תא, שעלול לשנות את התגובות הנודדות בניסויים. סוגיה נוספת נוגעת לסטנדרטיזציה של ניסויים, בהתחשב בשונות של רקמות ניתוחיות המתקבלות ממטופלים בגילים שונים ומצבי מחלה. כדי לטפל בזה, אנו מעסיקים עיצוב ניסיוני תוך-נושא שבו כל המשתנים שנבדקו בשלושה עותקים (למשל, על פני שלושה שברים / בארות ניסיוניות לעומת שלוש בארות שברים / שליטה) באמצעות שברים מהדגימה כירורגית של מטופל נתון. ניתן לבדוק משתנים באמצעות עיצוב זה על דגימות מחולים מרובים, ונותחו למובהקות סטטיסטיות באמצעות מבחן T לזווג נתונים בממוצע לכל משכפל, ו / או בכיוון אחד ANOVA בתוך-נושאים לנתונים על משכפל. ולבסוף, מגבלה העיקרית של שיטה זו היא החלון הקצר של viability במהלך תרבות explant.

המדידות שלנו גילו viabilities מח של ~ 90% ביום של איסוף, בקנה אחד עם מדידות כדאיות מתקבלות מaspirates מח עצם 49. במשך זמן, עם זאת, אנו נצפו ירידה הדרגתית במשך ימים שני ושלוש, עם הפסד דרמטי של כדאיות ביום 6. למרות שלא מדדנו את יכולת הקיום של תא mineralized, תצפיות איכותיות מצביעות על כך שיש ירידה דומה ביכולת הקיום של osteoblasts עצם-הבטנה וosteocytes, כפי שניתן לראות באיור 4D. בהתבסס על ניסויים אלה, יש לנו מוגבלים ניסויי התרבות שלנו למחקרים לטווח קצר שבוצעו על 48 או 72 שעות. ניסויים ראשוניים (לא כלול) הצביעו על כך שכדאיות ניתן לשפר באמצעות מדיה זמינה מסחרי גובשה כדי לקיים תאי מח. עם זאת יש לנו לא אפיינו את אוכלוסיות תאי מח בניסויים אלו, ולא יודעים אם תוצאות הכדאיות משופרות מנבחרתולדה של תת-אוכלוסיות של תאי מח מסוימים. הפיתוח של פרוטוקולים כדי לקיים ולהרחיב את הכדאיות של explants אלה יהיה חשוב לקידום מערכת מודל זה.

למרות שמודל זה מוגבל לפרקי זמן קצרים, היתרונות העיקריים שלה ביחס לשיטות אחרות כוללים את התכונות הבאות: 1) רקמות 3 ממדים שלמים מחסה סוגי תאים רלוונטיים המהווים מייקרו-סביבת עצמות אדם, נגישות 2) למייקרו-סביבת העצם לניטור ואינטראקציות דינמיות מדאיגות, 3) מספרים גבוהים של שברים לכל דגימה לניסויים לשכפל, ו -4) בעלות נמוכה בהשוואה למודלים של בעלי חיים.

אמנם יש לנו תיארנו מבחני ללימוד גרורות סרטן שד לעצם, יכולים בקלות להיות מורחבות הדגימות וגישות הללו למחקר של מחלות ממאירות עצם מחפש אחרות כגון סרטן הערמונית, כמו גם פתולוגיות עצם אחרות. למרות שיש לנו להשתמש ראשי הירך הושלכו בעיקר ככךurce של שברי רקמות, דגימות אלה מהווים גם מקור נוסף של מח עצם האנושי, אשר נאסף באופן מסורתי באמצעות שאיבת מוח עצם ממתנדבים צעירים. ולבסוף, בזמן שתארנו גישות באמצעות שורות תאים מהונדסות לפליטת אור וקרינה, רוב הנהלים יכול להיות שונה לשימוש עם תאים אחרים אם שורות תאים אלה ו / או פלטפורמות הדמיה אינן זמינות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

מחקרים אלו מומנו, בין שאר, על ידי מענקים מהאלטרנטיביים למחקר ופיתוח (107,588), המכון הלאומי לבריאות (1U54CA136465-04S1), ותכנית לחקר סרטן שד קליפורניה (201B-0141). אנו מודים בני הזוג. אנדרו וילבר ור 'סקוט McIvor לתרומתם הנדיבה שלהם פלסמידים transposase transponson וPK / hUbiC-SB11. הכרת תודה אנו מודים ג'ון Tamaresis, Ph.D. לקבלת ייעוץ על שיטות סטטיסטיות, טימותי בראון לביצוע cytometry זרימה, ג'ורג'ט היינריך לקבלת ייעוץ על מבחני הגירה, וננסי Bellagamba להקלה על האוסף של דגימות THR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM (1X) + GlutaMAX-l Life Technologies 10569-010 Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep
McCoy's 5A Medium (1X) Life Technologies 16600-082 Supplement all McCoy's  with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep
Fetal bovine serum Life Technologies 16000-044
Penicillen Streptomycin Life Technologies 15140-122
Blastocidin (10 mgl/ml) InvivoGen  ant-bl Supplement media used for transfected cell lines.
Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size) Corning Incorporated 353097
Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate Corning Incorporated 353504
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells* Invitrogen Detection Technologies L-3224
FluoroBrite DMEM Life Technologies A18967-01
D-luciferin firefly, potassium salt 5 g (30 mg/ml) Life Technologies L-8220
Sterile Cell Strainer 70 μm Fisher Scientific 22363548
6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster Corning Incorporated 3516
12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster Corning Incorporated 3513
24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster Corning Incorporated 3526
Friedman-Pearson Rongeur Fine Science Tools 16021-14
Bone wax Surgical Specialties Corporation 903
IVIS 50 Imaging Platform Caliper Life Sciences/PerkinElmer
Living Image Software Program  Caliper Life Sciences/PerkinElmer 133026
EVOS FL Imaging System Life Technologies Version 4.2
OsteoSense 680 EX PerkinElmer NEV10020EX
MCF-7 breast cancer cells ATCC HTB-22
MDA-MB-231 breast cancer cells ATCC HTB-26
Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody DAKO Cytomation Clone (AE1/AE3)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13, 227 (2011).
  2. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
  3. Bissell, M. J., Radisky, D. Putting tumours in context. Nat Rev Cancer. 1, 46-54 (2001).
  4. Coleman, R. E., Rubens, R. D. The clinical course of bone metastases from breast cancer. British journal of cancer. 55, 61-66 (1987).
  5. Mundy, G. R. Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities. Nat Rev Cancer. 2, 584-593 (2002).
  6. Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
  7. Clarke, B. Normal bone anatomy and physiology. Clin J Am Soc Nephrol. 3, Suppl 3. S131-S139 (2008).
  8. Weatherholt, A. M., Fuchs, R. K., Warden, S. J. Specialized connective tissue: bone, the structural framework of the upper extremity. Journal of hand therapy : official journal of the American Society of Hand Therapists. 25, 123-131 (2012).
  9. Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicologic pathology. 34, 548-565 (2006).
  10. Casimiro, S., Guise, T. A., Chirgwin, J. The critical role of the bone microenvironment in cancer metastases. Molecular and cellular endocrinology. 310, 71-81 (2009).
  11. Patel, L. R., Camacho, D. F., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. Mechanisms of cancer cell metastasis to the bone: a multistep process. Future Oncol. 7, 1285-1297 (2011).
  12. Goldstein, R. H., Weinberg, R. A., Rosenblatt, M. Of mice and (wo)men: mouse models of breast cancer metastasis to bone. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 25, 431-436 (2010).
  13. Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochemical and biophysical research communications. 394, 443-447 (2010).
  14. Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212 (2006).
  15. Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer metastasis reviews. 33, 721-735 (2014).
  16. Schiller, K. R., et al. Secretion of MCP-1 and other paracrine factors in a novel tumor-bone coculture model. BMC Cancer. 9, 45 (2009).
  17. Curtin, P., Youm, H., Salih, E. Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex-vivo co-cultures of live calvarial bones and cancer cells. Biomaterials. 33, 1065-1078 (2012).
  18. Krishnan, V., et al. Dynamic interaction between breast cancer cells and osteoblastic tissue: comparison of two- and three-dimensional cultures. Journal of cellular physiology. 226, 2150-2158 (2011).
  19. Krishnan, V., Vogler, E. A., Sosnoski, D. M., Mastro, A. M. In vitro mimics of bone remodeling and the vicious cycle of cancer in bone. Journal of cellular physiology. 229, 453-462 (2014).
  20. Bussard, K. M., Venzon, D. J., Mastro, A. M. Osteoblasts are a major source of inflammatory cytokines in the tumor microenvironment of bone metastatic breast cancer. Journal of cellular biochemistry. 111, 1138-1148 (2010).
  21. Sosnoski, D. M., Krishnan, V., Kraemer, W. J., Dunn-Lewis, C., Mastro, A. M. Changes in Cytokines of the Bone Microenvironment during Breast Cancer Metastasis. International journal of breast cancer. 2012, 160265 (2012).
  22. Bussard, K. M., et al. Localization of osteoblast inflammatory cytokines MCP-1 and VEGF to the matrix of the trabecula of the femur, a target area for metastatic breast cancer cell colonization. Clinical & experimental metastasis. 27, 331-340 (2010).
  23. Kuperwasser, C., et al. A mouse model of human breast cancer metastasis to human bone. Cancer research. 65, 6130-6138 (2005).
  24. Rosenblatt, M. A tale of mice and (wo)men: development of and insights from an 'all human' animal model of breast cancer metastasis to bone. Transactions of the American Clinical and Climatological Association. 123, 135-150 (2012).
  25. Oh, H. S., et al. Bone marrow stroma influences transforming growth factor-beta production in breast cancer cells to regulate c-myc activation of the preprotachykinin-I gene in breast cancer cells. Cancer research. 64, 6327-6336 (2004).
  26. Moharita, A. L., et al. SDF-1alpha regulation in breast cancer cells contacting bone marrow stroma is critical for normal hematopoiesis. Blood. 108, 3245-3252 (2006).
  27. Koro, K., et al. Interactions between breast cancer cells and bone marrow derived cells in vitro define a role for osteopontin in affecting breast cancer cell migration. Breast cancer research and treatment. 126, 73-83 (2011).
  28. Pohorelic, B., et al. Role of Src in breast cancer cell migration and invasion in a breast cell/bone-derived cell microenvironment. Breast cancer research and treatment. 133, 201-214 (2012).
  29. Nicola, M. H., et al. Breast cancer micrometastases: different interactions of carcinoma cells with normal and cancer patients' bone marrow stromata. Clinical & experimental metastasis. 20, 471-479 (2003).
  30. Korah, R., Boots, M., Wieder, R. Integrin alpha5beta1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer research. 64, 4514-4522 (2004).
  31. Martin, F. T., et al. Potential role of mesenchymal stem cells (MSCs) in the breast tumour microenvironment: stimulation of epithelial to mesenchymal transition (EMT). Breast cancer research and treatment. 124, 317-326 (2010).
  32. Kapoor, P., Suva, L. J., Welch, D. R., Donahue, H. J. Osteoprotegrin and the bone homing and colonization potential of breast cancer cells. Journal of cellular biochemistry. 103, 30-41 (2008).
  33. Chen, X., Lu, J., Ji, Y., Hong, A., Xie, Q. Cytokines in osteoblast-conditioned medium promote the migration of breast cancer cells. Tumour biology : the journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine. 35, 791-798 (2014).
  34. Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35, 2454-2461 (2014).
  35. Marlow, R., et al. A novel model of dormancy for bone metastatic breast cancer cells. Cancer research. 73, 6886-6899 (2013).
  36. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
  37. Hutmacher, D. W., et al. Can tissue engineering concepts advance tumor biology research. Trends in biotechnology. 28, 125-133 (2010).
  38. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature reviews. Molecular cell biology. 7, 211-224 (2006).
  39. Hutmacher, D. W. Biomaterials offer cancer research the third dimension. Nature. 9, 90-93 (2010).
  40. Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in cancer biology. 15, 365-377 (2005).
  41. Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology advances. 32, 1256-1268 (2014).
  42. Dhurjati, R., Krishnan, V., Shuman, L. A., Mastro, A. M., Vogler, E. A. Metastatic breast cancer cells colonize and degrade three-dimensional osteoblastic tissue in vitro. Clinical & experimental metastasis. 25, 741-752 (2008).
  43. Mastro, A. M., Vogler, E. A. A three-dimensional osteogenic tissue model for the study of metastatic tumor cell interactions with bone. Cancer research. 69, 4097-4100 (2009).
  44. Contag, C. H., et al. Monitoring dynamic interactions between breast cancer cells and human bone tissue in a co-culture model. Molecular imaging and biology : MIB : the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 16, 158-166 (2014).
  45. Multhaup, M., et al. Cytotoxicity associated with artemis overexpression after lentiviral vector-mediated gene transfer. Human gene therapy. 21, 865-875 (2010).
  46. Thorne, S. H., et al. CNOB/ChrR6, a new prodrug enzyme cancer chemotherapy. Mol Cancer Ther. 8, 333-341 (2009).
  47. Mehra, R., et al. Characterization of bone metastases from rapid autopsies of prostate cancer patients. Clin Cancer Res. 17, 3924-3932 (2011).
  48. Riccio, A. I., Wodajo, F. M., Malawer, M. Metastatic carcinoma of the long bones. Am Fam Physician. 76, 1489-1494 (2007).
  49. Ahmann, G. J., et al. Effect of tissue shipping on plasma cell isolation, viability, and RNA integrity in the context of a centralized good laboratory practice-certified tissue banking facility. Cancer epidemiology, biomarkers & prevention : a publication of the American Association for Cancer Research, cosponsored by the American Society of Preventive Oncology. 17, 666-673 (2008).

Tags

רפואה גיליון 97 נישה גרורתי מייקרו-סביבת עצם גרורות סרטן השד עצמות אדם osteotropism, מערכת תרבות explant הדמיה פליטת אור
שיטות לExplants רקמות Culturing עצם ירך האדם ללמוד התיישבות תאי סרטן השד גרורתי של הנישה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Templeton, Z. S., Bachmann, M. H.,More

Templeton, Z. S., Bachmann, M. H., Alluri, R. V., Maloney, W. J., Contag, C. H., King, B. L. Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche. J. Vis. Exp. (97), e52656, doi:10.3791/52656 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter