Summary
Protocolos são descritos para estudar a migração de células do cancro da mama, a proliferação e a colonização em um sistema modelo de tecido ósseo humano explante.
Abstract
Óssea é o local mais comum de metástase do câncer de mama. Embora seja amplamente aceito que o comportamento de células de câncer influências microambiente, pouco se sabe sobre as propriedades das células de câncer de mama e comportamentos dentro do microambiente nativa do tecido ósseo humano. Nós desenvolvemos abordagens para acompanhar, quantificar e modulam as células de câncer de mama humanos dentro do microambiente de fragmentos humanos cultivados tecido ósseo isoladas de cabeças femorais descartados seguintes artroplastias totais de quadril. Usando células de câncer de mama projetados para luciferase e aprimorados proteína fluorescente (EGFP) expressão verde, somos capazes de quantificar reproducibly migração e proliferação padrões usando imagem de bioluminescência (BLI), as interações celulares pista dentro dos fragmentos ósseos através de microscopia de fluorescência, e avaliar as células da mama após colonização por citometria de fluxo. As principais vantagens deste modelo incluem: 1) a, microe nativa tecido arquitetura intactanvironment que inclui tipos de células humanas relevantes, e 2) o acesso directo ao microambiente, o que facilita quantitativa rápida e monitoramento qualitativo e perturbação de propriedades, comportamentos e interações de mama e de células ósseas. Uma limitação primária, na presente, é a viabilidade finita dos fragmentos de tecido, que confinam a janela de estudo à cultura de curto prazo. Aplicações do sistema de modelo incluem o estudo da biologia básica do câncer de mama e outros tumores malignos de osso buscando dentro do nicho metastático, e desenvolver estratégias terapêuticas para efetivamente como alvo as células de câncer de mama em tecidos ósseos.
Introduction
O microambiente do tumor é amplamente reconhecido como um fator determinante para o comportamento de células de câncer durante a progressão do câncer de mama metastático e espalhar 1-3. O objetivo do método aqui apresentado é o de facilitar o estudo de células de câncer de mama, no microambiente do tecido ósseo humano, o local mais comum de metástase do câncer de mama 4-6. O osso é composto por mineralizado e medula compartimentos 7-9, tanto de células que abrigam e factores segregados implicados na progressão metastática 10,11. Embora amplamente utilizado em modelos in vivo rato facilitar estudos sistêmicos do processo metastático 12-15, interações celulares dentro do esqueleto não são facilmente acessíveis para observação e perturbação direta. Sistemas modelo para estudar e cultivar tecidos ósseos do mouse e as células da medula do mouse proporcionar um melhor acesso e têm rendido muitos insights em relação crosstalk e mecanismos subjacentes células do cancro da mama metastasis do esqueleto murino 16-22. No entanto, estudos sugerem que pode haver modelos de osteotropism específicas das espécies para o tecido ósseo 23,24. Esses padrões podem reflectir espécie-específicos inerentes diferenças nas propriedades do tecido ósseo, as diferenças resultantes de populações de medula óssea alterados em imuno-deficiente camundongos 11, e / ou a idade relativamente jovem de ratos utilizados em experimentos, os quais são possíveis determinantes do osso microambiente.
In vitro abordagens para estudar as células de cancro da mama em co-culturas de ossos humanos têm tipicamente focada em tipos específicos de células de osso tais como os osteoblastos derivados de medula óssea ou de células do estroma cultivadas como monocamadas ou dentro engenharia sistemas modelo 3-dimensional 25-35. Embora os modelos de cultura de células 2-dimensional formaram o esteio da in vitro se aproxima para pesquisa do câncer, tem sido reconhecido que o comportamento da célula é fundamentalmente alterada em monolayer sistemas de cultura 18,36,37. Isto levou ao desenvolvimento de microambientes modificados que imitam a complexidade dos tecidos vivos 3-dimensionais, incluindo matriz- e modelos baseados em compostos de andaime de materiais naturais, tais como colagénio, polímeros sintéticos ou semeadas com tipos específicos de células para criar microambientes tecido semelhante 36-41. Abordagens de engenharia também incluíram a utilização de plataformas de biorreatores para controlar e estudar o ambiente hormonal do microambiente 18,19,41-43. Embora os modelos biomiméticos e biorreatores proporcionar muitos elementos de um microambiente tecido complexo em um ambiente controlado, e têm sido aplicados com sucesso para avançar no estudo da metástase do câncer de mama para os ossos 18,19,35,42,43, sistemas de modelos de engenharia em geral, não incorporam o espectro de tipos de células e componentes da matriz extracelular presentes no ambiente do osso nativo.
Até recentemente, o câncer de mamaAs células não foram estudados no microambiente nativa intacta,, 3-dimensional do tecido ósseo humanos. Nós informou recentemente o desenvolvimento de um modelo de co-cultura utilizando fragmentos de tecidos ósseos humanos isolados de substituição total do quadril (THR) cirurgia espécimes 44. Estes espécimes abrigar tanto os compartimentos mineralizados e medula necessárias para estudar os mecanismos subjacentes micro-metástases em cultura de curto prazo. Em trabalho anterior estabelecemos prova de princípio para a utilização de imagem de bioluminescência (BLI) para monitorar a proliferação de células de câncer de mama que expressam luciferase (MDA-MB-231-FLUC) co-cultivadas com fragmentos de ossos 44. Aqui apresentamos detalhado protocolos experimentais para estudar a proliferação das células do cancro da mama, colonização e migração no contexto do microambiente nativa a partir de explantes de tecido ósseo humano.
Primeiro apresentamos um protocolo para as células do câncer de mama co-cultura adjacentes a fragmentos de ossos para medir mamaproliferação celular utilizando BLI. Neste ponto, as suspensões de células da mama são semeadas como manchas de células em placas de 6 poços adjacentes aos fragmentos de osso, que são imobilizadas por pedaços de cera de osso. Os poços de controlo contêm cera de osso, mas nenhum fragmento ósseo. Uma vez que os pontos de células de anexar, o meio é adicionado e a placa é cultivada durante 24 h, após as quais a intensidade do sinal bioluminescente (associada com o número de células) é medida com BLI. No passo seguinte, apresenta-se métodos para células de cancro da mama co-cultura semeadas directamente sobre os fragmentos ósseos para estudar a colonização e proliferação. Aqui, as suspensões de células da mama são pipetados diretamente sobre os fragmentos de tecidos ósseos, que são monitoradas em cultura por BLI e microscopia de fluorescência ao longo do tempo para acompanhar a colonização e número de células. Neste método, a medula do compartimento podem ser retirados a partir dos fragmentos ósseos, em qualquer ponto de tempo para análise de células de cancro da mama colonizados por citometria de fluxo, ensaios de viabilidade ou medula.
Além disso, desescriba duas abordagens diferentes para medir a migração de células de câncer de mama. No primeiro método passos são descritos para medir a migração para os sobrenadantes de cultura de tecido ósseo. Neste protocolo as células de cancro da mama são semeadas sobre as superfícies superiores dos interiores, Transwell inserir membranas com um tamanho de poro de 8 um (como mostrado na Figura 1A). As pastilhas são depois colocadas numa placa de receptor com poços contendo o sobrenadante de tecido ósseo ou meio de controlo. Ao longo de um período de incubação de 20 h, um pequeno número de células de cancro da mama migram através das membranas de inserção para dentro dos poços de cultura de tecidos mais baixos, onde eles se ligam para detecção pela BLI. No segundo método de migração de células de cancro da mama são semeadas sobre as superfícies inferiores exteriores, de membranas Transwell de inserção. Fragmentos de tecido ósseo são colocados em copos de inserção e as células de cancro da mama migrar para cima através das membranas para colonizar os fragmentos de osso (como mostrado na Figura 1B), o quesão então fotografada usando BLI.
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Protocol
Cabeças femorais foram coletadas de pacientes submetidos à cirurgia eletiva THR no Departamento de Cirurgia Ortopédica da Escola de Medicina da Universidade de Stanford. Todos os tecidos foram coletadas como espécimes identificados-de, em conformidade com a regulamentação do Compliance Office Research da Universidade de Stanford.
1. Seleção de uma linha (s) celular do cancro da mama
- Obter ou transfectar a linha celular de cancro da mama desejada (s) com uma construção repórter de luciferase-GFP. Os seguintes experimentos foram realizados utilizando o MCF-7 linhas celulares de cancro da mama projetados para a expressão estável de luciferase do pirilampo (FLUC) e reforçada proteína verde fluorescente (EGFP) MDA-MB-231 e por transfecção com a Bela Adormecida transposon plasmídeo pKT2 / LuBiG e o pK transposase plasmídeo / hubiC-SB11 45,46.
NOTA: As linhas de células transfectadas são referidos como MDA-MB-231-Fluc-EGFP, e MCF-7-Fluc-EGFP.
2. Isolar Tissue Fragments de cabeças femorais
- Após a cirurgia THR, recolher a cabeça femoral descartada em um recipiente estéril preenchido com soro fisiológico. Transferir a amostra para o laboratório e processá-lo dentro de 1-3 horas de cirurgia. Nota: se existir um atraso no processamento, colocar as amostras a 4 ° C.
- Prepare uma área de trabalho, colocando os seguintes itens em uma manta absorvente em um fluxo laminar de cultura de tecidos capô: luvas estéreis, rongeur cirúrgico, pinças, copo com 70% isopropanol para lavar os instrumentos, e em vasos de cultura de tecidos, conforme estipulado abaixo para cada tipo de experimento .
- Vestindo uma luva cirúrgica estéril para segurar a cabeça do fêmur rodada em uma das mãos, use o rongeur na outra mão para extrair fragmentos de osso trabecular do tamanho desejado (~ 2-5 mm) do eixo superior exposta do fêmur. Transferir fragmentos de osso no interior do vaso de cultura (por exemplo, 6-, 12-, ou placa de cultura de tecidos ou câmara de migração de 24 poços), dependendo do tipo de proliferação, colonization ou migração experiência, como descrito nos passos 3, 4 ou 5.
NOTA: fragmentos de tecido ósseo deve ser colhida, como descrito acima, após a conclusão das etapas iniciais para cada ensaio de proliferação, colonização ou de migração específica. Fragmentos irá variar em tamanho, como mostrado na Figura 2. Os fragmentos podem ser pesados antes ou após as experiências para a finalidade de normalização.
3. Co-cultura de células cancerosas da mama vizinhos a fragmentos ósseos medir mama índice de proliferação celular BLI
- Antes do experimento, preparar uma suspensão contendo 2 x 10 5 células de cancro da mama / 50 ul, e preparar velas de cera de osso para imobilizar fragmentos ósseos em cultura. Corte uma ponta P200 micropipeta em 3 pedaços e usar a parte mais estreita da maior peça de uma forma "pré-fabricadas" para cortar pequenas (~ 35 mg) pedaços de cera de osso. Use a grande final do menor pedaço para ejetar os plugues de cera de osso em uma placa de Petripara armazenamento.
- Coloque um pedaço de cera de osso na posição de 12 horas de cada poço e pressione suavemente para baixo com um dedo indicador estéril de luvas.
- Pipetar 50 ul de suspensão de células contendo 1 x 10 5 células de cancro da mama em DMEM-10% FBS + Pen-Strep no centro de cada poço de uma placa de 6 poços. (Alternativamente, as células de semente num padrão disperso se desejado). Colocar a placa a 37 ° C incubadora de cultura de tecidos durante 45 min para promover a fixação das células.
- Coloque fragmento de um osso em um pedaço de cera de osso para cada bem experimental e aplique uma leve pressão com o rongeur para prendê-lo. Realizar experiências em triplicado, de tal modo que a partir de três fragmentos de osso numa dada amostra THR são colocados em três poços de topo, enquanto que o fundo três poços contêm cera de osso apenas como controles.
- Usando uma pipeta de 5 ml, cuidadosa e lentamente entregar 5 ml de DMEM-10% de FBS ao lado de cada poço para evitar a retirada das células da mama ou fragmentos de ossos. Colocar a placa num 3776; C incubadora de cultura de tecidos durante 20-24 horas.
- Para a realização de imagem de bioluminescência (BLI) remover a placa da incubadora e adicionar substrato luciferina (para obter uma concentração de 300 ug / ml) a cada poço. Imagem da placa imediatamente em uma plataforma de imagem IVIS usando os seguintes parâmetros: f-stop de 1, pequena binning, tempo de exposição de 1 segundo, o nível de D. Medir a intensidade do sinal de cada bem como radiância média (fótons / segundo centímetro / praça / steradian).
- Use software de imagem para definir regiões de interesse (ROI) para quantificar o brilho médio para todos os poços experimental e controle. Exportação valores médios radiância para uma folha de Excel para executar estatísticas e gerar gráficos.
4. As células do cancro da mama-cultura Co semeadas diretamente em fragmentos de ossos para estudar Colonização e número de celular
- Utilize uma pinça para colocar os fragmentos ósseos directamente nos poços vazios de uma placa de 24 poços de cultura de tecidos (1 fragmento / poço).
- PipETTE um 50 ul de suspensão de células de gotículas de DMEM-10% FBS contendo 1 X outubro 3-6 células de cancro da mama directamente no topo de cada fragmento de osso. Colocar a placa a 37 ° C de cultura de tecidos incubadora durante 45 minutos para promover a fixação das células. Adicionar cuidadosamente 1-2 mL de DMEM-10% de FBS para o lado de cada cavidade de tal modo que o fragmento é inteiramente submerso no meio. Incubar a placa em uma temperatura de 37 ° C cultura de tecidos incubadora durante 20-24 hr.
- Após a incubação, utilize uma pinça para transferir cada fragmento de tecido ósseo de uma placa de 24 poços frescas contendo 1 mL de DMEM-10% de FBS em cada poço. Para executar BLI, siga os passos 3,6-3,7 acima. Além disso, os fragmentos podem ser visualizados utilizando um microscópio de fluorescência, ou descarregado para obtenção de uma população da medula para a análise do número de células de cancro da mama e as propriedades como descrito na etapa 6.
- Para preparar os fragmentos intactos para uma avaliação qualitativa por microscopia de fluorescência seguinte BLI, pipeta de 5 mL de solução de etiquetagem fluorescente bisfosfonato (preparede de acordo com as instruções do fabricante) a cada poço para etiquetar as espículas mineralizadas dos fragmentos ósseos. Incubar a placa na incubadora de cultura de tecidos durante mais 24 h.
- Após 24 horas de cultura em fluorescente solução de etiquetagem com bifosfonatos, utilize uma pinça para transferir os fragmentos de placas de cultura de tecido contendo fenol médio e vista livre de vermelho usando um microscópio de fluorescência configuradas para GFP imagem (485 nm) e uma etiqueta com bifosfonatos (680 nm).
5. Medição de migração das células do cancro da mama para fragmentos de tecido ósseo e culta Osso Fragmento sobrenadantes
- A migração para o tecido ósseo sobrenadante da cultura.
NOTA: Realizar experimentos em triplicata de tal forma que três fragmentos de uma dada amostra THR são usados para gerar 3 sobrenadantes. Para cada experimento, a migração é comparado em três poços contendo sobrenadantes ósseas vs. três poços contendo apenas meio controle.- Gerar tis ósseaprocessar sobrenadantes colocando fragmentos ósseos nos poços de uma placa de 12 poços contendo 2,2 mL de DMEM-10% FBS por poço. Cultura em uma temperatura de 37 ° C a cultura de tecidos incubadora de 24 hr. Retirar o meio em 24 horas e substituir com 2,2 ml fresco DMEM-10% FBS. Tratar os poços de controlo contendo DMEM-FBS a 10% da mesma maneira.
NOTA: O meio é mudado de 24 h para remover factores secretados em resposta a um trauma nos tecidos resultantes de cirurgia. Porque sobrenadantes tecido ósseo são geradas em FBS contendo médias, poços contendo FBS meio contendo apenas estão incluídos para controlar as contribuições de FBS a migração de células de câncer de mama. - Em 48 horas, recolher 0,9 ml de cada / sobrenadante e meio de controlo da pipeta para os poços de uma placa de receptor. As inserções serão posteriormente colocados nestas cavidades. Incubar a placa do receptor na cultura de tecidos incubadora enquanto semeando as inserções. Nota: O sobrenadante restante (~ 1 ml após a evaporação) podem ser coletadas para análise de secretoma factors se desejado 44.
- Para semear as inserções Transwell, colocá-los em um padrão, vazio placa de 24 poços de cultura de tecidos. Pipetar 350 ul de suspensão de células contendo 1 x 10 5 células de cancro da mama em DMEM-FBS a 10% sobre a superfície da membrana superior, interior de cada inserção como mostrado na Figura 1A. Colocar a placa de 24 poços contendo as inserções semeadas no 37 ° C incubadora de cultura de tecidos durante 45 min para promover a ligação.
- Uma vez que as células se ligaram aos insertos, utilize uma pinça para transferir as inserções para a placa de receptor de acordo com as instruções do fabricante. Ângulo cada inserção ao colocá-la no receptor bem para evitar a formação de bolhas entre a membrana e o receptor de inserção bem sobrenadante. Incubar a placa receptor com inserções durante 20 horas em uma temperatura de 37 ° C a cultura de tecidos incubadora.
NOTA: Verifique a parte de baixo da placa de receptor para bolhas entre a membrana de inserção e o receptor bem supernatant. Se as bolhas são visíveis, remova as inserções específicas e colocá-los novamente no receptor bem até que não há bolhas de ar. - Após 20 forceps uso hr para remover as inserções a partir da placa do receptor. Utilizando os procedimentos em etapas 3,6-3,7 executar a imagem BLI as células que migraram para dentro e ligados ao fundo dos poços da placa de receptor.
- Gerar tis ósseaprocessar sobrenadantes colocando fragmentos ósseos nos poços de uma placa de 12 poços contendo 2,2 mL de DMEM-10% FBS por poço. Cultura em uma temperatura de 37 ° C a cultura de tecidos incubadora de 24 hr. Retirar o meio em 24 horas e substituir com 2,2 ml fresco DMEM-10% FBS. Tratar os poços de controlo contendo DMEM-FBS a 10% da mesma maneira.
- Migração para fragmentos de tecido ósseo.
NOTA: Realizar experimentos em triplicata de tal forma que três fragmentos de uma dada amostra THR são colocados em três inserções separadas, e 3 esferas de vidro são colocadas em três inserções separadas como controles.- Preparar a placa de receptor, pipetando 0,9 mL de DMEM-10% de FBS a cada poço. Coloque-o no tecido cultura incubadora enquanto prepara as inserções.
- Para semear as inserções, inverter-los na superfície de uma caixa de tubo de plástico de microcentrífuga que tem uma tampa. Pipetar 50 ul de uma suspensão de células de gotículas de DMEM-FBS a 10% contendo 1 x 10 5 células de cancro da mama directly na superfície exterior, no fundo de cada membrana de inserção (que está virada para cima sobre as inserções invertidas). Tampa da caixa de tubo de microcentrífuga com a tampa abriu e transferi-lo para o C incubadora tecido 37 ° por 45 min para promover a fixação das células.
- Transfira a caixa de tubo de microcentrífuga para o capuz de cultura de tecidos, e utilizar uma pinça para ligar as inserções semeados lado direito para cima e transferi-los para os poços da placa de receptor. Pipetar 0,450 ml de DMEM-FBS a 10%, em cada copo de inserção. Utilizando uma pinça, transferir um fragmento de tecido ósseo (~ 3 mm) em cada copo de inserção preparado. Opcionalmente, use pérolas de vidro como controles negativos em poços adicionais. Colocar a placa num incubador de cultura de tecidos durante 20 horas.
- Para medir a migração, preparar uma placa de 24 poços de cultura de tecidos padrão contendo 1 mL de DMEM-10% FBS por poço. Remova a placa do receptor da incubadora e utilizar uma pinça para transferir os fragmentos ósseos e os grânulos de cada inserir em cavidades separadas da placa padrão. Adicionar luciferinasubstrato (para se conseguir uma concentração final de 300 ug / ml) a cada poço e executar BLI utilizando os procedimentos em etapas 3,6-3,7.
6. As análises adicionais de pré e pós-experimentais
- Análise de medula corado.
- Transferir um fragmento de osso em um filtro de células de 70 mm colocada na parte superior de um tubo de 50 ml. Usando uma seringa de 10 ml com uma agulha de 25 G para lavar vigorosamente o fragmento com 10 ml de PBS para se obter uma suspensão de células de medula no tubo cónico. Centrifugar a suspensão de células durante 3 min a 300 xg e 21 ° C, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células peletizadas em PBS ou outra solução desejada para citometria de fluxo.
NOTA: Os volumes ressuspensão irá variar dependendo do tamanho do agregado de células, após a centrifugação, e aplicação. - Para os ensaios de viabilidade ~ 75-300 volumes de PBS são apropriadas, e estas suspensões podem ser analisados utilizando fluorescenc disponível comercialmentee os ensaios de viabilidade baseados de acordo com as instruções do fabricante, pipetada para um hemocitómetro convencional, e contados utilizando um microscópio invertido de fluorescência.
- Para a análise de citometria de fluxo ou triagem com base na detecção de células de cancro da mama positivas para GFP, ressuspender o sedimento de células em 1 ml de PBS contendo 2% de FBS, 2 mM de EDTA, e 10 mM de HEPES de modo a que a concentração é de 1 x 10 6 células / ml.
- Transferir um fragmento de osso em um filtro de células de 70 mm colocada na parte superior de um tubo de 50 ml. Usando uma seringa de 10 ml com uma agulha de 25 G para lavar vigorosamente o fragmento com 10 ml de PBS para se obter uma suspensão de células de medula no tubo cónico. Centrifugar a suspensão de células durante 3 min a 300 xg e 21 ° C, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células peletizadas em PBS ou outra solução desejada para citometria de fluxo.
- H & E Coloração e imuno-histoquímica.
- Para processar os fragmentos de hematoxilina e eosina (H & E) coloração e / ou imuno-histoquímica, colocar os fragmentos em cassetes plásticas marcadas com um lápis número 2, e submergir num recipiente cheio com 10% de formalina tamponada durante 24 horas.
- Tecidos de processo para a inclusão em parafina, com secção e de coloração, usando protocolos de rotina, que incluem um passo descalcificação para dar conta das espículas mineralizadas dentro de cada fragmento.
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Representative Results
Isolamento de fragmentos de tecido de cabeças femorais
Cabeças femorais foram coletados a partir de um número igual de pacientes do sexo feminino (44-90 anos) submetidos a artroplastia electiva total da anca no Departamento de Cirurgia Ortopédica da Escola de Medicina da Universidade de Stanford e masculinos. Cada cabeça femoral descartada contém uma pequena porção do fêmur superior, que abriga tecido ósseo trabecular composto por espículas mineralizados e medula. Este tecido é acessível através da secção transversal cirurgicamente exposto do veio (Figura 2A), utilizando um rongeur cirúrgica para extrair pequenos fragmentos. A histologia das peças extraídas é mostrado na Figura 2B, revelando os componentes mineralizados e medula. O aspecto das peças extraídos varia entre cabeças femorais obtidos a partir de pacientes diferentes, que vão do amarelo ao vermelho, dependendo do teor de adipocitos da medula, como mostrado na Figura 2C. We demonstrar a utilização destes fragmentos de tecido ósseo em ensaios de curto prazo para medir as interacções dinâmicas com células de cancro da mama de engenharia para a luciferase e de expressão EGFP.
Co-cultura de células cancerosas da mama vizinhos a fragmentos ósseos medir mama proliferação celular usando Bioluminescência Imagem
A configuração da placa de cultura para células MDA-MB-231-Fluc-EGFP células de cancro da mama co-cultura com fragmentos de osso adjacentes imobilizadas para medir a proliferação de células da mama utilizando BLI é mostrado na Figura 3A. BLI da placa a 24 horas é ilustrada na Figura 3B, e o sinal de BLI de 3 experiências, demonstrando proliferação celular aumentada na presença versus ausência de fragmentos de osso é mostrado na Figura 3C.
As células do cancro da mama-cultura Co semeadas diretamente em fragmentos de ossos para estudar Colonização e número de celular
Colonização da MCF-7-FLUC-EGFP cells semeadas directamente sobre fragmentos de tecido ósseo como medido através BLI às 24 horas é ilustrada na Figura 4A, demonstrando diminuição de sinal associado com o declínio da densidade de sementeira. Um fragmento directamente semeado é mostrado em 48 na Figura 4B horas, após marcação com reagente biphosophonate fluorescente, como visualizado por microscopia de fluorescência para revelar a colonização das células do cancro da mama no interior dos compartimentos mineralizado e medula. Estes padrões de colonização também são revelados em fragmentos diretamente semeados processados pós-experimentalmente para coloração imuno-histoquímica com anticorpo cytokeratin (Figuras 4C e 4D).
Medindo migração de células do cancro da mama para fragmentos de tecido ósseo e culta Osso Fragmento sobrenadantes
A migração de células MDA-231-FLUC-EGFP através das membranas porosas de migração em direção sobrenadantes de cultura de tecido ósseo e em fragmentos ósseos é detectado com BLI, como mostrado na Figura 5. Um padrão de migração robusta para sobrenadantes de cultura derivados de três fragmentos de uma dada amostra THR é mostrado na Figura 5A, que mostra o aumento da migração em poços contendo sobrenadante tecido ósseo vs meio de controlo. Embora nem todos os padrões de migração são este robusto, a migração em direção sobrenadantes ósseas é tipicamente maior do que em direção a meio controle na maioria dos experimentos. Um padrão de migração típico em fragmentos de osso a partir de uma dada amostra THR é mostrado na Figura 5B.
Análise de Flushed abobrinhas
Além disso, ilustram que as células de medula pode ser lavada a partir de fragmentos colonizados, e que as células do cancro da mama pode ser corada detectada entre estas células por citometria de fluxo (Figura 6B), BLI (Figura 6C), e / ou microscopia de fluorescência (Figura 6D) .
Medindo Viabilidade
Figura 1: Defina-se de experiências de migração. (A) Em experiências de migração "para a frente", os poços da placa de receptor são preenchidos com sobrenadantes de cultura de tecido ósseo previamente gerados. As células cancerosas da mama que são semeadas sobre as superfícies superiores dos interiores, membranas Transwell em copos de inserção contendo DME-10% de FBS migram através das membranas e anexar ao fundo dos poços, para a detecção por BLI. 
Figura 2: Isolamento de fragmentos de tecido de cabeças femorais. (A) extracção de fragmentos de osso trabecular usando um rongeur cirúrgico. (B) Histologia do fragmento fixado imediatamente depois da extracção a partir de tecido que mostra o fémur mineralizado (seta branca) e medula (seta preta) compartimentos. Os fragmentos de osso (C) trabecular extraído de duas diferentes cabeças femorais demonstrando variação vs. vermelho conteúdo medula amarela. 
Figura 3: cancro da mama células-cultura Co adjacentes a fragmentos de ossos para medir a proliferação de células da mama utilizando imagem de bioluminescência. (A) Cultura configuração da placa de MDA-MB-231-FLUC-EGFP células co-cultura de câncer de mama adjacentes a fragmentos de ossos imobilizados, como indicado pelas setas: manchas celulares (azul), cera de osso (preto) e fragmento ósseo (vermelho ). A posição da cera óssea também foi observado por um círculo a tracejado preto. A placa é mostrada antes da adição do meio. O top 3 poços contêm fragmentos de ossos amarrados a cera de osso e o fundo três poços conter apenas cera de osso. (B) BLI da placa às 24 h. (C) A quantificação de sinais BLI para células MDA-MB-231-FLUC-EGFP crescer na presença (barras a púrpura) vs ausência (barras verdes) De fragmentos de três THR espécimes cultivados como descrito. Para cada amostra THR, barras representam os valores médios obtidos BLI por 3 contendo fragmentos - poços 3 vs. controle. Este resultado demonstra os níveis mais elevados de proliferação na presença versus ausência de fragmentos de osso. As barras de erro representam o erro padrão (p <0,01). Reproduzido com permissão 44. 
Figura 4: Detecção de células de cancro da mama semeadas directamente sobre os fragmentos ósseos. (A) A colonização de células MCF-7-FLUC-EGFP semeadas diretamente em fragmentos de tecido ósseo como detectado por BLI às 24 h, mostrando diminuição de sinal associado com o declínio da densidade de semeadura. (B) fragmento Diretamente-semeado em 48 horas após a semeadura, e 24 horas após marcação com reagente biphosophonate fluorescente. A microscopia de fluorescência revela EGFP + células de câncer de mama comociado a uma espícula mineralizada (seta verde), e com células adiposas no compartimento da medula (setas brancas). Estes padrões de colonização também são revelados em fragmentos directamente semeadas processadas para coloração imuno-histoquímica com um anticorpo pan-citoqueratina AE1 / AE3 seguinte de 72 horas de co-cultura (C) e (D). Em (C) células de câncer de mama citoqueratina-positivos, indicados por setas, são observados ao lado adipócitos no compartimento de medula. Em (D) uma célula de cancro da mama citoqueratina-positivo é observado ligado a um espícula mineralizado. (C) e (D) reproduzida com permissão 44. 
Figura 5:. Medindo a migração de células de câncer de mama para fragmentos de tecidos ósseos e sobrenadantes fragmento ósseo cultivadas Migração de MDA-MB-231células -fLuc-EGFP através de membranas porosas de migração em relação sobrenadantes de cultura de tecidos de osso e em fragmentos de osso como detectado às 24 h com BLI. (A) do sinal BLI revelando migração acrescida para os sobrenadantes da cultura derivados de um dado espécime THR vs meio de controlo. (B ) sinal BLI demonstrando padrão de migração de células de câncer de mama em três fragmentos de ossos de um único espécime THR. Fragmentos de tecido ósseo são indicados por círculos brancos pontilhadas. Os poços de controlo contendo pérolas de vidro são mostradas na parte inferior. 
Figura 6:.. A detecção de células MDA-MB-231fLUC-EGFP em medulas liberadas a partir de fragmentos colonizados (A) Fragmentos sem (à esquerda) e com (direita) colonizado células de câncer de mama, como detectado por BLI (B) Análise de medulas corou a partir de fragmentos (A) por fcitometria baixo. Células de EGFP-positivas de cancro da mama foram detectadas na medula corado do fragmento BLI-positiva, mas não o fragmento BLI negativos. (C) BLI detecção de colónias de células de cancro da mama resultantes da cultura de medula lavada a partir de um fragmento BLI-positivo. (D) A microscopia de fluorescência do compartimento da medula lavada a partir de um fragmento BLI-positiva, mostrando células MDA-MB-231fLUC-EFGP em um campo de células da medula. 
Figura 7:. As viabilidades para medição da viabilidade de células da medula liberadas a partir de fragmentos de tecidos isolados a partir de 4 THR amostras imediatamente após a colheita e a 24, 48, 72 h, e 6 dias de cultura em meio DMEM-10% FBS. O meio foi mudado para 24 e 72 horas.
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Discussion
Mehra et ai. Descreveram anteriormente a recolha post-mortem e análise de amostras de osso de pacientes com cancro da próstata metastático colhidas no momento de autópsia, revelando tecidos de alta qualidade e validação do uso de amostras de ossos humanos para estudar o processo metastático 47. Aqui descrevemos protocolos para a coleta, processamento e utilização de fragmentos de tecidos ósseos humanos obtidos a partir de cabeças femorais descartados após a cirurgia THR em um sistema de co-cultura de curto prazo para estudar a migração de células da mama, colonização e proliferação. Cerca de 300 mil cirurgias de substituição de quadril são realizadas anualmente em os EUA (American Academy of Orthopaedic Surgeons; Orthoinfo.aaos.org), e estes espécimes são normalmente descartados. Uma das indicações mais freqüentes para esta cirurgia é osteoartrite do quadril, levando ao colapso gradual das superfícies da cartilagem que cobre a cabeça femoral, o que resulta em dor nas articulações. Durante replacem total do quadrilcirurgia ent uma pequena porção do fémur superior é removida juntamente com a cabeça do fémur. O fêmur é um local comum de metástase de câncer de mama 48, e estas amostras contêm tecido ósseo trabecular, o site da colonização de células da mama metastático. A maioria dos pacientes que se submetem a substituição da anca são 50-80 anos de idade, faixa etária que os braquetes os anos de incidência de câncer de mama de pico. Assim, estes tecidos constituem um valioso recurso para o estudo do câncer de mama metastático osso nicho.
Existem vários passos críticos e considerações associadas a estas técnicas. Primeiro, um ronguer cirúrgica de boa qualidade é essencial para extrair os fragmentos pequenos osso trabecular, segurando a cabeça do fêmur na, mão enluvada oposto. Fórceps não vai funcionar porque eles não são resistentes o suficiente para extrair o tecido trabecular contendo espículas mineralizados. Outra consideração importante nestes ensaios pertence à célula da mama manuseio linha e passaging, particularmente em relação aos ensaios de migração. Passagem de longo prazo e / ou variabilidade nos processos tripsiniza�o pode levar à seleção seqüencial de mais populações de células / menos tenazes, potencialmente alterando as respostas migratórios em experimentos. Outra questão refere-se à padronização dos experimentos, dada a variabilidade dos tecidos cirúrgicos provenientes de pacientes de diferentes idades e estados de doença. Para resolver isso, nós empregamos um projeto experimental intra-sujeito em que todas as variáveis são testadas em triplicata (por exemplo, através de três fragmentos / poços experimentais contra três poços fragmentos / controle), utilizando fragmentos da peça cirúrgica de um determinado paciente. As variáveis podem ser testados usando este projeto em espécimes de vários pacientes, e analisados para significância estatística utilizando o teste T pareado para dados, calculados sobre repetições, e / ou um one-way intra-sujeitos ANOVA para os dados de mais de repetições. E finalmente, uma limitação principal deste método é a pequena janela de VIABilid durante a cultura de explantes.
Nossas medições revelaram viabilidades de medula de ~ 90% no dia da coleta, de acordo com medições de viabilidade obtidos a partir de aspirados de medula óssea 49. Ao longo do tempo, no entanto, observou-se uma queda gradual ao longo de dias dois e três, com dramática perda de viabilidade por dia 6. Apesar de não ter medido a viabilidade do compartimento mineralizada, observações qualitativas sugerem que há um declínio similar na viabilidade do osteoblastos osso forro e osteócitos, como visto na Figura 4D. Com base nesses experimentos, nós limitamos nossos experimentos de cultura de estudos a curto prazo realizados ao longo de 48 ou 72 horas. Experimentos preliminares (não incluídas) indicou que a viabilidade pode ser melhorada usando a mídia disponível comercialmente formulado para manter as células da medula. No entanto, não foram caracterizadas as populações de células de medula nestas experiências, e não se sabe se os melhores resultados de viabilidade a partir do seleccionadoconseqüência de determinadas subpopulações de células de medula. O desenvolvimento de protocolos para manter e prolongar a viabilidade destes explantes será importante para o avanço deste sistema modelo.
Embora este modelo é limitado a curtos períodos de tempo, as suas principais vantagens em relação a outros métodos incluem as seguintes características: 1) tecidos em 3 dimensões intactas que abrigam tipos de células relevantes que constituem o microambiente ósseo humano, 2) a acessibilidade ao microambiente ósseo para monitoramento e interações dinâmicas perturbadores, 3) um elevado número de fragmentos por espécime para experiências duplicadas, e 4) de baixo custo em comparação com modelos animais.
Embora tenhamos descrito os ensaios para estudar as metástases do cancro da mama para os ossos, estes espécimes e abordagens podem prontamente ser estendida para o estudo de outras doenças malignas do osso que procuram tais como o cancro da próstata, bem como de outras patologias ósseas. Embora tenhamos usado as cabeças femorais descartados principalmente como um modource de fragmentos de tecido, estes espécimes também constituem uma fonte adicional de medula óssea humana, que é tradicionalmente coletados por meio de aspiração da medula óssea de jovens voluntários. E, finalmente, quando já descrito abordagens utilizando linhas celulares manipuladas para bioluminescência e fluorescência, a maioria dos procedimentos podem ser modificados para utilização com outras células se estas linhas celulares e / ou plataformas de imagem não estão disponíveis.
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Acknowledgments
Estes estudos foram financiados, em parte, por doações da Fundação de Pesquisa e Desenvolvimento Alternativo (107.588), o Instituto Nacional de Saúde (1U54CA136465-04S1) e do Programa de Pesquisa de Câncer da Califórnia mama (201B-0141). Agradecemos Drs. Andrew Wilber e R. Scott McIvor para a generosa doação de seu
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (1X) + GlutaMAX-l | Life Technologies | 10569-010 | Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| McCoy's 5A Medium (1X) | Life Technologies | 16600-082 | Supplement all McCoy's with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillen Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Blastocidin (10 mgl/ml) | InvivoGen | ant-bl | Supplement media used for transfected cell lines. |
| Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size) | Corning Incorporated | 353097 | |
| Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate | Corning Incorporated | 353504 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells* | Invitrogen Detection Technologies | L-3224 | |
| FluoroBrite DMEM | Life Technologies | A18967-01 | |
| D-luciferin firefly, potassium salt 5 g (30 mg/ml) | Life Technologies | L-8220 | |
| Sterile Cell Strainer 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3516 | |
| 12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3513 | |
| 24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3526 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Bone wax | Surgical Specialties Corporation | 903 | |
| IVIS 50 Imaging Platform | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | ||
| Living Image Software Program | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | 133026 | |
| EVOS FL Imaging System | Life Technologies | Version 4.2 | |
| OsteoSense 680 EX | PerkinElmer | NEV10020EX | |
| MCF-7 breast cancer cells | ATCC | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | HTB-26 | |
| Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody | DAKO Cytomation | Clone (AE1/AE3) |
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