Abstract
腫瘍微小環境に侵入専門免疫細胞は、腫瘍の成長および生存を調節する。悪性細胞が生き残り、繁栄するために、抗腫瘍免疫応答を逃れるまたは覆す必要があります。腫瘍は、寛容原性DCの動員、免疫調節性T細胞（Tregの）、および細胞傷害性抗腫瘍応答を阻害骨髄由来サプレッサー細胞（MDSC）を含む免疫の異なる多数のメカニズム「脱出」を利用する。逆に、抗腫瘍エフェクター免疫細胞は、悪性腫瘍の成長および拡大を遅らせることができる。免疫刺激性樹状細胞は、生得的な抗腫瘍免疫を保有するナチュラルキラー細胞、および細胞傷害性T細胞は、すべての腫瘍抑制に関与することができる。プロ - および抗腫瘍、白血球との間のバランスは、最終的に行動し、形質転換された細胞の運命を決定する。ヒト臨床研究の多数がこれを裏付けている。内の白血球サブセットのため、詳細な分析腫瘍微小環境はますます重要になってきている。ここでは、マウス腫瘍モデルにおいて腫瘍微小環境に存在する浸潤白血球サブセットを分析するための方法を記載する。マウスB16メラノーマ腫瘍細胞をC57BL / 6マウスに皮下接種した。指定された時間に、腫瘍および周囲の皮膚を一括切除し、次に、マルチカラーフローサイトメトリーのために染色した単一細胞懸濁液に加工。白血球サブセットマーカーのさまざまな方法を使って、私たちはコントロールとケマリン発現腫瘍の間で白血球サブセットを浸透させるの相対的な割合を比較することができました。研究者らは、腫瘍微小環境における免疫の存在を研究するためのそのようなツールを使用して、腫瘍増殖の従来のキャリパーサイズの測定と組み合わせた場合、潜在的に、それらは、腫瘍増殖に対する免疫組成の変化の影響を解明することを可能にすることができる。このような技術は、腫瘍とその微小環境cの任意の腫瘍モデルに適用することができる切除して処理すること。
Introduction
腫瘍増殖およびプロモーションと回帰とのバランスが、部分的には、微小環境1,2に存在するプロおよび抗腫瘍浸潤白血球のバランスに依存している。腫瘍微小環境（TME）を研究し、特に浸潤白血球亜集団を同定するために、我々は、マウス腫瘍モデルにおいて皮下腫瘍を評価するための方法を開発した。腫瘍微小環境を研究することの重要性はよく知られており、文献でサポートされています。多くの研究は、プロのバランスおよび抗腫瘍浸潤性免疫細胞がマウスでも（3,4に総説）ヒトの研究だけでなく、腫瘍増殖の結果に影響を与えることができることを示している。例えば、Curiel らは、卵巣癌患者の臨床転帰は、腫瘍浸潤調節性CD4 + T細胞（Tregの）5の割合を増加させるの存在と相関していたが悪化ことが示された。私たち自身の仕事も無いの効果を示したまた、減少、腫瘍増殖と相関したマウス黒色腫モデル6における白血球サブセットの比率にヴェル白血球走化性。このように、腫瘍内の白血球サブセットの詳細な分析は、今より広く認識され、ますます重要。
白血球浸潤のための腫瘍微小環境を評価するための多くの方法があります。例えば、グループはTME 7、例えばMRI、PET、共焦点顕微鏡9-11のような様々な撮像モダリティを含む保存部 8,9、古典的免疫組織化学および免疫蛍光画像への順序で種々の蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスを設計している-の能力を有するいくつかのintravitally 10,12監視します。これらは、免疫細胞を標識13または新規造影剤14ナノ粒子のような、種々の分子イメージング剤と共に使用することができる。我々の方法は、フローサイトメトリーに基づくアプローチであり、いくつかの利点を有する。まず、全体の腫瘍微小環境をサンプリングすることができる。解析時に、全体の皮下腫瘍とその周辺の周辺は、外科的に処理するために切除されている。これは、単一の腫瘍内の任意の潜在的にサンプリングバイアスを排除し、全体としての腫瘍の多くの「グローバル」な分析を提供します。第二に、白血球サブセットを分析するためにフローサイトメトリー多色フローを使用すると、私たちは、より具体的に浸潤白血球の表現型を測定することができる。使用される色の数に応じて、非常に特定のサブセットを同定することができる。あるいは一般的なサブタイプ分類 - - いくつかの白血球サブセットは、特定の細胞型内であるように、これは重要である腫瘍の運命を決定するのに潜在的に重要であり、異なる機能を持っている。例えば、形質細胞様樹状細胞（pDC）は、抗腫瘍免疫15に関係している。しかし、pDCはのCCR9 +サブセットは16寛容原性であることが示され、及びBaをシフトされていますこのようなサブセットのランスは、腫瘍増殖に影響を与える可能性がある。
我々の方法は、皮下または一括切除することができる他の腫瘍に適しています。私たちの手では、腫瘍は均一に安楽死の時点で切除した。いくつかの研究で行われているようしかし、皮下腫瘍が完全にこのような動物の追加の評価を可能にする、生存手術17における周囲の皮膚の閉鎖を切除することができること、が考えられる。分析は、その後切除腫瘍に対して行われる。このように、結果は、腫瘍の開発にシングルの時点を表す。これは微小環境を詳細に見てことができますが、それはまた、間違いなく動的なプロセスであるものの静止画です。しかし、単離された白血球（ 例えば介して磁気分離または密度勾配）previされているように、その後、腫瘍上皮および間質から別々に分析するか、さらにそれらの表現型を定義するために、他の機能的アッセイにおいて使用され得るously 18を説明した。この方法は、その後、天然の疾患経過の設定で、または特定の治療的摂動の後であれ、与えられた時点で、腫瘍微小環境内での白血球の組成を理解することに関心の任意の研究者のために有用であろう。我々が行っていないが、この手順のバリエーションはまた、潜在的に分離して、腫瘍の特定の部分を分析するために使用することができる。例えば、腫瘍の大きさを考えると、周辺ゾーン（S）は、研究者の腫瘍微小環境のより空間的に分離されたビューを提供するために、腫瘍の中央、おそらく壊死性コアから離れて解剖することができた。
腫瘍免疫学の急成長分野で、間違いなくマウス腫瘍モデルにおける新規免疫調節薬を評価する研究の指数関数的に増えては存在しません。いくつかの報告は、周辺EN対腫瘍内の特定の白血球機能の違いを強調しているvironment。例えば、シェーファー、ウィーバーらは、それらが腫瘍の微小環境19に売買されると、抗原特異的TエフェクターCD8 +細胞は、末梢におけるアクティブながら、CD8 + Tサプレッサー細胞を形質転換したマウスモデルで示した。これは、TGFβに一部だったが、他の要因は、おそらく同様に関与している。したがって、白血球サブセットの評価 - 数字や比率、ならびに機能状態を - 腫瘍自体の中では、腫瘍の運命の特定の免疫調節効果のより正確な表現を与える。
我々の技術は、腫瘍の詳細な分析を可能にし、研究者に、より密接従来のアプローチよりも白血球集団の変化を識別するための機会を提供する。
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Protocol
注：全ての動物実験は、承認されたスタンフォード、パロアルトVA HCS、衛生制度AnimalCare使用委員会のガイドラインの国立研究所に従って行った。
1.サンプル収集および処理の準備（所要時間：〜10〜15分）
- 先に説明したように6マウスB16F0メラノーマ細胞を皮下においてまたは雌性C57BL / 6マウスにおける腹部の正中線近く（0.5×10 6）を接種する。あるいは、（ 例えば、腹部、乳房脂肪体など）追加の解剖学的部位に腫瘍細胞を接種する。
注：任意の腫瘍の数（移植または自発的）は、このプロトコルを使用して使用して評価することができる。例えば、C57BL / 6の他の一般的に使用される同系腫瘍は、結腸ラインMC38、ルイス肺癌（LLC）、および前立腺TRAMP-C2ラインが含まれています。免疫不全マウスに接種したヒト異種移植片はまた、このようにして評価することができるが、それは、pことに留意すべきである腫瘍浸潤白血球のrofiles必ずしも宿主マウスの免疫状態に応じて変更される。- 完全培地（ 例えば、RPMI、10％FBSおよび添加剤を含有する）または別の適切なタンパク質含有緩衝液（ 例えば、HBSSまたはPBS + 1％FBSまたは1％BCS）を使用する。メディアを冷やしたり前に安楽死に4℃にバッファ。
- 切除した腫瘍のためのコレクションチューブとフィルタを設定します。氷の上にこれらを配置。
- 腫瘍ごとに1つの50ミリリットルコニカルチューブを使用する切除する。各1で40〜70ミクロンの細胞懸濁液フィルタを挿入します。また、金属フィルターメッシュと15ミリリットルコニカルチューブを使用しています。 15mlチューブの上部にカップ状のフィルタを作成することを5mlシリンジプランジャーまたは太いペンを使用。
- 切除し、腫瘍の処理のための機器を準備する。腫瘍を切除し、プロセスするために、外科鉗子と細かいハサミを使用しています。切除/腫瘍サンプル間の楽器をきれいに70％エタノールを使用してください。より多くのOにfのサンプル（ 例えば、> 10）、我々は、腫瘍試料との間の処理時間の有意差を回避するために、複数の研究者によるサンプルの同時処理をお勧めします。
2.腫瘍切除（所要時間：約5分/腫瘍）
- 二酸化炭素または他の承認された方法を使用して個別にB16腫瘍を有するマウスを安楽死させる。
- 外科のステージ上でマウスを固定します。 70％エタノールで腫瘍領域をスプレーし、過剰のオフを拭き取る。これは、任意のヘア存在の広がりを防ぐことができます。必要に応じて非ヌードマウスの場合は、切除前に腫瘍の周りの皮膚領域を剃る。
- 鉗子やハサミを使って、肌の上に重なると周囲のを含め、 一括皮下腫瘍を切除。取ら「余白」は、皮膚の量は変えるが、一般的に腫瘍の周りの皮膚2-3 mmの切除することができます。
- この時点で、切除した腫瘍（+/-周囲の皮膚）を秤量する。 PL内に固定フィルタに切除された皮膚/腫瘍セクションを配置asticコニカルチューブ。
3.シングル細胞腫瘍懸濁液を調製する（所要時間：〜5-7分/腫瘍）
- 腫瘍とその上/周囲の皮膚をミンチする鉗子とハサミを使用してください。組織のすべての大きなセクション1〜2 mmのセクションに処理されるまでハサミを使用してサンプルをみじん切りに。
注：一般的に、全体の腫瘍が処理されます。代わりに、より大きな腫瘍のために、腫瘍の代表的な切片はみじん切りして処理することができた。 - 使い捨て5または10 mlシリンジからプランジャーを用いて、機械的に保護されたフィルタに対してミンチ腫瘍組織を脱凝集。
- ピペッターを使用して、冷たいメディアまたはバッファーの5-10 MLSで処理腫瘍組織を洗う。これは、フィルタを通して単一細胞をフラッシュします。
- 総数と洗浄液の容積が約同じような大きさの腫瘍のために同じであることを保証し、上記の二つのステップを数回繰り返します。
- 処理された腫瘍組織を洗浄した後、観察する皮膚および/または他の結合組織の小さな断片は、フィルターに残されるべきである。
- あるいは、単独で、機械的解離は、十分でないかもしれない腫瘍について、コラゲナーゼおよび/または他の酵素による消化の前ミンチプロシージャを実行することができる。これは、より徹底した単一細胞懸濁液を可能にする。しかしながら、そのような消化プロトコルが表面抗原発現20に影響を与えることができることに留意すべきであるので、注意がこれらの結果の解釈に注意すべきである。
- ウォッシュやメディア/緩衝液を添加し、5分間、4℃500×gで遠心分離して細胞をペレット化すること。
単一細胞懸濁液の4 FACS染色（所要時間：〜30〜60分）
- 氷冷FACS緩衝液（PBS + 1％FBS）で細胞を再懸濁。
- トリパンブルーおよび血球計、または自動細胞カウンターを用いて生細胞を数える。
- 体積あたりの総生細胞収量を決定します。このデータを外挿するために使用することができFACSデータと組み合わせて、腫瘍浸潤白血球の絶対数。
- 決定した細胞の数を染色し、FACSによって分析する。これは、いくつかの要因（ 例えば 、腫瘍の組織学的タイプ、腫瘍の年齢およびサイズ、白血球浸潤の平均割合）に影響される。
NOTE：B16メラノーマでは、腫瘍浸潤白血球の低い割合を見出した（TILを、典型的には<5％）の腫瘍細胞と比較した。したがって、少なくとも1×10 6全腫瘍（腫瘍浸潤白血球+）細胞は、典型的には分析のためにFACSを介して収集した。- FACSのために染色される細胞の量を算出し、トリパン染色し、計数データを使用して。 TILは、典型的には、全腫瘍細胞の5％を構成する場合は、（腫瘍細胞の多くは、トリパン染みに死んでいるだろう）、腫瘍の単一細胞懸濁液の合計数に係数これは、染色される。
- あまり一般的では白血球サブセット例えば CCR9 + pDCのための）総腫瘍細胞（より大きな番号を使用例えば、2-3×10 6）FACS染色のために、単一細胞懸濁液中でのこれらの細胞の相対的な低周波を与え。
- FACSのための腫瘍の単一細胞懸濁液を染色。
- 生/死差別については、固定可能な汚れまたは非固定可能な汚れ（ 例えばヨウ化プロピジウム）を使用することができるを使用しています。セルは生/死差別なく染色される場合は、注意が抗体の非特異的結合の可能性を与えられた助言する必要があります。
- 標準的なFACS染色プロトコルを用いて、特定の白血球サブセットのための細胞懸濁液を染色する。 10分間、PBS / FBS、1％ラット血清およびFcブロック（抗CD16 / 32）を含有して非特異的抗体結合を低減するためのブロック細胞抗原特異的抗体で染色する前に。染色が特異的であることを確認するために、正しいアイソタイプコントロール抗体を含む。
- この時点で、FACS染色が完了した後、4％パラホルムアルデヒドまたは他の同様の固定剤で試料を固定する。ダで4℃で保存サンプルrkの収集と分析の時まで（フルオロフォアの消光を回避するように）。
注：長時間固定したサンプルを保存するフルオロフォア21の信号強度の変化を生じ得る。 - フローサイトメーターでサンプルを収集します。設定サイトメーター最適な流れは、機器及びレーザ/検出器の設定の種類に応じて変化するであろう。
注：さらに、たとえ同じマシンを使用している場合は、実験間の変動があり得る。したがって、各実験の前のFACS収集および分析に適切な補償の設定を確実にするために（ 例えば、キャリブレーションビーズを使用して）適切な機械の設定を行う。
- leukoctyeサブセットの分析
- データを分析するために、FACSデータ分析ソフトウェアを使用。生/死染みのために、死細胞をゲーティングすることによって開始する。生きた細胞内の白血球を識別するために、白血球特異的マーカー（ 例えば 、抗CD45）に対する抗体を使用してください。
- この後、さまざまなガチを使用ngのスキームは、染色プロトコルに応じて、特定のサブセットを同定することができる。例えば、CD4 + T細胞を同定するためのCD45 +集団からSSC 見よ領域を選択し、CD19-CD3 +細胞を選択する。このCD4 + T細胞からの22を識別することができる。
- （ すなわちサブセットを定量化するために、合計の数字、パーセント、または比率を使用）データを分析し、一貫性を確保し、パターンや傾向を特定するために、さまざまな方法でそれを提示する。
注：例では、収集された全腫瘍細胞（ 図1）の割合として総生存CD45 +細胞を調べた。さらに、我々は次に、腫瘍内の各白血球サブセット（例えば、CD4 + T細胞）の割合を計算し、対照および試験群の間の比率（ 図3）、これらを比較した。
- データを分析するために、FACSデータ分析ソフトウェアを使用。生/死染みのために、死細胞をゲーティングすることによって開始する。生きた細胞内の白血球を識別するために、白血球特異的マーカー（ 例えば 、抗CD45）に対する抗体を使用してください。
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Representative Results
我々の結果は、過剰発現マウスB16腫瘍におけるケマリンの強制は、腫瘍浸潤白血球（TILの）の割合を増強することを示した。さらに、ケマリン発現と関連する腫瘍微小環境内で表現白血球サブセットの相対的な比率の変化を同定した。 Pachynski ら 6から許可を得て再印刷。
図1は、切除された日のFACS分析17腫瘍によって決定されるように、対照と比較しケマリンを発現した腫瘍における内の総CD45 +細胞（TILの）の有意な増加があったことを示している。染色され、凍結切片B16腫瘍を用いて、腫瘍の免疫蛍光によってCD45 +細胞浸潤の増加（ 図2）を確認した。
FACSデータのさらなる分析は、どこcheme腫瘍においてNK細胞、T細胞の平均に対する相対的な増加を示し、従来のDC（リン-B220 - のCD11c +）rinが対照腫瘍（ 図3）と比較して過剰発現させた。抑制または免疫応答を抑制することができるに役割を有する白血球サブセットの割合の相対的減少、特に骨髄由来抑制細胞（LIN-のCD11b + GR1 +）とPDCの（リニアB220 + CD11cのint型の PDCA1 +）の16,23がありました。
研究数の増加は、両方の腫瘍増殖および臨床転帰4,24,25の点で、重要な因子であると腫瘍微小環境内での白血球サブセットの比率を示している。我々のFACSデータは、さらにT細胞（全CD3 +）および腫瘍細胞あたりのNK細胞の数を明らかにするために分析した。これらの細胞型は、ますますコントロール（ 図4）と比較しケマリン発現腫瘍に示した。
エフェクター（ すなわち NKおよびT細胞）およびサプレッサー細胞の直接比較（ すなわち MDSCとPDC）腫瘍microenviron内集団両方の腫瘍群のためメントは、その後行われた。 図5は 、対照と比較しケマリン発現腫瘍内のサプレッサー細胞集団にエフェクターの比率の有意な増加を示している。
全体的に、代表的な結果が見られる臨床的利益と一致する方法で白血球サブセット集団に腫瘍微小環境、およびこれらの集団および比率の有利なスキュー内ケマリン発現の効果を示している。
。図1：17日目のコントロール対ケマリン発現から切り出しケマリン発現腫瘍で増加した腫瘍浸潤白血球腫瘍は、フローサイトメトリーによるCD45 +白血球浸潤（生存細胞の％）について分析した。 * P <0.05、グループあたり4匹以上のマウスとの平均±SEMを示す両側スチューデントt検定による。
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。図2：B16メラノーマTILのイメージング免疫蛍光画像は、9日目に切除制御とケマリン発現メラノーマにおいてCD45 +細胞の浸潤（白矢印）を示す。バーは25μmで表しています。
図3：ケマリン発現腫瘍における白血球サブセットの変化した表現 FACSデータはpDCのためのコントロール腫瘍対表現chemerin-でTILサブセット周波数のログ2比を経由して変換された解析し（形質DC、リニアのCD11c int型 B220 + PDCA1 +）、cDCを。 （DC従来;リン抗CD11c ハイ B220 - ）、CD4（CD3 + CD4 +）T細胞、CD8（CD3 + CD8 +）T細胞、全T細胞（CD3 + CD4 +およびCD3 + CD8 +）、NK細胞（CD3-NK1。 1+）、のCD11b（LIN-のCD11b +）単球/マクロファージ、MDSC（ミエロイド系のサプレッサー細胞; LIN-のCD11b + GR1 +）、およびCD19 + B細胞（CD3-CD19 +）。
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図4に記載されるようB16腫瘍において抑制白血球エフェクターの比率を変化した 17日目B16メラノーマ腫瘍をFACSによって分析した。個々の白血球サブセットのゲーティングによって同定した。 NKまたは各腫瘍型においてMDSCまたはpDCの総T細胞の割合を計算した。
。図5：ケマリン発現B16腫瘍 Controlまたはケマリン発現腫瘍で増加したエフェクター細胞を FACSによって分析した。合計10,000腫瘍細胞当たりTおよびNK細胞の絶対数は、FACSデータを用いて計算した。結果は、代表的な実験からのものである。
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Discussion
腫瘍微小環境の詳細な分析を実行するメカニズムおよび免疫調節の効果を決定する上で重要である。ヒト臨床分野における免疫療法の増加する存在と、腫瘍浸潤白血球上のこれらの薬剤の影響を理解することは、それらの作用メカニズムを定義するのに必要なになってきている。ヒトでは、しばしばこのように末梢免疫応答の分析を取得し、白血球サブセットの分析のために腫瘍組織を分析し、臨床および/またはロジスティックな困難が存在するが、しばしば行われる。動物モデルでの前臨床試験を実行すると、研究者は、より完全にこのように臨床転帰に影響を与える可能性のあるメカニズムへの追加的な洞察を与えて、腫瘍自体の中で免疫系に免疫調節剤の影響を探索することができます。
私たちの技術は腫瘍浸潤白血球の詳細な分析を可能にする。全体腫瘍微小環境ができるため、サンプリングされ、腫瘍内の免疫存在をよりグローバルな視野を評価することができる。そして、最終的には、プロ腫瘍サプレッサー細胞と抗腫瘍エフェクター細胞のバランスは、腫瘍増殖および臨床転帰4に大きな影響を持つことができる。したがって、このタイプの分析は、存在する特定の白血球サブセットについての詳細な情報を研究者に提供するのに有用である。この詳細データは、腫瘍内の免疫機構を解明するために他の機能のデータと組み合わせて使用することができる。
プロトコルの相対的な単純さは、一つのグループ内の変動を最小限にするために、腫瘍の大きなコホートを評価することを可能にする。イメージングのより典型的な流行の手法（IHCによって、または免疫蛍光のいずれか）と比較して、我々の技術は、マルチカラーフローサイトメトリーを利用して、非常に特定の白血球サブセットの同定を可能にする。 （周辺を含む）、腫瘍全体またはのセクションのどちらかをサンプリングする能力腫瘍はサンプリングと分析の観点から研究者追加の柔軟性を提供します。これはまた、このようにして、腫瘍の微小環境のより正確な画像を与えて、撮像することにより、複数の組織切片の解析によって得ることができるよりも、白血球に関するはるかに多くのデータの編集を可能にする。
我々は、広く腫瘍接種及び測定の相対的な容易さを与えられたマウスモデルで使用される皮下腫瘍、この技術を利用した。したがって、このプロトコルを使用した腫瘍モデルの可能性が高い大部分に適用可能であろう。しかし、この技術はまた、腫瘍切除のための追加のステップではあるが、同所性または自発的な腫瘍モデルから切除した腫瘍に適用することができる。 B16メラノーマは、単一細胞懸濁液を得るために酵素消化を必要としなかったと、このステップは、均一を得るために必要とされる他の腫瘍タイプ、代表単一細胞懸濁液があってもよい。その腫瘍sectiの画像化の利点もありますアドオンは、私たちの技術を用いて評価することができないことを得る。例えば、腫瘍微小環境内での白血球の局在化についての具体的なデータはIHC / IFを介して取得することができ、これは、多くの場合、FACS分析によって提供されるデータの価値のある補助することができる。
結論として、腫瘍微小環境内の白血球サブセットの評価のための私たちの技術は、研究者が比較的単純なプロトコルを使用して腫瘍内の免疫存在の詳細な分析を行うことができます。これは、マウス腫瘍モデルの大部分に適用することができ、腫瘍内に存在する白血球の種類、数、比率についての貴重な情報を解明するのに役立ちます。
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Acknowledgments
この作品は、助成金R01-CA169354によってサポートされていました とR01-047822 国立衛生研究所および退役軍人局（ECB）からの優秀賞から。 RKPは、NIH T32 CA009287-30A1、ASCO若手研究賞、カリフォルニア乳がん研究プロジェクトフェローシップ、および米国癌協会指導研究員助成によってサポートされていました。 BAZは、NIHの助成金AI079320によってサポートされていました。 JMは、NIHのT-32訓練助成金T32-AI07290- 25、T32-AI07290-24と米国癌協会ポスドクフェローシップPF-12-052-01-CSMから奨学金によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Cellgro | 10-040 | http://cellgro.com; keep on ice |
| FBS | Cellgro | 35-011-CV | http://cellgro.com |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | fischersci.com |
| 40 μm filter | Falcon | 08-771-1 | fischersci.com |
| 5 ml syringe | BD | 14-823-35 | fischersci.com |
| surgical scissors/forceps | Roboz | RS-5910 | roboz.com |
| PBS | Cellgro | MT-21-030-CM | http://cellgro.com; keep on ice |
| trypan blue | Cellgro | MT-25-900-CI | fischersci.com |
| hemacytometer | Hausser Scientifice | 02-671-54 | fischersci.com |
| Live/Dead stain | Life Technologies | L34957 | lieftechnologies.com |
| FlowJo software | TreeStar, Inc | flowjo.com |
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