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एक चमड़े के नीचे ट्यूमर मॉडल में ट्यूमर घुसपैठ ल्युकोसैट कैंपेन्स के मूल्यांकन

Published: April 13, 2015 doi: 10.3791/52657
Automatic Translation
1, 3, 2,3, 3, 2
1Division of Oncology, Department of Medicine, Washington University School of Medicine, 2Palo Alto Institute for Research and Education, Veterans Affairs Palo Alto Health Care System, 3Laboratory of Immunology and Vascular Biology, Department of Pathology, Stanford University School of Medicine

Abstract

ट्यूमर microenvironment घुसपैठ कि विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिकाओं रसौली के विकास और अस्तित्व को विनियमित। घातक कोशिकाओं टलना या जीवित है और पनपने के क्रम में विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पलट देना चाहिए। ट्यूमर tolerogenic डीसी की भर्ती, प्रतिरक्षादमनकारी विनियामक टी कोशिकाओं (Tregs), और साइटोटोक्सिक विरोधी ट्यूमर प्रतिक्रियाओं को बाधित कि माइलॉयड व्युत्पन्न दबानेवाला कोशिकाओं (MDSC) सहित प्रतिरक्षा के विभिन्न तंत्र के एक नंबर "भागने" का लाभ ले। ट्यूमर दमन में भाग ले सकते हैं सभी immunostimulatory वृक्ष के समान कोशिकाओं, जन्मजात विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा के बंदरगाह जो प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं, और साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं: इसके विपरीत, विरोधी ट्यूमर प्रेरक प्रतिरक्षा कोशिकाओं कैंसर के विकास और विस्तार धीमा कर सकते हैं। समर्थक और विरोधी ट्यूमर ल्यूकोसाइट्स के बीच संतुलन अंततः व्यवहार और बदल कोशिकाओं के भाग्य निर्धारित करता है; मानव नैदानिक ​​अध्ययन की एक भीड़ इस बाहर वहन किया है। ल्युकोसैट कैंपेन्स के प्रकार, विस्तृत विश्लेषण के भीतरट्यूमर microenvironment तेजी से महत्वपूर्ण बन गया है। यहाँ, हम एक माउस ट्यूमर मॉडल में ट्यूमर microenvironment में उपस्थित घुसपैठ ल्युकोसैट कैंपेन्स का विश्लेषण करने के लिए एक विधि का वर्णन। माउस B16 मेलेनोमा ट्यूमर कोशिकाओं C57BL / 6 चूहों में subcutaneously inoculated थे। एक निर्दिष्ट समय में, ट्यूमर और आसपास त्वचा सामूहिक resected गया और फिर फ्लो बहु रंग के दाग थे जो एकल कक्ष निलंबन, में संसाधित। ल्युकोसैट सबसेट मार्करों की एक किस्म का उपयोग करना, हम नियंत्रण और chemerin व्यक्त ट्यूमर के बीच ल्युकोसैट कैंपेन्स घुसपैठ के रिश्तेदार प्रतिशत की तुलना में सक्षम थे। जांचकर्ता प्रतिरक्षा ट्यूमर microenvironment में उपस्थिति और ट्यूमर के विकास के पारंपरिक कैलीपर आकार माप के साथ संयुक्त, संभवतः उन्हें ट्यूमर के विकास पर प्रतिरक्षा संरचना में परिवर्तन के प्रभाव को स्पष्ट करने के लिए अनुमति देगा अध्ययन करने के लिए इस तरह के एक उपकरण का उपयोग कर सकते हैं। इस तरह की एक तकनीक किसी भी ट्यूमर मॉडल को लागू किया जा सकता है, जिसमें ट्यूमर और उसके microenvironment गएक resected और संसाधित किया।

Introduction

ट्यूमर के विकास को और बढ़ावा देने और प्रतिगमन के बीच संतुलन, भाग में, microenvironment 1,2 में मौजूद समर्थक और विरोधी ट्यूमर घुसपैठ leukocytes के संतुलन पर निर्भर है। (TME) ट्यूमर microenvironment का अध्ययन करने और विशेष रूप से घुसपैठ ल्युकोसैट उप-जनसंख्या की पहचान करने के लिए, हम एक murine ट्यूमर मॉडल में चमड़े के नीचे ट्यूमर के मूल्यांकन के लिए एक विधि विकसित की है। ट्यूमर microenvironment का अध्ययन करने के महत्व को अच्छी तरह से जाना जाता है और साहित्य में समर्थित है। कई अध्ययनों से समर्थक और विरोधी ट्यूमर घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं के संतुलन माउस में बल्कि (3,4 में समीक्षा) मानव अध्ययन ही नहीं, ट्यूमर के विकास के परिणामों को प्रभावित कर सकता है कि पता चला है। उदाहरण के लिए, Curiel एट अल। डिम्बग्रंथि के कैंसर के रोगियों में नैदानिक ​​परिणामों ट्यूमर घुसपैठ नियामक सीडी 4+ टी कोशिकाओं (Tregs) 5 के प्रतिशत में वृद्धि की उपस्थिति के साथ जोड़ा गया बिगड़ गई है कि पता चला है। हमारे अपने काम भी एक नहीं के प्रभाव को दिखायाभी साथ सहसंबद्ध जो एक माउस मेलेनोमा मॉडल 6, में ल्युकोसैट कैंपेन्स के अनुपात पर वेल ल्युकोसैट chemoattractant ट्यूमर के विकास को कम किया है। इस प्रकार, एक ट्यूमर के भीतर ल्युकोसैट कैंपेन्स के विस्तृत विश्लेषण अब अधिक मोटे तौर पर मान्यता प्राप्त है और तेजी से महत्वपूर्ण।

ल्यूकोसाइट्स घुसपैठ के लिए ट्यूमर microenvironment का मूल्यांकन करने के लिए कई तरीके हैं; क्षमता के साथ कुछ - उदाहरण के लिए समूहों छवि TME 7, शास्त्रीय immunohistochemistry और ऐसे एमआरआई, पीईटी, confocal माइक्रोस्कोपी 9-11 के रूप में विभिन्न इमेजिंग तौर तरीकों सहित संरक्षित वर्गों 8, की इम्यूनोफ्लोरेसेंस के क्रम में विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए ट्रांसजेनिक चूहों इंजीनियर है intravitally 10,12 निगरानी। ये ऐसे नैनोकणों 13 या उपन्यास विपरीत एजेंटों प्रतिरक्षा कोशिकाओं लेबल कि 14 के रूप में विभिन्न आणविक इमेजिंग एजेंट, के साथ प्रयोग किया जा सकता है। हमारे विधि एक फ्लो आधारित दृष्टिकोण है और कई फायदे हैं।सबसे पहले, पूरे ट्यूमर microenvironment जांचा जा सकता है; विश्लेषण के समय में, पूरे चमड़े के नीचे ट्यूमर और आसपास के परिधि शल्य चिकित्सा के प्रसंस्करण के लिए resected है। यह एक ट्यूमर के भीतर किसी भी संभावित नमूने पूर्वाग्रह समाप्त और एक पूरे के रूप में ट्यूमर का एक और अधिक "वैश्विक" विश्लेषण देता है। दूसरे, ल्युकोसैट कैंपेन्स का विश्लेषण करने के लिए cytometry के बहुरंगा प्रवाह का उपयोग कर अधिक विशेष रूप से घुसपैठ leukocytes के फेनोटाइप गेज करने के लिए हमें की अनुमति देता है। प्रयुक्त रंग की संख्या पर निर्भर करता है, बहुत विशिष्ट सबसेट पहचाना जा सकता है। या यहां तक ​​कि एक सामान्य उप वर्गीकरण में - - ट्यूमर के भाग्य का निर्धारण करने में संभावित महत्वपूर्ण हैं कि असमान कार्य किया है कि कई ल्युकोसैट एक विशेष सेल प्रकार के भीतर कैंपेन्स के रूप में वहाँ यह महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, plasmacytoid वृक्ष के समान कोशिकाओं (पीडीसी) विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा के 15 में फंसाया गया है। हालांकि, पीडीसी की CCR9 + सबसेट tolerogenic 16 होना दिखाया, और बीए स्थानांतरण कर दिया गया हैइस तरह के एक सबसेट के लांस ट्यूमर के विकास पर एक प्रभाव हो सकता है।

हमारे विधि चमड़े के नीचे या सामूहिक resected जा सकता है कि अन्य ट्यूमर के लिए उपयुक्त है। हमारे हाथ में, ट्यूमर समान रूप से इच्छामृत्यु के समय में resected थे। कुछ अध्ययनों में किया गया है के रूप में हालांकि, यह एक चमड़े के नीचे ट्यूमर पूरी तरह से इस प्रकार पशु के अतिरिक्त मूल्यांकन की अनुमति देता है, एक अस्तित्व सर्जरी 17 में चारों ओर की त्वचा के बंद होने के साथ resected किया जा सकता है, बोधगम्य है। विश्लेषण तो resected ट्यूमर पर किया जाता है। इस प्रकार, परिणाम ट्यूमर के विकास में एक भी timepoint प्रतिनिधित्व करते हैं। इस microenvironment में एक विस्तृत देखो की अनुमति देता है, यह भी कोई संदेह नहीं है एक गतिशील प्रक्रिया है की एक स्थिर तस्वीर है। हालांकि, पृथक ल्यूकोसाइट्स (जैसे के माध्यम से चुंबकीय जुदाई या घनत्व ढाल) previ किया गया है तो, ट्यूमर epithelia और स्ट्रोमा से अलग से विश्लेषण किया है, या आगे उनके फेनोटाइप को परिभाषित करने के लिए अन्य, कार्यात्मक assays में इस्तेमाल किया जा सकता हैously 18 में वर्णित है। इस विधि है, तो, प्राकृतिक रोग पाठ्यक्रम की स्थापना में, या एक विशिष्ट चिकित्सीय गड़बड़ी के बाद, चाहे एक निश्चित समय बिंदु पर ट्यूमर microenvironment भीतर leukocytes की संरचना को समझने में दिलचस्पी किसी भी जांचकर्ताओं के लिए उपयोगी होगा। हमारे द्वारा किया नहीं है, इस प्रक्रिया के रूपांतरों भी संभावित अलगाव में एक ट्यूमर के विशेष हिस्सों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, ट्यूमर के आकार को देखते हुए परिधीय क्षेत्र (एस) के शोधकर्ता ट्यूमर microenvironment का एक और अधिक स्थानिक अलग दृश्य देने के लिए दूर ट्यूमर के मध्य, संभवतः परिगलित कोर से विच्छेदित किया जा सकता है।

ट्यूमर प्रतिरक्षा विज्ञान के तेजी से बढ़ते क्षेत्र में, इसमें कोई शक नहीं murine ट्यूमर मॉडल में उपन्यास immunomodulatory एजेंटों के मूल्यांकन के अध्ययन के एक तेजी से बढ़ रही संख्या में हो जाएगा। कई रिपोर्टों परिधीय एन बनाम ट्यूमर के भीतर विशिष्ट ल्युकोसैट समारोह में मतभेद उजागर किया हैvironment। उदाहरण के लिए, Shafer-वीवर एट अल। वे ट्यूमर microenvironment 19 में तस्करी एक बार प्रतिजन विशेष टी प्रेरक सीडी 8 + कोशिकाओं, परिधि में सक्रिय है, जबकि सीडी 8 + टी शमन कोशिकाओं में तब्दील किया गया है कि एक माउस मॉडल में दिखाया। इस TGFβ की वजह से भाग में था, लेकिन अन्य कारकों की संभावना के रूप में अच्छी तरह से शामिल रहे हैं। इस प्रकार, ल्युकोसैट कैंपेन्स के मूल्यांकन - संख्या और अनुपात, साथ ही कार्यात्मक स्थिति - ट्यूमर के भीतर ही ट्यूमर भाग्य पर एक विशेष immunomodulation के प्रभाव का एक और अधिक सटीक प्रतिनिधित्व दे देंगे।

हमारी तकनीक ट्यूमर का विस्तृत विश्लेषण की अनुमति देता है और शोधकर्ता और अधिक बारीकी से पिछले दृष्टिकोण से ल्युकोसैट आबादी में परिवर्तन की पहचान करने के लिए एक अवसर प्रदान करता है।

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Protocol

नोट: सभी पशु प्रयोगों को मंजूरी दे दी स्टैनफोर्ड, पालो अल्टो वीए HCS के, और स्वास्थ्य संस्थागत AnimalCare और उपयोग समिति के दिशा-निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थान के अनुसार आयोजित किया गया।

1. नमूना संग्रह और प्रसंस्करण के लिए तैयार कर रहा है (आवश्यक समय: ~ 10-15 मिनट)

  1. पहले से छह के रूप में वर्णित murine B16F0 मेलेनोमा कोशिकाओं subcutaneously पर या महिला C57BL / 6 चूहों में पेट के midline के पास (0.5-1 एक्स 10 6) टीका लगाना। वैकल्पिक रूप से, (उदाहरण के लिए पार्श्व, स्तन वसा पैड, आदि) के अतिरिक्त संरचनात्मक स्थलों पर ट्यूमर कोशिकाओं को टीका लगाना।
    नोट: ट्यूमर की कोई भी संख्या (प्रत्यारोपित या सहज) इस प्रोटोकॉल का उपयोग प्रयोग किया जाता है और मूल्यांकन किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, अन्य सामान्यतः / 6 बृहदान्त्र लाइन MC38, लुईस फेफड़ों कार्सिनोमा (LLC) और प्रोस्टेट आवारा-सी 2 पंक्ति में शामिल C57BL में syngeneic ट्यूमर का इस्तेमाल किया। Immunodeficient चूहों में टीका मानव xenografts भी इस तरह से मूल्यांकन किया जा सकता है, यह पी है कि ध्यान दिया जाना चाहिएट्यूमर घुसपैठ leukocytes के rofiles जरूरी मेजबान माउस का immunodeficient राज्य के अनुसार बदल दिया जाएगा।
    1. पूरा मीडिया (जैसे RPMI 10% FBS और additives युक्त) या किसी अन्य उचित प्रोटीन युक्त बफर (जैसे HBSS या पीबीएस + 1% FBS के या 1% BCS) का प्रयोग करें। मीडिया टेंशन मत लो या पूर्व euthanization करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के लिए बफर।
  2. Resected ट्यूमर के लिए संग्रह ट्यूब और फिल्टर सेट; बर्फ पर इन जगह है।
    1. ट्यूमर के प्रति एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब का उपयोग resected किया जाना है। हर एक में एक 40-70 माइक्रोन सेल निलंबन फिल्टर डालें। वैकल्पिक रूप से, धातु फिल्टर जाल के साथ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब का उपयोग करें। 15 मिलीलीटर ट्यूब के शीर्ष पर एक कप के आकार का फिल्टर बनाने के लिए एक 5 मिलीलीटर सिरिंज सवार या मोटी कलम का उपयोग करें।
  3. लकीर और ट्यूमर के प्रसंस्करण के लिए उपकरणों को तैयार है; शल्य चिकित्सा संदंश और बांटना ठीक कैंची और प्रक्रिया ट्यूमर का उपयोग करें। Resections / ट्यूमर नमूनों के बीच उपकरणों को साफ करने के लिए 70% इथेनॉल का प्रयोग करें। बड़ी संख्या में ओ के लिएच नमूने (जैसे> 10), हम ट्यूमर नमूनों के बीच प्रसंस्करण समय में महत्वपूर्ण मतभेद से बचने के लिए कई शोधकर्ताओं द्वारा नमूने के एक साथ प्रसंस्करण सलाह देते हैं।

2. ट्यूमर लकीर (आवश्यक समय: ~ 5 मिनट / ट्यूमर)

  1. व्यक्तिगत रूप से कार्बन डाइऑक्साइड या अन्य अनुमोदित विधि का उपयोग B16 ट्यूमर असर चूहों euthanize।
  2. एक शल्य चिकित्सा के मंच पर माउस सुरक्षित। 70% इथेनॉल के साथ ट्यूमर क्षेत्र स्प्रे और अतिरिक्त पोंछ; यह किसी भी बाल वर्तमान के प्रसार को रोकने में मदद करता है। जरूरत के रूप में गैर नग्न चूहों के लिए, पूर्व लकीर को ट्यूमर के आसपास की त्वचा क्षेत्र दाढ़ी।
  3. संदंश और कैंची का प्रयोग, overlying सहित और त्वचा के आसपास, सामूहिक चमड़े के नीचे ट्यूमर बांटना। लिया "मार्जिन" त्वचा की राशि विविध है, लेकिन आम तौर पर ट्यूमर के आसपास की त्वचा के 2-3 मिमी बांटना जा सकता है।
    1. इस बिंदु पर resected ट्यूमर (+/- आसपास त्वचा) वजन। PL भीतर सुरक्षित फिल्टर में resected त्वचा / ट्यूमर अनुभाग रखेंastic शंक्वाकार ट्यूब।

3. एक एकल कोशिका ट्यूमर निलंबन की तैयारी (आवश्यक समय: ~ 5-7 मिनट / ट्यूमर)

  1. इस्तेमाल की संदंश और कैंची ट्यूमर और overlying / आसपास त्वचा कीमा। ऊतक के सभी बड़े वर्गों 1-2 मिमी वर्गों में कार्रवाई कर रहे हैं जब तक कैंची का उपयोग नमूना कीमा।
    नोट: आमतौर पर, पूरे ट्यूमर कार्रवाई कर रहे हैं; वैकल्पिक रूप से, बड़ा ट्यूमर के लिए, ट्यूमर के प्रतिनिधि वर्गों कीमा और संसाधित किया जा सकता है।
  2. एक डिस्पोजेबल 5 या 10 मिलीलीटर सिरिंज से एक सवार का प्रयोग, यंत्रवत् सुरक्षित फिल्टर के खिलाफ कीमा बनाया हुआ ट्यूमर के ऊतक disaggregate।
  3. एक pipettor का प्रयोग, ठंड मीडिया या बफर के 5-10 MLS के साथ कार्रवाई ट्यूमर के ऊतक धो लें। इस फिल्टर के माध्यम से एकल कक्षों फ्लश जाएगा।
  4. कुल संख्या और धोने की मात्रा लगभग समान आकार के ट्यूमर के लिए ही कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने, दो कदम ऊपर कई बार दोहराएँ।
    1. प्रसंस्कृत ट्यूमर के ऊतक धोने के बाद, निरीक्षणत्वचा और / या अन्य संयोजी ऊतक के छोटे टुकड़े फिल्टर में पीछे छोड़ दिया जाना चाहिए।
    2. वैकल्पिक रूप से, कोलैजिनेज और / या अन्य एंजाइमों के साथ अकेले मैकेनिकल disaggregation पर्याप्त नहीं हो सकता है, जहां ट्यूमर, पाचन के लिए पूर्व क़ीमा बनाने की प्रक्रिया करने के लिए किया जा सकता है। यह एक अधिक गहन एकल कक्ष निलंबन के लिए अनुमति देगा। हालांकि, यह इस तरह के पाचन प्रोटोकॉल सतह प्रतिजन अभिव्यक्ति 20 प्रभावित कर सकते हैं, इसलिए सावधानी इन परिणामों की व्याख्या में लिया जाना चाहिए कि ध्यान दिया जाना चाहिए।
  5. धो और बफर / मीडिया को जोड़ने और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस 500 XG पर centrifuging द्वारा गोली कोशिकाओं।

एकल कक्ष निलंबन की 4. FACS धुंधला (आवश्यक समय: ~ 30-60 मिनट)

  1. बर्फ के ठंडे FACS बफर में Resuspend कोशिकाओं (पीबीएस + 1% FBS) के।
  2. Trypan नीले और एक hemacytometer, या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना।
  3. मात्रा प्रति कुल व्यवहार्य सेल उपज निर्धारण करते हैं। इस डेटा एक्सट्रपलेशन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैFACS के डेटा के साथ संयोजन में ट्यूमर घुसपैठ leukocytes के निरपेक्ष संख्या।
  4. निर्धारित बनाने के लिए कोशिकाओं की संख्या से सना हुआ और FACS द्वारा विश्लेषण किया जाना है। यह कई कारकों (जैसे ट्यूमर ऊतक विज्ञान का प्रकार, ट्यूमर उम्र और आकार, घुसपैठ leukocytes के औसत प्रतिशत, आदि) से प्रभावित हो जाएगा।
    नोट: B16 मेलेनोमा में, हम ट्यूमर घुसपैठ leukocytes के एक कम प्रतिशत पाया (तिल, आम तौर पर <5%) ट्यूमर कोशिकाओं की तुलना में। इस प्रकार, कम से कम 1 एक्स 10 6 कुल ट्यूमर (ट्यूमर + घुसपैठ ल्यूकोसाइट्स) कोशिकाओं आम तौर पर विश्लेषण के लिए FACS के माध्यम से एकत्र किए गए थे।
    1. Trypan से सना हुआ गिनती डेटा का उपयोग करना, कोशिकाओं की गणना की मात्रा FACS के लिए दाग किया जाना है। तिल आम तौर पर कुल ट्यूमर कोशिकाओं के 5% का गठन अगर उदाहरण के लिए, (ट्यूमर कोशिकाओं के कई trypan दाग पर मृत हो जाएगा), ट्यूमर एकल कक्ष निलंबन की कुल संख्या में कारक इस दाग किया जाना है।
    2. कम आम ल्युकोसैट कैंपेन्स के लिए) CCR9 + पीडीसी (जैसे कुल ट्यूमर कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या का उपयोगजैसे 2-3 एकल कक्ष निलंबन में इन कोशिकाओं के सापेक्ष कम आवृत्ति दिया, FACS धुंधला के लिए) 10 6 एक्स।
  5. FACS के लिए ट्यूमर एकल कक्ष निलंबन दाग।
    1. लाइव / मृत भेदभाव के लिए, एक फिक्स दाग या गैर फिक्स दाग (जैसे propidium आयोडाइड) का इस्तेमाल किया जा सकता है का उपयोग करें। सेल लाइव / मृत भेदभाव के बिना दाग रहे हैं, तो सावधानी एंटीबॉडी के गैर विशिष्ट बंधन के लिए संभावित दी सलाह दी जानी चाहिए।
    2. एक मानक FACS धुंधला प्रोटोकॉल का उपयोग विशिष्ट ल्युकोसैट कैंपेन्स के लिए सेल निलंबन दाग। ब्लॉक कोशिकाओं पीबीएस / FBS के 1% चूहे सीरम और एफसी ब्लॉक प्रतिजन विशेष एंटीबॉडी के साथ धुंधला करने से पहले 10 मिनट के लिए (विरोधी CD16 / 32) युक्त के साथ बंधन गैर विशिष्ट एंटीबॉडी को कम करने के लिए। धुंधला विशिष्ट है सुनिश्चित करने के लिए सही निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी शामिल करें।
    3. FACS धुंधला पूरा होने के बाद इस बिंदु पर, 4% formaldehyde या इसी तरह की अन्य लगानेवाला एजेंट के साथ नमूने तय कर लो। दा में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर नमूनेआर के संग्रह और विश्लेषण के समय तक (fluorophores के शमन से बचने के लिए के रूप में)।
      नोट: समय की लंबी अवधि के लिए तय नमूने संग्रहीत fluorophores 21 के संकेत और तीव्रता में परिवर्तन हो सकता है।
    4. एक प्रवाह कोशिकामापी पर नमूने एकत्र। सेटिंग्स कोशिकामापी इष्टतम प्रवाह साधन और लेजर / डिटेक्टर की स्थापना के प्रकार के आधार पर अलग अलग होंगे।
      नोट: इसके अलावा, यहां तक ​​कि एक ही मशीन का उपयोग अगर प्रयोगों के बीच परिवर्तनशीलता हो सकता है। इस प्रकार, FACS के संग्रह और एक प्रयोग के विश्लेषण करने से पहले उचित मुआवजा सेटिंग सुनिश्चित करने के लिए (जैसे अंशांकन मोती का प्रयोग करके) उपयुक्त मशीन सेटअप प्रदर्शन करते हैं।
  6. Leukoctye कैंपेन्स का विश्लेषण
    1. , FACS के डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग डेटा का विश्लेषण करने के लिए। एक लाइव / मृत दाग के लिए, मृत कोशिकाओं को बाहर gating द्वारा शुरू करते हैं। जीवित कोशिकाओं के भीतर ल्यूकोसाइट्स की पहचान करने के लिए एक ल्युकोसैट विशिष्ट मार्कर (जैसे विरोधी CD45) के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करें।
      1. इस के बाद, विभिन्न गति का उपयोगएनजी योजनाओं धुंधला प्रोटोकॉल पर निर्भर करता है, विशिष्ट सबसेट की पहचान करने के लिए। उदाहरण के लिए, सीडी 4+ टी कोशिकाओं की पहचान CD45 + जनसंख्या से एसएससी लो क्षेत्र का चयन करें और CD19-CD3 + कोशिकाओं का चयन करने के लिए; इस सीडी 4+ टी कोशिकाओं से 22 की पहचान की जा सकती है।
    2. (यानी कैंपेन्स यों की कुल संख्या, प्रतिशत, या अनुपात का उपयोग करें) डेटा का विश्लेषण और स्थिरता सुनिश्चित करने और पैटर्न या प्रवृत्तियों की पहचान करने के लिए विभिन्न तरीकों की एक संख्या में मौजूद।
      नोट: उदाहरण के लिए, हम एकत्र कुल ट्यूमर कोशिकाओं (चित्रा 1) के एक प्रतिशत के रूप में कुल लाइव CD45 + कोशिकाओं को देखा। इसके अतिरिक्त, हम तो ट्यूमर के भीतर प्रत्येक ल्युकोसैट सबसेट (जैसे सीडी 4+ टी कोशिकाओं) का प्रतिशत गणना की और नियंत्रण और परीक्षण समूहों (चित्रा 3) के बीच के अनुपात के रूप में इन की तुलना में।

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Representative Results

हमारे परिणाम अधिक अभिव्यक्ति murine B16 ट्यूमर में chemerin के लिए मजबूर ट्यूमर घुसपैठ ल्यूकोसाइट्स (TILs) का प्रतिशत संवर्धित दिखाया। इसके अतिरिक्त, chemerin अभिव्यक्ति के साथ जुड़े ट्यूमर microenvironment भीतर प्रतिनिधित्व ल्युकोसैट कैंपेन्स के रिश्तेदार अनुपात में परिवर्तन की पहचान की गई। Pachynski एट अल। 6 से अनुमति के साथ फिर से प्रिंट।

चित्रा 1 resected दिन 17 ट्यूमर के FACS विश्लेषण द्वारा निर्धारित रूप में, नियंत्रण की तुलना में chemerin व्यक्त की है कि ट्यूमर में भीतर कुल CD45 + कोशिकाओं (TILs) में एक महत्वपूर्ण वृद्धि हुई थी कि पता चलता है। सना का प्रयोग, B16 ट्यूमर, ट्यूमर के immunofluorescence द्वारा CD45 + कोशिकाओं घुसपैठ में वृद्धि की पुष्टि की थी (चित्रा 2) cryosectioned।

FACS के डेटा के आगे विश्लेषण जहां cheme ट्यूमर में एन.के. कोशिकाओं, टी कोशिकाओं के औसत पर एक रिश्तेदार वृद्धि, पता चलता है, और परंपरागत डीसी (लिन B220- CD11c +)नियंत्रण ट्यूमर (चित्रा 3) की तुलना में व्यक्त खत्म रिन था। दबाने में एक भूमिका है या प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, विशेष रूप से माइलॉयड व्युत्पन्न दबानेवाला कोशिकाओं (लिन CD11b + GR1 +) और पीडीसी (Lin- B220 + CD11c पूर्णांक PDCA1 +) 16,23 को दबा सकते हैं कि ल्युकोसैट कैंपेन्स के प्रतिशत में एक रिश्तेदार कमी थी ।

पढ़ाई की बढ़ती संख्या ट्यूमर के विकास की दृष्टि से और नैदानिक ​​परिणामों 4,24,25, दोनों में एक महत्वपूर्ण कारक हो ट्यूमर microenvironment भीतर ल्युकोसैट कैंपेन्स के अनुपात से पता चला है। हमारे FACS के आंकड़ों के मुताबिक टी कोशिकाओं (कुल CD3 +) और ट्यूमर सेल प्रति एन.के. कोशिकाओं की संख्या प्रकट करने के लिए विश्लेषण किया गया था; इन प्रकार की कोशिकाओं में तेजी से नियंत्रण (चित्रा 4) की तुलना में chemerin व्यक्त ट्यूमर में प्रतिनिधित्व कर रहे थे।

प्रेरक (यानी एन और टी कोशिकाओं) और शमन सेल की एक सीधी तुलना (यानी MDSC और पीडीसी) ट्यूमर microenviron भीतर आबादी दोनों ट्यूमर समूहों के लिए जाहिर था तो प्रदर्शन किया। चित्रा 5 नियंत्रण की तुलना में chemerin व्यक्त ट्यूमर के भीतर का शमन सेल आबादी के लिए प्रेरक के अनुपात में उल्लेखनीय वृद्धि को दर्शाता है।

कुल मिलाकर, प्रतिनिधि परिणाम ल्युकोसैट सबसेट आबादी पर ट्यूमर microenvironment भीतर अभिव्यक्ति chemerin का प्रभाव, और देखा नैदानिक ​​लाभ के साथ सुसंगत तरीके में इन आबादियों और अनुपात के अनुकूल skewing दिखा।

चित्र 1
। चित्रा 1: 17 दिन पर नियंत्रण बनाम chemerin-व्यक्त करने से excised chemerin व्यक्त ट्यूमर में वृद्धि ट्यूमर घुसपैठ ल्यूकोसाइट्स ट्यूमर प्रवाह cytometry द्वारा CD45 + ल्युकोसैट घुसपैठ (व्यवहार्य कोशिकाओं की%) के लिए विश्लेषण किया गया; * पी <समूह प्रति 4 या अधिक चूहों के साथ की ± SEM के मतलब दिखा दो पूंछ छात्र के टी-परीक्षण से 0.05।

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। चित्रा 2: B16 मेलेनोमा तिल की इमेजिंग इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों नियंत्रण में CD45 + सेल पैठ (सफेद तीर) वर्णन और chemerin व्यक्त 9 दिन में excised मेलानोमा; बार 25 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है।

चित्र तीन
। चित्रा 3: chemerin व्यक्त ट्यूमर में ल्युकोसैट कैंपेन्स की बदल प्रतिनिधित्व FACS के डेटा का विश्लेषण करती है पीडीसी के लिए नियंत्रण ट्यूमर बनाम व्यक्त chemerin- में तिल सबसेट आवृत्ति का प्रवेश 2 अनुपात के माध्यम से परिवर्तित कर दिया गया (plasmacytoid डीसी; Lin- CD11c पूर्णांक B220 + PDCA1 +) सीडीसी (पारंपरिक डीसी, लिन CD11c हाय B220-), सीडी 4 (CD3 + सीडी 4 +) टी कोशिकाओं, सीडी 8 (CD3 + सीडी 8 +) टी कोशिकाओं, कुल टी कोशिकाओं (CD3 + सीडी 4 + और ​​CD3 + सीडी 8 +), एन.के. कोशिकाओं (CD3-NK1। 1 +), CD11b (लिन CD11b +) monocyte / मैक्रोफेज, MDSC (माइलॉयड व्युत्पन्न दबानेवाला कोशिकाओं; लिन CD11b + GR1 +) और CD19 + बी कोशिकाओं (CD3-CD19 +)।

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चित्रा 4:। के रूप में वर्णित B16 ट्यूमर में शमन ल्यूकोसाइट्स के लिए प्रेरक का अनुपात बदल दिवस 17 B16 मेलेनोमा ट्यूमर FACS द्वारा विश्लेषण किया गया। व्यक्तिगत ल्युकोसैट कैंपेन्स gating के द्वारा पहचान की गई। एन.के. या प्रत्येक ट्यूमर के प्रकार में MDSC या पीडीसी के लिए कुल टी कोशिकाओं का अनुपात तो गणना की गई।

चित्रा 5
। चित्रा 5: chemerin व्यक्त B16 ट्यूमर नियंत्रण या chemerin व्यक्त ट्यूमर में वृद्धि प्रेरक कोशिकाओं FACS द्वारा विश्लेषण किया गया। 10,000 कुल ट्यूमर कोशिकाओं प्रति टी और एन.के. कोशिकाओं की निरपेक्ष संख्या FACS के डेटा का उपयोग कर की गणना की गई। परिणाम एक प्रतिनिधि प्रयोग से कर रहे हैं।

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Discussion

ट्यूमर microenvironment के विस्तृत विश्लेषण प्रदर्शन तंत्र और immunomodulation के प्रभाव का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण है। ट्यूमर घुसपैठ ल्यूकोसाइट्स पर इन एजेंटों के प्रभाव को समझने के लिए मानव नैदानिक ​​दायरे में immunotherapeutics की बढ़ती उपस्थिति, के साथ कार्रवाई के अपने तंत्र को परिभाषित करने में अपेक्षित होता जा रहा है। इंसानों में, अक्सर इस प्रकार परिधीय प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का विश्लेषण प्राप्त करने और ल्युकोसैट सबसेट विश्लेषण के लिए ट्यूमर के ऊतक का विश्लेषण, और नैदानिक ​​और / या रसद कठिनाइयों वहां मौजूद अक्सर किया जाता है। शोधकर्ता पशु मॉडल में preclinical अध्ययन की अनुमति देता है प्रदर्शन और पूरी तरह से इस प्रकार नैदानिक ​​परिणामों को प्रभावित कर सकता है कि तंत्र में अतिरिक्त जानकारी दे रही है, ट्यूमर के भीतर ही प्रतिरक्षा प्रणाली पर immunomodulatory एजेंटों के प्रभाव का पता लगाने के लिए।

हमारी तकनीक ट्यूमर घुसपैठ leukocytes के विस्तृत विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। पूरे ट्यूमर microenvironment कर सकते हैं क्योंकिजांचा जा, ट्यूमर के भीतर प्रतिरक्षा उपस्थिति का एक और अधिक वैश्विक दृष्टि से मूल्यांकन किया जा सकता है। और, अंत में, समर्थक ट्यूमर शमन कोशिकाओं और विरोधी ट्यूमर प्रेरक कोशिकाओं का संतुलन ट्यूमर के विकास और नैदानिक ​​परिणामों 4 पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है। इस प्रकार, विश्लेषण के इस प्रकार वर्तमान विशिष्ट ल्युकोसैट कैंपेन्स के बारे में विस्तृत जानकारी के साथ शोधकर्ता प्रदान करने में मूल्यवान है। इस विस्तृत डेटा आगे ट्यूमर के भीतर प्रतिरक्षा तंत्र को स्पष्ट करने के लिए अन्य कार्यात्मक डेटा के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल के रिश्तेदार सादगी एक समूहों के भीतर परिवर्तनशीलता को कम करने के क्रम में ट्यूमर के बड़े साथियों का मूल्यांकन करने की अनुमति देता है। इमेजिंग के अधिक विशिष्ट और प्रचलित दृष्टिकोण के साथ तुलना में (या तो आईएचसी या immunofluorescence द्वारा), हमारी तकनीक बहु रंग प्रवाह cytometry का उपयोग करके बहुत विशिष्ट ल्युकोसैट सबसेट की पहचान के लिए अनुमति देता है। नमूने के लिए की क्षमता या तो (परिधि सहित) पूरे ट्यूमर या के एक वर्गट्यूमर नमूना और विश्लेषण के मामले में अनुसंधानकर्ता अतिरिक्त लचीलापन देता है। यह भी इस प्रकार के ट्यूमर microenvironment के एक अधिक सटीक तस्वीर दे रही है, इमेजिंग द्वारा कई ऊतक वर्गों के विश्लेषण के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है की तुलना में ल्यूकोसाइट्स के बारे में काफी अधिक डेटा के संकलन की अनुमति देता है।

हम व्यापक रूप से ट्यूमर टीका और माप के रिश्तेदार आराम दिया माउस मॉडल में उपयोग किया जाता है जो त्वचा के नीचे ट्यूमर, पर इस तकनीक का उपयोग किया। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल ट्यूमर मॉडलों की संभावना बहुमत के लिए लागू होगी। हालांकि, तकनीक में भी ट्यूमर लकीर के लिए अतिरिक्त कदम के साथ यद्यपि, Orthotopic या सहज ट्यूमर मॉडल से resected ट्यूमर को लागू किया जा सकता है। B16 मेलेनोमा एक एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने के लिए एंजाइम पाचन आवश्यकता नहीं किया था और, जबकि इस कदम के लिए एक वर्दी प्राप्त करने के लिए आवश्यक है, जहां अन्य ट्यूमर के प्रकार, प्रतिनिधि एकल कक्ष निलंबन हो सकता है। फायदे ट्यूमर secti की है कि इमेजिंग वहाँ भी कर रहे हैंऑन्स हमारी तकनीक के साथ मूल्यांकन नहीं किया जा सकता कि परमिट। उदाहरण के लिए, ट्यूमर microenvironment भीतर ल्युकोसैट स्थानीयकरण पर अधिक विशिष्ट डेटा आईएचसी यदि / के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, और इस बार FACS विश्लेषण द्वारा उपलब्ध कराए गए आंकड़ों के लिए एक मूल्यवान सहायक हो सकता है।

अंत में, ट्यूमर microenvironment भीतर ल्युकोसैट कैंपेन्स के मूल्यांकन के लिए हमारी तकनीक शोधकर्ता एक अपेक्षाकृत सरल प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक ट्यूमर के भीतर प्रतिरक्षा उपस्थिति का विस्तृत विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए अनुमति देता है। यह माउस ट्यूमर मॉडलों में से एक बहुमत के लिए लागू किया जा सकता है और ट्यूमर के भीतर मौजूद ल्युकोसैट प्रकार, संख्या, और अनुपात के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी को स्पष्ट कर सकते हैं।

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Acknowledgments

इस काम अनुदान R01-CA169354 द्वारा समर्थित किया गया   और R01-047822   स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान और दिग्गजों मामलों के विभाग (ईसीबी) से एक मेरिट अवार्ड से। RKP एनआईएच T32 CA009287-30A1, एक ASCO युवा अन्वेषक पुरस्कार, कैलिफोर्निया स्तन कैंसर अनुसंधान परियोजना फैलोशिप, और एक अमेरिकन कैंसर सोसायटी Mentored रिसर्च स्कॉलर अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; बाज एनआईएच अनुदान AI079320 द्वारा समर्थित किया गया। जेएम एनआईएच टी 32 प्रशिक्षण अनुदान T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 और अमेरिकन कैंसर सोसायटी के बाद डॉक्टरेट फैलोशिप पीएफ-12-052-01-सीएसएम से फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI Cellgro 10-040 http://cellgro.com; keep on ice
FBS Cellgro 35-011-CV http://cellgro.com
50 ml conical tubes Falcon 14-432-22 fischersci.com
40 μm filter Falcon 08-771-1 fischersci.com
5 ml syringe BD 14-823-35 fischersci.com
surgical scissors/forceps Roboz RS-5910 roboz.com
PBS Cellgro MT-21-030-CM http://cellgro.com; keep on ice
trypan blue Cellgro MT-25-900-CI fischersci.com
hemacytometer Hausser Scientifice  02-671-54  fischersci.com
Live/Dead stain Life Technologies L34957 lieftechnologies.com
FlowJo software TreeStar, Inc flowjo.com

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चिकित्सा अंक 98 Chemerin ट्यूमर microenvironment ल्युकोसैट कैंपेन्स एन.के. कोशिकाओं chemoattractant मेलेनोमा ल्युकोसैट प्रवास immunophenotype
एक चमड़े के नीचे ट्यूमर मॉडल में ट्यूमर घुसपैठ ल्युकोसैट कैंपेन्स के मूल्यांकन
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Pachynski, R. K., Scholz, A.,… More

Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. J. Vis. Exp. (98), e52657, doi:10.3791/52657 (2015).

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