Abstract
Spesialiserte immunceller som infiltrerer svulsten mikromiljøet regulerer vekst og overlevelse av neoplasi. Ondartede celler må unnvike eller grave anti-tumor immunresponser for å overleve og blomstre. Svulster dra nytte av en rekke forskjellige mekanismer for immun "escape", inkludert rekruttering av tolerogene DC, immunosuppressive regulatoriske T-celler (Tregs) og myeloide-avledede suppressor celler (MDSC) som hemmer cytotoksiske antitumorrespons. Omvendt, kan anti-tumor effektor immunceller bremse veksten og ekspansjonen av maligniteter: immunstimulerende dendrittceller, naturlige dreperceller som rommer iboende antitumorimmunitet og cytotoksiske T-celler som alle kan delta i tumor suppresjon. Balansen mellom pro- og anti-svulst leukocytter i siste instans bestemmer atferd og skjebne av transformerte celler; en rekke kliniske studier har båret ut dette. Således detaljert analyse av leukocytt-undersett innenforsvulsten mikromiljøet har blitt stadig viktigere. Her beskriver vi en fremgangsmåte for analyse av leukocytt-infiltrering undergrupper som er tilstede i tumoren mikromiljøet i en musetumormodell. Mus B16 melanom-tumorceller ble inokulert subkutant i C57BL / 6 mus. På et angitt tidspunkt, ble det svulster og omliggende hud resected en bloc og bearbeidet til en enkelt cellesuspensjoner, som så ble farget for multi-farge flowcytometri. Ved hjelp av en rekke leukocytt delsett markører, var vi i stand til å sammenligne de relative prosenter av infiltrerende leukocyttpopulasjoner undergrupper mellom kontroll og chemerin-uttrykke svulster. Etterforskerne kan bruke et slikt verktøy for å studere immun tilstedeværelse i svulstens mikromiljø og kombinert med tradisjonelle caliper størrelse målinger av tumorvekst, potensielt vil tillate dem å belyse virkningen av endringer i immun sammensetning på tumorvekst. En slik teknikk kan anvendes på en hvilken som helst tumormodell hvor tumoren og dens mikro cen bli resected og behandlet.
Introduction
Balansen mellom tumorvekst og fremme regresjon og er, delvis, avhengig av balansen av pro- og anti-tumor-infiltrerende leukocytter som er tilstede i mikromiljøet 1,2. For å studere tumormikromiljøet (TME) og spesifikt identifisere de infiltrerende leukocytt-subpopulasjoner, har vi utviklet en metode for evaluering av subkutane tumorer i en murin tumormodell. Betydningen av å studere tumormikromiljøet er vel kjent og støttes i litteraturen. Tallrike studier har vist at balansen mellom pro- og anti-tumor infiltrerer immunceller kan påvirke utfallet av tumorvekst, ikke bare i mus, men også studier på mennesker (anmeldt i 3,4). For eksempel Curiel et al., Viste at forverret kliniske resultater i eggstokkkreftpasienter ble korrelert med nærvær av økende prosentandeler av tumor-infiltrerende regulatoriske CD4 + T-celler (Tregs) 5. Vårt eget arbeid viste også effekten av et neiVEL leukocytt kjemotiltrekkende på forholdet mellom leukocytt-undersett i en musemelanommodellen 6, som også korrelert med reduserte tumorvekst. Dermed er de detaljerte analyser av leukocytter undergrupper innenfor en svulst nå mer bredt anerkjent og blir stadig viktigere.
Det er mange måter å vurdere svulstens mikromiljø for infiltrering leukocytter; for eksempel grupper har utviklet transgene mus for å uttrykke ulike fluorescerende proteiner i orden til bilde TME 7, klassisk immunhistokjemi og immunfluorescens av bevarte §§ 8, inkludert ulike bildediagnostikk som MR, PET, konfokalmikroskopi 9-11 - noen med evnen til å overvåke intravitally 10,12. Disse kan brukes med forskjellige molekylbilleddannende midler, så som nanopartikler 13 eller nye kontrastmidler 14 som merke immunceller. Vår fremgangsmåte er flowcytometri-tilnærming, og har flere fordeler.Først kan hele svulsten mikromiljøet tas prøver; ved analyse, er hele subkutan tumor og rundt periferien kirurgisk reseksjon for behandling. Dette eliminerer ethvert potensielt prøvetaking forspenning innenfor et enkelt tumor og gir en mer "global" analyse av tumor som en helhet. Dernest bruker flerfarget flowcytometri for å analysere leukocytter undergrupper lar oss mer spesifikt måle fenotype av infiltrere leukocytter. Avhengig av antallet farger som brukes, kan svært spesifikke delsett bli identifisert. Dette er viktig da det er flere leukocytter undergrupper innenfor en bestemt celletype - eller til og med i en generell subtype klassifisering - som har ulike funksjoner som er potensielt betydelig i å bestemme skjebnen til svulsten. For eksempel har plasmacytoid dendrittceller (PDC) er implisert i anti-tumor-immunitet 15. Imidlertid har CCR9 + delmengde av PDCs blitt vist å være tolerogene 16, og forskyve balanse av en slik undergruppe kan ha en innvirkning på tumorvekst.
Vår fremgangsmåte er egnet for subkutan eller andre tumorer som kan resected en bloc. I våre hender, ble svulster jevnt resekterte ved tidspunktet for avlivning. Imidlertid er det tenkelig, slik det er gjort i noen studier, som en subkutan tumor kan være fullt resected med lukning av den omkringliggende huden i en overlevelses kirurgi 17, og dermed tillater ytterligere evaluering av dyret. Analysen ble deretter utført på den resected tumor. Dermed er resultatene representerer en enkelt endepunktet i tumorutviklingen. Selv om dette gjør en detaljert titt inn i mikromiljøet, er det også et statisk bilde av hva som er uten tvil en dynamisk prosess. Imidlertid isolerte leukocytter (for eksempel via magnetisk separasjon eller densitetsgradient) kan deretter bli analysert separat fra tumor epitel og stroma, eller brukes i andre, funksjonelle analyser for ytterligere å definere deres fenotype, som har vært Previgere beskrevet 18. Denne metoden, da ville være nyttig for noen forskere som er interessert i å forstå sammensetningen av leukocytter i tumormikromiljøet på et gitt tidspunkt, enten i innstillingen av det naturlige sykdomsforløpet, eller etter et bestemt terapeutisk perturbasjon. Selv om det ikke er gjort av oss, variasjoner av denne fremgangsmåten kan også potensielt anvendes til å analysere bestemte deler av en tumor i isolasjon. For eksempel, gitt størrelsen av tumoren, omkretssonen (e) kan bli dissekert vekk fra den sentrale, eventuelt nekrotisk kjerne av tumoren til å gi forskeren en mer romlig atskilt riss av tumormikromiljøet.
I den voksende feltet av tumorimmunologi, vil det uten tvil være en eksponentielt voksende antall studier som evaluerer nye immunmodulerende midler i murine tumormodeller. Flere rapporter har fremhevet forskjellene i spesifikk leukocyttfunksjonen innenfor tumor mot det perifere nomiljø. For eksempel, Shafer-Weaver et al., Viste i en musemodell som antigen-spesifikke T-effektorceller CD8 + celler, mens aktiv i periferien, ble transformert inn i CD8 + T-suppressor-celler når de trafikkert inn i svulsten 19 mikromiljøet. Dette var delvis på grunn av TGFp, men andre faktorer er sannsynligvis involvert også. Således evaluere leukocytt-undersett - tall og prosenter, samt funksjonelle status - blir i løpet av selve svulsten gi en mer nøyaktig representasjon av effekten av et bestemt immunmodulering på tumor skjebne.
Vår teknikk tillater detaljert analyse av tumoren, og gir forskeren en mulighet til nærmere å identifisere endringer i leukocytt-populasjoner enn tidligere tilnærminger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle dyreforsøk ble gjennomført i samsvar med godkjent Stanford, Palo Alto VA HCS, og National Institutes of Health Institutional AnimalCare og bruk komité retningslinjer.
1. Klargjøring til Prøvetaking og Processing (Nødvendig tid: ~ 10-15 min)
- Inokuler murine B16F0 melanom-celler (0,5-1 x 10 6) subkutant ved eller nær midtlinjen av abdomen i hunn C57BL / 6-mus som tidligere beskrevet seks. Alternativt vaksinere kreftceller på flere anatomiske områder (f.eks flanke, melkefettpute, etc).
MERK: Et ubegrenset antall svulster (implantert eller spontan) kan brukes og evalueres ved hjelp av denne protokollen. For eksempel, andre vanlige syngeniske tumor i C57BL / 6 omfatter kolon linje MC38, Lewis lungekarsinom (LLC), og prostata TRAMP-C2 linje. Mens humane xenografter inokulert i immundefekte mus kan også evalueres på denne måte, bør det bemerkes at profiles av tumor-infiltrerende leukocytter vil nødvendigvis bli endret i samsvar med immunsvikt tilstanden i vertmusen.- Bruk komplett media (f.eks RPMI inneholder 10% FBS og tilsetningsstoffer) eller en annen passende proteinholdig buffer (f.eks HBSS eller PBS + 1% FBS eller 1% BCS). Chill media eller buffer til 4 ° C før euthanization.
- Satt opp samling rør og filtre for resected svulster; plassere disse på is.
- Bruk en 50 ml konisk rør per svulst som skal resected. Sett en 40-70 mikrometer cellesuspensjon filter i hver enkelt. Alternativt kan du bruke 15 ml koniske rør med metall filter mesh. Bruke en 5 ml sprøyte stempelet eller tykk penn for å lage en koppformet filter på toppen av 15 ml tube.
- Forberede instrumenter for reseksjon og svulst behandlingen; bruke kirurgisk pinsett og fine saks til resect og prosess svulster. Bruk 70% etanol for å rengjøre instrumenter mellom resections / tumorprøver. For større antall of prøver (f.eks> 10), anbefaler vi samtidig behandling av prøvene av flere forskere for å unngå betydelige forskjeller i saksbehandlingstid mellom tumorprøver.
2. tumorreseksjon (Nødvendig tid: ~ 5 min / svulst)
- Avlive B16 tumorbærende mus individuelt ved hjelp av karbondioksid eller annen godkjent metode.
- Fest musen på en kirurgisk scene. Spray tumorområdet med 70% etanol og tørk overskudd av; Dette bidrar til å hindre spredning av noen hår stede. For ikke-nakne mus, barbering hudområdet rundt tumoren før fjerning etter behov.
- Bruk pinsett og saks, resect subkutan tumor en bloc, inkludert liggende og huden rundt. Mengden av "margin" hud tatt kan varieres, men vanligvis resect 2-3 mm fra huden rundt tumoren.
- Veie resected svulster (+/- omliggende hud) på dette punktet. Plasser den resekterte hud / tumor seksjon i filteret festet inne i plastic konisk tube.
3. Forberede en enkelt celle Tumor Suspension (Nødvendig tid: ~ 5-7 min / svulst)
- Bruk pinsett og saks for å hakke svulst og overliggende / omkringliggende hud. Hakke prøven ved hjelp av en saks inntil alle store deler av vevet blir prosessert til 1-2 mm seksjoner.
MERK: Vanligvis er hele svulster behandlet; Alternativt, for større svulster, representative deler av tumorer kan bli hakket og behandlet. - Ved hjelp av et stempel fra en engangs 5 eller 10 ml sprøyte, mekanisk disaggregert hakket tumorvev mot sikret filteret.
- Ved hjelp av en pipette, vaske behandlet svulstvev med 5-10 ml kald media eller buffer. Dette vil skylle de enkeltceller gjennom filteret.
- Gjenta de to ovennevnte trinn flere ganger, slik at det totale antall og volum av vaskevæskene er omtrent den samme for like store tumorer.
- Etter vasking av den behandlede tumorvevet, observeresmå fragmenter av huden og / eller annet bindevev skal bli liggende igjen i filteret.
- Alternativt, for svulster der mekanisk disaggregering alene ikke kan være tilstrekkelig, fordøyelse med collagenase og / eller andre enzymer kan utføres før hakking prosedyre. Dette vil gi rom for en mer grundig enkelt celle suspensjon. Imidlertid bør det bemerkes at slike fordøyelsen protokoller kan påvirke overflateantigen uttrykk 20, så du må være varsom med å tolke disse resultatene.
- Vask og pelletere cellene ved tilsetning av media / buffer og sentrifugering ved 4 ° C 500 x g i 5 min.
4. FACS Farging av enkeltcelle Suspension (Nødvendig tid: ~ 30-60 min)
- Resuspender celler i iskald FACS-buffer (PBS + 1% FBS).
- Telle levedyktige celler ved hjelp trypanblått og en hemacytometer, eller automatisert celleteller.
- Bestem total levedyktig celle yield per volum. Denne informasjonen kan brukes til å ekstrapolereabsolutte tall av tumor infiltrerende leukocytter i kombinasjon med FACS data.
- Bestemme antall celler for å være farget og analysert ved FACS. Dette vil bli påvirket av flere faktorer (f.eks tumorhistologi typen, svulst alder og størrelse, gjennomsnittlig prosent av infiltrere leukocytter, etc.).
MERK: I B16 melanom, fant vi en lav prosentandel av tumor infiltrere leukocytter (TIL, vanligvis <5%) i forhold til kreftceller. Således ble minst 1 x 10 6 total tumor (tumor + infiltrerende leukocytter) celler typisk oppsamlet via FACS for analyse.- Bruke trypan-farget telle data, beregnet volum av celler til å være farget for FACS. For eksempel, hvis TIL utgjør vanligvis 5% av det totale tumorceller (mange av tumorceller vil være død på trypan flekk), faktor dette inn i det totale antall tumor enkelt cellesuspensjon for å være farget.
- For mindre vanlige leukocytter undergrupper f.eks CCR9 + PDC) bruke et større antall totale kreftceller (for eksempel 2 til 3 x 10 6) for FACS farging, gitt relativ lav frekvens av disse cellene i enkeltcellesuspensjon.
- Flekk svulsten enkelt celle suspensjon for FACS.
- For live / dead diskriminering, bruk en fixable beis eller ikke-fixable flekk (f.eks propidiumjodid) kan brukes. Hvis celle er farget uten levende / død diskriminering, må forsiktighet utvises gitt potensialet for ikke-spesifikk binding av antistoffer.
- Flekk cellesuspensjonen for spesifikke leukocytt-undersett ved hjelp av en standard FACS farging protokoll. Blokk-celler for å redusere ikke-spesifikk antistoffbinding med PBS / FBS inneholdende 1% rotteserum og Fc blokk (anti-CD16 / 32) i 10 minutter før farging med antigen-spesifikke antistoffer. Inkludere de riktige isotypekontrollantistoffer å sikre farging er bestemt.
- Ved dette punkt, etter FACS farging er fullført, løse prøver med 4% formaldehyd eller andre lignende fikseringsmiddel. Oppbevar prøver ved 4 ° C i dark (som å unngå slukking av fluoroforene) inntil tidspunktet for innsamling og analyse.
MERK: Lagring av faste prøver over lengre tid kan føre til endring i signal og intensitet av fluoroforene 21. - Samle prøvene på en strømningscytometer. Optimal strømningscytometer innstillingene vil variere avhengig av type instrument og laser / detektor oppsett.
NB: I tillegg kan det være variasjoner mellom eksperimenter, selv om bruk av samme maskin. Dermed utføre passende maskin oppsett (f.eks ved hjelp av perler kalibrering) for å sikre passende kompensasjon innstilling før FACS innsamling og analyse av hvert forsøk.
- Analyse av leukoctye undergrupper
- Hjelp FACS dataanalyse programvare, for å analysere dataene. For en live / dead flekken, start ved gating ut døde celler. Bruk antistoff mot et leukocytt spesifikk markør (for eksempel anti-CD45) for å identifisere leukocytter i de levende celler.
- Etter dette, bruke ulike gating ordninger for å identifisere spesifikke undergrupper, avhengig av farging protokollen. For eksempel, for å identifisere CD4 + T-celler, velger SSC lo regionen fra CD45 + befolkningen og velg CD19-CD3 + celler; fra dette CD4 + T-celler kan bli identifisert 22.
- Analysere data og presentere det på en rekke forskjellige måter å sikre konsistens og identifisere mønstre eller trender (dvs. bruke totale tall, prosenter, eller forholdstall for å kvantifisere undergrupper).
MERK: For eksempel har vi sett på total levende CD45 + celler i prosent av totale kreftceller samlet (Figur 1). I tillegg har vi deretter beregnes den prosentandel av hver leukocytt-undergruppe (f.eks CD4 + T-celler) i tumoren, og sammenlignet disse som forholdstall mellom kontroll- og testgrupper (figur 3).
- Hjelp FACS dataanalyse programvare, for å analysere dataene. For en live / dead flekken, start ved gating ut døde celler. Bruk antistoff mot et leukocytt spesifikk markør (for eksempel anti-CD45) for å identifisere leukocytter i de levende celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Våre resultater viste at tvunget over-ekspresjon av chemerin i murine B16 tumorer utvidet prosentandelen av tumor infiltrerende leukocytter (Tīlss). I tillegg ble forandringer i den relative forhold av leukocytt-undersett som er representert innenfor tumormikro forbundet med chemerin ekspresjon identifisert. Re-skrive ut med tillatelse fra Pachynski et al. 6.
Figur 1 viser at det var en betydelig økning i totale CD45 + celler (Tīlss) innen i svulstene som uttrykt chemerin sammenlignet med kontroller, som bestemmes av FACS analyse av resected dag 17 svulster. Ved hjelp av farget, cryosectioned B16 svulster, økningen i infiltrere CD45 + celler ved immunfluorescens av svulster ble bekreftet (figur 2).
Videre analyse av FACS data viser en relativ økning i gjennomsnitt av NK-celler, T-celler, og konvensjonelle DC (Lin-B220- CD11c +) i de tumorer hvor Chemerin var over-uttrykkes i forhold til kontroll tumorer (figur 3). Det var en relativ reduksjon i prosentandelene av leukocytt-undersett som har en rolle i å undertrykke eller kan undertrykke immunreaksjoner, spesielt myelogen-avledet suppressorceller (Lin-CD11b + GR1 +) og PDC (karmene B220 + CD11c int PDCA1 +) 16,23 .
Et økende antall studier har vist at forholdet mellom leukocytter undergrupper innenfor svulstens mikromiljø for å være en viktig faktor, både i form av tumorvekst og kliniske utfall 4,24,25. Vår FACS data ble ytterligere analysert for å vise antall av T-celler (totalt CD3 +) og NK-celler pr tumorcelle; disse celletyper ble i økende grad representert i chemerin-uttrykkende tumorer sammenlignet med kontroller (figur 4).
En direkte sammenligning av effektor (dvs. NK og T-celler) og suppressor celle (dvs. MDSC og PDC) populasjoner innenfor svulsten microenviron ment for både tumor gruppene ble deretter utført. Figur 5 viser signifikante økninger i forholdene mellom effektor til suppressor-cellepopulasjoner innenfor chemerin-uttrykkende tumorer, sammenlignet med kontrollene.
Totalt sett er representative resultatene viser effektene av chemerin uttrykk innen svulsten mikromiljøet på leukocytter delsett populasjoner, og den gunstige forvrenger av disse populasjonene og forhold i en måte som er forenlig med den kliniske fordelen sett.
. Figur 1: økt tumor infiltrerende leukocytter i chemerin-uttrykkende tumorer tumorer skåret ut fra chemerin-uttrykk vs kontroll på dag 17 ble analysert for CD45 + leukocyttinfiltrering (% levedyktige celler) ved flow-cytometri; * P <0,05 ved to-halet Student t-test som viser middelverdi ± SEM av med 4 eller flere mus per gruppe.
2 "src =" / files / ftp_upload / 52657 / 52657fig2.jpg "/>
. Figur 2: Imaging av B16 melanom TIL Immunfluorescens bilder illustrere CD45 + celleinfiltrater (hvite piler) i kontroll og chemerin-uttrykke melanomer skåret på dag 9; strek representerer 25 mikrometer.
. Figur 3: Endret representasjon av leukocytter undergrupper i chemerin-uttrykke svulster FACS analyserer dataene ble konvertert via log 2 forholdet mellom TIL undergruppe frekvens i chemerin- uttrykker vs kontrolltumorer for PDC (plasmacytoid DC, karmene CD11c int B220 + PDCA1 +), CDC (konvensjonelle DC; Lin-CD11c hi B220-), CD4 (CD3 + CD4 +) T-celler, CD8 (CD3 + CD8 +) T-celler, samlede T-celler (CD3 + CD4 + og CD3 + CD8 +), NK-celler (CD3-NK1. 1+), CD11b (Lin-CD11b +) monocytt / makrofager, MDSC (myeloide avledet suppressorceller; Lin-CD11b + GR1 +), og CD19 + B-celler (CD3-CD19 +).
gur 4 "src =" / files / ftp_upload / 52657 / 52657fig4.jpg "/>
Fig. 4: Altered forhold mellom effektor og suppressor leukocytter i B16 tumor Dag 17 B16 melanom tumorer ble analysert ved FACS som beskrevet. Individuelle leukocytt-undersett ble identifisert ved gating. Forholdet mellom NK eller totale T-celler til MDSC eller PDC i hver tumortype ble deretter beregnet.
Figur 5:. Økt effektorceller i chemerin-uttrykke B16 svulster Kontroll eller chemerin-uttrykke svulster ble analysert ved FACS. Absolutte tall av T- og NK-celler pr 10000 totale tumorceller ble beregnet ved hjelp av FACS data. Resultatene er fra et representativt eksperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utføre detaljert analyse av svulsten mikromiljøet er avgjørende for å fastslå hvilke mekanismer og effekter av immunmodulering. Med den økende tilstedeværelsen av immunotherapeutics i den humane kliniske riket, forstå virkningen av disse midlene på tumor infiltrere leukocytter blir nødvendig å definere sin virkningsmekanisme. Hos mennesker er det ofte foreligge kliniske og / eller logistiske vanskeligheter med å fremskaffe og analysere tumorvev for leukocytt-undergruppe analyse, og dermed analyse av perifert immunresponsen ofte utføres. Utføre prekliniske studier i dyremodeller tillater forskeren å fullt utforske virkningen av immunmodulerende midler på immunsystemet innenfor selve svulsten, og dermed gi ytterligere innsikt i mekanismene som kan påvirke kliniske utfall.
Vår teknikk tillater detaljert analyse av tumor-infiltrerende leukocytter. Fordi hele svulsten mikromiljøet kanprøves, kan et mer globalt perspektiv på immun tilstedeværelse innen svulst vurderes. Og, til slutt, kan balansen av pro-tumorsupressorproteinene celler og anti-svulst effektorcellene ha en betydelig innvirkning på tumorvekst og kliniske resultater 4. Dermed er denne type analyse verdifulle i å gi forskeren med detaljert informasjon om de konkrete leukocyttpopulasjoner undergrupper stede. Denne detaljerte data kan benyttes i kombinasjon med andre funksjonelle data for ytterligere å belyse immunmekanismer i tumoren.
Den relative enkelhet av protokollen tillater en å vurdere større kullene av tumorer for å minimalisere variasjonen innen gruppene. Sammenlignet med de mer typiske og utbredt metode for avbildning (enten ved IHC eller immunfluorescens), tillater vår teknikk identifiseringen av svært spesifikke leukocytt-undersett ved å utnytte flerfarge flowcytometri. Evnen til å prøve enten hele tumoren (inkludert omkrets) eller en del avsvulsten gir forskeren ekstra fleksibilitet i forhold til prøvetaking og analyse. Dette gjør også at samling av betydelig mer data om leukocytter enn det som kunne oppnås ved analyse av flere vevssnitt av bildebehandling, og dermed gi et mer nøyaktig bilde av svulsten mikromiljøet.
Vi utnyttet denne teknikken på subkutane svulster, som er mye brukt i musemodeller gitt relativ enkel tumorinokulasjon og målinger. Dermed vil denne protokollen være aktuelt for sannsynlig et flertall av tumormodellene anvendt. Imidlertid kan den teknikk som også anvendes på tumorer resected fra ortotopiske eller spontane tumormodeller, men med ytterligere trinn for tumor reseksjon. Og mens B16 melanom ikke krever enzymbehandling for å oppnå en enkel cellesuspensjon, kan det være andre tumortyper, hvor dette trinnet er nødvendig for å oppnå en jevn, representative enkel cellesuspensjon. Det er også fordeler som avbildning av tumor sections gir som ikke kan vurderes med vår teknikk. For eksempel kan mer spesifikke data om leukocytt lokalisering i svulstens mikromiljø fås gjennom IHC / IF, og dette kan ofte være et verdifullt supplement til de data levert av FACS analyse.
Som konklusjon, vår teknikk for vurdering av leukocytt-undersett innenfor tumormikromiljøet tillater forskeren til å utføre detaljerte analyser av immun tilstedeværelse innenfor en tumor ved hjelp av en relativt enkel protokoll. Det kan påføres på et flertall av musetumormodeller, og kan bidra til å belyse verdifull informasjon om leukocytt type, antall og prosenter er tilstede i tumoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd R01-CA169354 og R01-047822 fra National Institutes of Health og en Merit Award fra Department of Veterans Affairs (ECB). RKP ble støttet av NIH T32 CA009287-30A1, en ASCO Young Investigator Award, California Breast Cancer Research Project Fellowship, og en American Cancer Society mentor Forskningsstipendiat Grant; BAZ ble støttet av NIH stipend AI079320. JM ble støttet av stipend fra NIH T-32 trening stipend T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 og American Cancer Society post-doc PF-12-052-01-CSM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Cellgro | 10-040 | http://cellgro.com; keep on ice |
| FBS | Cellgro | 35-011-CV | http://cellgro.com |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | fischersci.com |
| 40 μm filter | Falcon | 08-771-1 | fischersci.com |
| 5 ml syringe | BD | 14-823-35 | fischersci.com |
| surgical scissors/forceps | Roboz | RS-5910 | roboz.com |
| PBS | Cellgro | MT-21-030-CM | http://cellgro.com; keep on ice |
| trypan blue | Cellgro | MT-25-900-CI | fischersci.com |
| hemacytometer | Hausser Scientifice | 02-671-54 | fischersci.com |
| Live/Dead stain | Life Technologies | L34957 | lieftechnologies.com |
| FlowJo software | TreeStar, Inc | flowjo.com |
References
- Mantovani, A., et al. Chemokines in the recruitment and shaping of the leukocyte infiltrate of tumors. Semin Cancer Biol. 14 (3), 155-160 (2004).
- Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat Rev Immunol. 6 (10), 715-727 (2006).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
- Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).
- Pachynski, R. K., et al. The chemoattractant chemerin suppresses melanoma by recruiting natural killer cell antitumor defenses. J Exp Med. 209 (8), 1427-1435 (2012).
- Hoffman, R. M. Transgenic nude mice ubiquitously expressing fluorescent proteins for color-coded imaging of the tumor microenvironment. Methods Mol Biol. 1194, 353-365 (2014).
- Mansfield, J. R. Imaging in cancer immunology:phenotyping immune cell subsets in situ in FFPE tissue sections. MLO Med Lab Obs. 46 (6), 12-13 (2014).
- Serres, S., O'Brien, E. R., Sibson, N. R. Imaging angiogenesis, inflammation, and metastasis in the tumor microenvironment with magnetic resonance imaging. Adv Exp Med Biol. 772, 263-283 (2014).
- Schietinger, A., et al. Longitudinal confocal microscopy imaging of solid tumor destruction following adoptive T cell transfer. Oncoimmunology. 2 (11), e26677 (2013).
- Singh, A. S., Radu, C. G., Ribas, A. P. E. T. imaging of the immune system: immune monitoring at the whole body level. Q J Nucl Med Mol Imaging. 54 (3), 281-290 (2010).
- Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135 (2013).
- Habibollahi, P., et al. Fluorescent nanoparticle imaging allows noninvasive evaluation of immune cell modulation in esophageal dysplasia. Mol Imaging. 13 (3), 1-11 (2014).
- Balducci, A., et al. A novel probe for the non-invasive detection of tumor-associated inflammation. Oncoimmunology. 2 (2), e23034 (2013).
- Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J Clin Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
- Hadeiba, H., et al. CCR9 expression defines tolerogenic plasmacytoid dendritic cells able to suppress acute graft-versus-host disease. Nat Immunol. 9 (11), 1253-1260 (2008).
- McLean, M., et al. A BALB/c murine lung alveolar carcinoma used to establish a surgical spontaneous metastasis model. Clin Exp Metastasis. 21 (4), 363-369 (2004).
- Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of immune cells from primary tumors. J Vis Exp. (64), e3952 (2012).
- Shafer-Weaver, K. A., et al. Cutting Edge: Tumor-specific CD8+ T cells infiltrating prostatic tumors are induced to become suppressor cells. J Immunol. 183 (8), 4848-4852 (2009).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry A. 71 (6), 379-385 (2007).
- Hackstein, H., et al. Heterogeneity of respiratory dendritic cell subsets and lymphocyte populations in inbred mouse strains. Respir Res. 13, 94 (2012).
- Ostrand-Rosenberg, S. Myeloid-derived suppressor cells: more mechanisms for inhibiting antitumor immunity. Cancer Immunol Immunother. 59 (10), 1593-1600 (2010).
- Curran, M. A., Montalvo, W., Yagita, H., Allison, J. P. PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4275-4280 (2010).
- Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion. Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).
