Abstract
Tümör mikro sızmak İhtisas bağışıklık hücreleri neoplazi büyümesini ve hayatta kalmasını düzenler. Malign hücreler sıyrılmak veya hayatta ve gelişmek için anti-tümör immün yanıtları yıkmak gerekir. Tümörler tolerojenik DC işe, immunsupresif düzenleyici T hücreleri (Tregs), ve sitotoksik anti-tümör yanıtları inhibe miyeloid türetilmiş baskılayıcı hücreler (MDSC) gibi bağışıklık farklı mekanizmaları bir dizi "kaçış" yararlanmak. Tümör baskılamasında katılabilir bütün immünostimülatör dendritik hücreler, doğal bir anti-tümör bağışıklık liman doğal katil hücreler ve sitotoksik T hücreleri: Bunun aksine, anti-tümör efektör bağışıklık hücreleri habis büyüme ve genişleme yavaşlatabilir. pro- ve anti-tümör lökositlerin arasındaki denge sonuçta davranış ve transforme edilmiş hücrelerin kaderini belirler; insan klinik çalışmalarda çok sayıda bu karşılanır var. Lökosit alt kümelerinin Böylece, detaylı analiz içindetümör mikro giderek daha önemli hale gelmiştir. Burada, bir fare tümör modelinde tümör mikro-ortamında mevcut infiltratif lökosit subsetleri analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Fare B 16 melanoma tümör hücreleri, C57BL / 6 farelerine deri altından aşılandı. Belirli bir zamanda, tümörler ve çevredeki cilt blok halinde çıkarıldı ve daha sonra akış sitometrisi çok renkli boyandı tek hücre süspansiyonları içine işlenir. Lökosit alt kümesi belirteçleri çeşitli kullanarak, kontrol ve chemerin-ifade tümörler arasında lökosit alt kümelerini infiltre göreli yüzdelerini karşılaştırmak başardık. Araştırmacılar, bağışıklık tümörün mikro-ortamı varlığı ve tümör büyümesinin geleneksel kalınlığı boyutu ölçümleri ile bir araya getirildiğinde, potansiyel olarak bunları, tümör büyümesi üzerinde immün bileşim içinde değişikliklerin etkisini açıklamak sağlayacak çalışma için böyle bir araç kullanılabilir. Böyle bir teknik, herhangi bir tümör modeli tatbik edilebilir olduğu tümör ve mikro-ortam CBir rezeke ve işlenebilir.
Introduction
tümör büyümesi ve teşvik ve regresyon arasındaki denge, kısmen, mikro-1,2 bulunan pro- ve anti-tümör infiltre eden lökositlerin dengesine bağlıdır. (TME) tümör mikro çalışma ve özellikle infiltratif lökosit alt-popülasyonunu tespit etmek amacıyla, bir fare tümör modelinde deri altı tümörleri değerlendirilmesi için bir yöntem geliştirdi. tümör mikro okuyan önemi de bilinen ve literatürde desteklenmemektedir. Çok sayıda çalışma, pro- ve anti-tümör infiltre eden bağışıklık hücrelerinin dengesini farede değil, aynı zamanda (3,4 gözden) insan üzerinde çalışmalar sadece tümör büyüme sonuçlarını etkileyebilir göstermiştir. Örneğin, Curiel ve diğ., Yumurtalık kanseri hastalarında klinik sonuçlar, tümör-süzücü düzenleyici CD4 + T hücreleri (Tregs) 5 oranları artırmak varlığı ile korelasyon kötüleştiğini göstermiştir. Kendi çalışmaları da bir hiçbir yerde etkisini gösterdiAyrıca korelasyon fare melanom modelinde 6, lökosit alt grupları oranına vel lökosit kemoatraktan tümör büyümesini azalmıştır. Böylece, bir tümör içindeki lökosit alt gruplarının detaylı analizler artık daha geniş tanınır ve giderek daha önemli.
Lökositler infiltratif tümör mikroçevresinin değerlendirmek için birçok yolu vardır; yeteneği ile bazı - örneğin gruplar görüntünün TME 7, klasik immünohistokimyasal ve MR, PET, konfokal mikroskopi 9-11 gibi çeşitli görüntüleme yöntemleri de dahil olmak üzere korunmuş bölümlerin 8, immünofloresan amacıyla çeşitli floresan proteinleri ifade transgenik fareler tasarladık intravitally 10,12 monitör. Bu tür nano partiküller 13 veya yeni kontrast maddeler, bağışıklık hücreleri etiketlemek 14 gibi çeşitli moleküler görüntüleme maddeleri ile birlikte de kullanılabilir. Önerilen yöntem, bir akış sitometrisi dayalı bir yaklaşım ve birçok avantajı vardır.İlk olarak, tüm tümör mikro örnek olabilir; analiz sırasında, tüm deri altı tümör ve çevresindeki çevre cerrahi işlem için rezeke edilir. Bu, tek bir tümör içinde herhangi bir potansiyel örnekleme yanlılığı ortadan kaldırır ve bir bütün olarak tümörün bir daha "küresel" analizi verir. İkincisi, lökosit alt kümelerini analiz etmek sitometri renkli akışını kullanarak daha özel infiltre lökositlerin fenotip ölçmek için bize izin verir. Renklerin sayısına bağlı olarak, çok özel alt-gruplar belirlenebilir. Hatta genel alt tipi sınıflandırma - - tümör kaderini belirlemede potansiyel olarak önemli olan farklı işlevlere sahip birkaç lökosit belirli bir hücre türü içinde alt kümeleri olarak orada bu önemlidir. Örneğin, plazmasitoid dendritik hücreler (PDC) anti-tümör bağışıklık 15 implike edilmiştir. Ancak, pDC'lerde ve CCR9 + alt kümesi tolerojenik 16 olduğu gösterilmiştir, ve ba değişen olmuşturBöyle bir alt kümesi mızrak tümör büyümesi üzerinde bir etkisi olabilir.
Bizim yöntem subkutan veya en blok rezeksiyon edilebilecek diğer tümörler için uygundur. Bizim ellerde, tümörler eşit ötenazi sırasında rezeke edildi. Bazı çalışmalarda yapılmıştır Ancak, bu, deri altı tümör tam böylece hayvan ek olarak değerlendirilmesine imkan veren, bir hayatta kalma cerrahi 17 çevreleyen derinin kapatılması ile çıkarıldı olabilir ki, düşünülebilir. Analize daha sonra kesilen tümörün gerçekleştirilir. Böylece, sonuç tümörün gelişiminde tek bir zaman noktası temsil eder. Bu mikro içine ayrıntılı bir görünüm sağlar, aynı zamanda şüphesiz dinamik bir süreçtir ne statik resim. Bununla birlikte, izole edilmiş bir lökosit (örneğin bir manyetik ayırma veya yoğunluk gradyanı) PREVI olduğu gibi, daha sonra tümör epitel ve stromadan ayrı ayrı analiz, ya da daha da fenotipi belirlemek için diğer işlevsel tahlillerde kullanılabilirously 18 tanımladı. Bu yöntem, daha sonra, doğal hastalık tabii ortamda veya belirli bir terapötik bozulduktan sonra olsun, belirli bir zaman noktasında tümörün mikro olan lökositlerin bileşimin anlamaya yönelik bir araştırmacı için yararlı olacaktır. Tarafımızdan yapılan olmasa da, bu prosedürün varyasyonları da potansiyel olarak izole bir tümör spesifik kısımları analiz etmek için kullanılabilir. Örneğin, tümörün büyüklüğü göz önüne alındığında, periferik zon (ler) araştırmacıya tümör mikro bir daha uzamsal ayrılmış bir görünüm vermek için uzak tümörün merkez, muhtemelen nekrotik çekirdek disseke edilebilir.
Tümör immünoloji alanında gelişen, hiç şüphesiz fare tümör modellerinde yeni bağışıklık maddeleri değerlendiren çalışmaların bir katlanarak artan sayıda olacak. Çeşitli raporlar, periferik tr karşı tümörün içinde belirli lökosit fonksiyon farklılıkları sermiştirçevre ve do¤a. Örneğin, Shafer-Weaver ve ark., Tümör mikro-19 kaçırılan sonra antijene spesifik efektör T CD8 + hücreleri, çevre aktif iken, CD8 + T baskılayıcı hücrelerine transforme edildi, bir fare modelinde saptandı. Bu TGFβ nedeniyle kısmen oldu, ama diğer faktörler muhtemelen de katılıyor. Böylece, lökosit alt kümelerini değerlendirilmesi - sayılar ve oranlar, yanı sıra fonksiyonel durumunu - tümörün kendisi içinde tümör kaderi belirli bir immünomodülasyon etkisinin daha doğru bir temsilini verecek.
Bizim teknik tümörün detaylı analiz sağlar ve araştırmacıya daha yakından önceki yaklaşımlara göre lökosit popülasyonlarının değişiklikleri tanımlamak için bir fırsat sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Tüm hayvan deneyleri onaylı Stanford, Palo Alto, VA HCS ve Sağlık Kurumsal AnimalCare ve Kullanım Komitesi kurallar National Institutes göre yapılmıştır.
1. Örnek Toplama ve İşleme Hazırlanma (Zaman Gerekli: ~ 10-15 dk)
- Daha önce tarif edildiği gibi 6 faregiller B16F0 melanoma hücrelerinin deri altından ya da dişi C57BL / 6 farelerinde karın orta hattı yakınında (0.5-1 x 10 6) inoküle. Seçenek olarak ise, (örneğin, yan, meme yağ pedi, vs) ilave anatomik bölgelerde tümör hücrelerini aşılamak.
NOT: tümörlerin Herhangi bir sayıda (implante veya spontan) Bu protokolü kullanarak kullanılan ve değerlendirilebilir. Örneğin, diğer yaygın / 6 kolon hattı MC38, Lewis Akciğer Karsinomu (LLC), ve prostat TRAMP-C2 hattı dahil C57BL singenik tümörleri kullanılır. Bağışıklık yetersizliği olan farelere aşılandı insan ksenogrefleri da bu şekilde değerlendirilebilir iken, s unutulmamalıdırTümör infiltre lökositlerin rofiles mutlaka ev sahibi fare bağışıklık eksikliği durumuna göre değişmiş olacaktır.- Tam bir ortam (örneğin, RPMI,% 10 FBS ve katkı maddeleri ihtiva eden) ya da diğer uygun bir protein içeren bir tampon (örneğin, HBSS ve PBS +% 1 FBS ve% 1 BCS) kullanın. Ortam soğuk ya da önceden euthanization 4 ° C'ye kadar tampon.
- Rezeksiyon tümörler için toplama tüpleri ve filtreler ayarlayın; Buz üzerinde, bu yerleştirin.
- Tümör başına bir 50 ml konik tüp kullanın rezeke edilecek. Her birinde bir 40-70 mikron hücre süspansiyonu filtre takın. Alternatif olarak, metal filtre örgü ile 15 ml konik tüpler kullanın. 15 ml tüp en az bir kupa şekilli filtre oluşturmak için 5 ml'lik bir şırınga pistonu veya kalın kalem kullanın.
- Rezeksiyon ve tümör işleme aletleri hazırlayın; Cerrahi forseps ve rezeke ince makas ve süreç tümörleri kullanın. Rezeksiyon / tümör örneklerinin arasında aletleri temizlemek için% 70 etanol kullanın. Daha fazla sayıda o içinf örnekleri (örneğin> 10), biz tümör örnekleri arasındaki işlem süresi önemli farklılıklar önlemek için birden araştırmacılar tarafından örneklerin aynı anda işleme öneririz.
2. Tümör Rezeksiyon (Gerekli Zaman: ~ 5 dk / tümör)
- Ayrı ayrı karbon dioksit ya da başka uygun yöntem kullanılarak, B16 tümör taşıyan fareler öldürülür.
- Bir cerrahi sahnede fareyi sabitleyin. % 70 etanol ile tümör alanı Sprey ve aşırı kapalı silin; Bu herhangi bir saç mevcut yayılmasını önlemeye yardımcı olur. Gerektiği gibi olmayan çıplak fareler için, rezeksiyon öncesi tümör çevresindeki deri alanını tıraş.
- Forseps ve makas kullanarak, üstünde uzanan dahil ve cilt çevreleyen, en blok deri altı tümör rezeksiyonu. alınan "margin" deri miktarı değişiyordu, ama genellikle tümörün çevresindeki derinin 2-3 mm rezeke edilebilir.
- Bu noktada rezeke tümörleri (+/- çevreleyen deri) tartılır. Pl içinde güvenli filtre rezeke cilt / tümör bölümünü yerleştirinastic konik boru.
3. Tek Hücreli Tümör Süspansiyon Hazırlamak (Gerekli Zaman: ~ 5-7 dak / tümör)
- Kullanım forseps ve makas tümör ve örten / çevreleyen deriyi kıymaya. Doku tüm büyük bölümleri 1-2 mm'lik bölüme işlenir kadar makas kullanarak örnek kıyma.
NOT: Genellikle, bütün tümörler işlenir; Seçenek olarak ise, daha büyük tümörler için tümör temsili bölümleri kıyılmış ve işlenebilir. - Bir tek 5 veya 10 ml şırınga bir dalgıç kullanarak, mekanik güvenli filtre karşı kıyılmış tümör dokusu parçalara ayırma.
- Bir pipet kullanarak, soğuk ortam veya tampon 5-10 ml ile işlenmiş tümör dokusu yıkayın. Bu filtre sayesinde tek hücre floş olacaktır.
- Toplam sayısı ve yıkama hacimleri yaklaşık benzer büyüklükteki tümörlerde aynı olmasını sağlayarak, yukarıdaki iki adımları birkaç kez tekrarlayın.
- Işlenmiş tümör dokusu yıkadıktan sonra, gözlemlemekderi ve / veya bunlarla ilgili başka dokuların küçük fragmanları filtrede kalan edilmelidir.
- Seçenek olarak ise, kolajenaz ve / veya diğer enzimler ile sadece mekanik parçalanma yeterli olmayabilir tümörler, sindirim için önceden kıyma edilen prosedüre göre gerçekleştirilebilir. Bu, daha ayrıntılı bir tek hücre süspansiyonu için izin verir. Bununla birlikte, bu sindirim protokolleri yüzey antijeni ifade 20 etkiler, böylece dikkatli bu sonuçlara alınması gerektiği not edilmelidir.
- Yıkama ve tampon / ortam ilave edildikten ve 5 dakika boyunca 4 ° C'de 500 x g'de santrifüj ile pelet hücreleri.
Tek Hücre Süspansiyon 4. FACS Boyama (Gerekli Zaman: ~ 30-60 dak)
- Buz gibi soğuk FACS tampon maddesi içinde yeniden süspanse hücreleri (PBS +% 1 FBS).
- Tripan mavisi ve Hemasitometre, ya da otomatik hücre sayıcı kullanarak canlı hücreleri saymak.
- Hacim başına toplam canlı hücre verimi belirleyin. Bu veriler, tahmin etmek için kullanılabilirFACS verileri ile birlikte tümör süzücü lökositlerin mutlak sayıları.
- Belirlemek hücre sayısı, lekeli ve FACS ile analiz edilmesi. Bu, çeşitli faktörlere (örneğin, histoloji tipi, tümör yaşı ve boyutu, infiltre eden lökositlerin ortalama yüzdesi, vs.) tarafından etkilenir.
Not: B 16 melanoma olarak, tümör infiltre eden lökositlerin düşük bir yüzde bulunan (TIL tipik olarak <% 5), tümör hücreleri ile karşılaştırıldığında. Bu nedenle, en az 1 x 10 6, toplam tümör (tümör + infıltre edici lökositler) hücreleri, tipik olarak analiz için FACS ile toplanmıştır.- Tripan-lekeli sayım verilerini kullanarak, hücrelerin hesaplanan hacmi FACS için lekeli edilecek. TIL tipik olarak toplam tümör hücrelerinin% 5'i, örneğin, (tümör hücrelerinin çok tripan leke üzerinde ölecek), tümör, tek bir hücre süspansiyonunun sayısı faktörünün bu lekelenmesine.
- Daha az yaygın lökosit alt grupları için) CCR9 + pDC örneğin (toplam tümör hücrelerinin daha çok sayıda kullanınörneğin 2-3, tek bir hücre süspansiyonu bu hücrelerin görece alçak frekans göz önüne alındığında, FACS boyaması için), 10 6 x.
- FACS için tümör tek bir hücre süspansiyonu Leke.
- Canlı / ölü ayrımcılık için, bir düzeltilebilir leke veya non-düzeltilebilir leke (örn propidium iyodür) kullanılabilir kullanın. Hücre canlı / ölü ayrım olmaksızın lekeli ise, dikkatli antikorların spesifik olmayan bağlanma potansiyeli verilen haber verildi gerekmektedir.
- Standart FACS boyama protokolü kullanarak belirli lökosit alt grupları için hücre süspansiyonu Leke. Blok hücreler, PBS /% 1 FBS sıçan serumu ve Fc blok antijene özgü antikorlar ile lekelenmeden önce 10 dakika süre ile (Anti-CD16 / 32) içeren ve spesifik olmayan bir antikor azaltır. Boyama özgü sağlamak için doğru izotip kontrol antikorları içerir.
- FACS boyama işlemi tamamlandıktan sonra, bu noktada,% 4 formaldehit ya da diğer benzer tespit edici bir madde ile örnekleri saptamak. Dekara 4 ° C'de saklayın örneklerirk toplama ve analiz zamanına kadar (fluorophores söndürme önlemek için).
Not: uzun süre sabit örnekleri saklanması fluorophores 21 sinyali ve yoğunluğunda bir değişiklik ile sonuçlanabilir. - Bir akış sitometresindeki örnekleri toplayın. Ayarları sitometrede Optimum akış enstrüman ve lazer / dedektör kurulum tipine bağlı olarak değişir.
NOT: Ayrıca, hatta aynı makineyi kullanan eğer deneyler arasında değişkenlik olabilir. Böylece, FACS toplama ve her deney analizi öncesinde uygun tazminat ayarını sağlamak için (örneğin kalibrasyon boncuk kullanarak) uygun makine kurulumu gerçekleştirin.
- Leukoctye alt kümelerinin analizi,
- FACS veri analiz yazılımı kullanarak veri analiz etmek. Canlı / ölü leke için, ölü hücreleri yolluk başlayın. Canlı hücreler içinde lökosit tanımlamak için bir lökosit özel işaretleyici (örn anti-CD45) karşı antikor kullanın.
- Bundan sonra, farklı Gati kullanımıng düzenleri boyama protokolüne bağlı olarak, belirli alt kümelerini tanımlamak için. Örneğin, CD4 + T hücreleri tespit CD45 + nüfustan SSC lo bölgeyi seçmek ve CD19-CD3 + hücreleri seçmek için; Bu CD4 + T hücrelerinden 22 tespit edilebilir.
- (Yani alt kümelerini ölçmek için toplam sayılar, yüzdeler, oranlar veya kullanmak) verileri analiz ve tutarlılığı sağlamak ve desen veya eğilimleri belirlemek için farklı şekillerde bir dizi sunmak.
Not: Örneğin, toplanan toplam tümör hücreleri (Şekil 1) bir yüzdesi olarak, toplam canlı CD45 + hücre görünüyordu. Buna ek olarak, daha sonra tümörün içinde her lökosit alt-grup (örneğin, CD4 + T hücreleri) yüzdesi hesaplanır ve kontrol ve test grupları (Şekil 3) arasındaki oranı olarak bu karşılaştırıldı.
- FACS veri analiz yazılımı kullanarak veri analiz etmek. Canlı / ölü leke için, ölü hücreleri yolluk başlayın. Canlı hücreler içinde lökosit tanımlamak için bir lökosit özel işaretleyici (örn anti-CD45) karşı antikor kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sonuçlarımız, fazla sentezlenme murin B 16 tümörlerinde chemerin zorunlu tümör infiltre eden lökositlerin (TILS) yüzdesi artar göstermiştir. Ayrıca, chemerin ifadesi ile ilişkili tümör mikroçevresinin içinde temsil lökosit alt gruplarının nispi oranı değiştiği tespit edilmiştir. Pachynski ark. 6 izni ile yeniden yazdırın.
Şekil 1, rezeke 17. günde tümör FACS analizi ile tespit edildiği üzere, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında chemerin dile tümörlerde içindeki toplam CD45 + hücreler (TILS) önemli bir artış olduğunu göstermektedir. Lekeli kullanılarak, B16 tümör, tümör bağışıklık fluorışıması yoluyla CD45 + hücreler infiltre artış teyit edilmiştir (Şekil 2) cryosectioned.
FACS verilerinin daha fazla analizi, burada KİMM tümör NK hücreleri, T hücreleri, ortalama bir nispi artış gösterir ve bilinen DC (Lin-B220- CD11c +)Kontrol tümörlerinin (Şekil 3) ile karşılaştırıldığında ifade edilen üzerinde rin oldu. Bastırılmasında rol ya da bağışıklık yanıtları, özellikle miyeloid türetilmiş baskılayıcı hücreler (Lin-CD11 + GR1 +) ve pDC (Lin B220 + CD11c int PDCA1 +) 16,23 baskılayabilir lökosit alt kümeleri yüzdeleri göreceli bir azalma oldu .
Çalışmaların sayısı giderek artıyor tümör büyümesi açısından ve klinik sonuçların 4,24,25, hem önemli bir faktör olduğu tümör mikroçevresinin içinde lökosit alt kümelerinin oranını göstermiştir. Bizim FACS verileri ayrıca T hücreleri (T hücrelerinin toplam CD3 +) ve tümör hücre başına NK hücrelerinin sayısını ortaya çıkarmak için analiz edilmiştir; Bu hücre tipleri giderek kontrol (Şekil 4) ile karşılaştırıldığında chemerin salgılayan tümörlerde temsil edilmiştir.
Efektör (örneğin, NK ve T hücreleri) ve baskılayıcı hücresinin doğrudan bir karşılaştırma (yani MDSC ve PDC), tümör microenviron içinde popülasyonları Her iki tümör gruplarının ment bundan sonra gerçekleştirilebilir. Şekil 5, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında chemerin salgılayan tümörler içinde baskılayıcı hücre popülasyonlarına effektör oranlarında anlamlı bir artış göstermektedir.
Genel olarak, temsili sonuçlar lökosit alt kümesi popülasyonları üzerinde tümör mikroçevresinin içinde ifade chemerin etkileri, ve görülen klinik fayda ile tutarlı bir şekilde bu nüfus ve oranları olumlu çarpıklaşması göstermektedir.
. Şekil 1: günde 17 kontrol vs chemerin-ifade eksize chemerin-ifade tümörlerde artmış tümör infiltre lökositler Tümörler flow sitometri CD45 + lökosit infiltrasyonu (canlı hücrelerin%) için analiz edildi; * P <grup başına 4 veya daha fazla fareler arasında ortalama ± SEM gösteren iki-kuyruklu Student t-testi ile 0.05.
2 "src =" / files / ftp_upload / 52.657 / 52657fig2.jpg "/>
. Şekil 2: B 16 melanoma TIL Görüntüleme immünofloresan görüntüleri kontrol CD45 + hücre infiltrasyonu (beyaz oklar) göstermekte ve chemerin salgılayan 9. günde kesilmiş melanomlar; 25 bar mikron temsil eder.
. Şekil 3: chemerin-ifade tümörlerde lökosit alt kümelerinin Değişen temsil FACS verileri analiz pDC için kontrol tümörlerinin vs ifade chemerin- içinde TIL alt kümesi frekansı log 2 oranında yoluyla dönüştürülmüş (plazmasitoid DC; Lin CD11c int B220 + PDCA1 +) CDC (bilinen DC, Lin-CD11c yüksek B220-), CD4 (CD3 +, CD4 +) T hücreleri, CD8 (CD3 +, CD8 +) T hücreleri, toplam T hücreleri (CD3 +, CD4 + ve CD3 + CD8 +), NK hücrelerinin (CD3, NK1. 1+), CD11b (Lin-CD11b +), monosit / makrofajlar, MDSC (miyeloid türetilmiş baskılayıcı hücreler, Lin-CD11b + GR1 +) ve CD19 + B hücreleri (CD3-CD19 +).
saat'in 4 "src =" / files / ftp_upload / 52.657 / 52657fig4.jpg "/>
Şekil 4:. Tarif edildiği gibi, B16 tümör supresör lökosit efektör oranları Altered Gün 17 B 16 melanoma tümör FACS ile analiz edilmiştir. Bireysel lökosit alt kümeleri yolluk tarafından tespit edilmiştir. NK veya her tümör tipinde MDSC veya pDC toplam T hücrelerinin oranı daha sonra hesaplanmıştır.
. Şekil 5: chemerin-eksprese eden B16 tümör Kontrol veya chemerin salgılayan tümörlerde Artan efektör hücreler FACS ile analiz edilmiştir. 10000, toplam tümör hücre başına T ve NK hücrelerinin mutlak sayılan, FACS veriler kullanılarak hesaplanmıştır. Sonuçlar temsili bir deneyden alınmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tümör mikroçevresinin ayrıntılı analizini gerçekleştirme mekanizmaları ve immünomodülasyon etkilerini belirlemede önemlidir. Tümör infiltre lökositler bu ajanların etkisini anlamak insan klinik alanda Immunotherapeutics artan varlığı ile etki mekanizmalarını tanımlarken koşul haline gelmektedir. İnsanlarda, çoğu zaman bu şekilde çevresel bağışıklık tepkisinin analizi elde edilmesi ve lökosit alt-küme analizi için tümör dokusu analiz ve klinik ve / veya lojistik zorlukları da bulunmaktadır genellikle gerçekleştirilir. Araştırmacı hayvan modellerinde preklinik çalışmalar sağlar Sahne daha tam ve böylece klinik sonuçları etkileyebilecek mekanizmalarına ek fikir veren, tümörün kendisi içinde bağışıklık sistemi üzerinde bağışıklık ajanların etkisini araştırmak için.
Bizim teknik tümör infiltre lökositlerin detaylı analiz sağlar. Tüm tümör mikro can Çünküörneklenmiş olması, tümör içindeki bağışıklık varlığı daha küresel bir bakış değerlendirilebilir. Ve son olarak ön-tümör baskılayıcı hücreleri ve anti-tümör efektör hücrelerin dengesi, tümör büyümesi ve klinik sonuçlar 4 üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Böylece, bu analiz tipi mevcut özel lökosit alt grupları hakkında ayrıntılı bilgi araştırmacı sağlayan değerlidir. Bu ayrıntılı veriler ayrıca tümör içinde immün mekanizmaları aydınlatmak için diğer fonksiyonel veriler ile bir arada kullanılabilmektedir.
protokol görece basit bir grup içinde değişkenliği en aza indirmek için tümörün daha büyük gruplarının bir değerlendirme sağlar. Görüntüleme daha tipik ve yaygın yaklaşım ile karşılaştırıldığında (ya İHK veya immünofloresan), bizim teknik çok renkli akış sitometri kullanılarak çok özel lökosit alt gruplarının belirlenmesini sağlar. örnek yeteneği ya (çevre dahil) tüm tümör veya bir bölümüTümör örnekleme ve analiz açısından araştırmacı ek esneklik verir. Bu aynı zamanda, böylece tümör mikroçevresinin daha doğru bir resim vererek, görüntüleme birden fazla doku kesitlerinin analizi ile elde edilebilir daha lökositler ile ilgili önemli ölçüde daha fazla veri derleme izin verir.
Biz yaygın tümör aşılama ve ölçümlerin göreli kolaylığı verilen fare modellerinde kullanılan deri altı tümörler, bu tekniği kullanılmıştır. Böylece, bu protokol kullanılır tümör modellerinde olası bir çoğunluğu için geçerli olacaktır. Ancak, teknik tümör rezeksiyonu için ek adımlarla da olsa, ortotopik veya spontan tümör modellerinden rezeke tümörlere uygulanabilir. B16 melanoma büyük olarak tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için enzim sindirimi gerektirmeyen ederken, bu adım muntazam elde etmek için gerekli olan diğer tümör tipleri, temsili tek bir hücre süspansiyonu olabilir. Avantajları tümör secti bu görüntüleme da vardırons bizim tekniği ile değerlendirilebilir edilemez tanıyor. Örneğin, tümörün mikro içinde lökosit yerelleştirme daha spesifik veriler İHK / IF ile elde edilebilir, ve bu genellikle FACS analizi tarafından sağlanan verilere değerli bir yardımcı olabilir.
Sonuç olarak, tümörün mikro içindeki lökosit alt grupları değerlendirilmesi için bizim teknik araştırmacı nispeten basit bir protokol kullanarak bir tümör içinde bağışıklık varlığı detaylı analizler gerçekleştirmek için olanak sağlar. Bu fare tümör modellerinin çoğunluğu uygulanabilir ve tümör içinde mevcut lökosit tipi, sayısı ve oranları hakkında değerli bilgiler ortaya çıkmasına yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma hibe R01-CA169354 tarafından desteklenen ve R01-047822 Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Gazi İşleri Bakanlığı (ECB) bir Liyakat Ödülü. RKP NIH T32 CA009287-30A1, bir ASCO Genç Araştırmacı Ödülü, Kaliforniya Meme Kanseri Araştırma Projesi Bursu ve bir Amerikan Kanser Derneği Mentored Araştırmacı Grant tarafından desteklenmiştir; BAZ NIH hibe AI079320 tarafından desteklenmiştir. JM NIH T-32 eğitim bursu T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 ve Amerikan Kanser Derneği doktora sonrası burs PF-12-052-01-CSM burs tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Cellgro | 10-040 | http://cellgro.com; keep on ice |
| FBS | Cellgro | 35-011-CV | http://cellgro.com |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | fischersci.com |
| 40 μm filter | Falcon | 08-771-1 | fischersci.com |
| 5 ml syringe | BD | 14-823-35 | fischersci.com |
| surgical scissors/forceps | Roboz | RS-5910 | roboz.com |
| PBS | Cellgro | MT-21-030-CM | http://cellgro.com; keep on ice |
| trypan blue | Cellgro | MT-25-900-CI | fischersci.com |
| hemacytometer | Hausser Scientifice | 02-671-54 | fischersci.com |
| Live/Dead stain | Life Technologies | L34957 | lieftechnologies.com |
| FlowJo software | TreeStar, Inc | flowjo.com |
References
- Mantovani, A., et al. Chemokines in the recruitment and shaping of the leukocyte infiltrate of tumors. Semin Cancer Biol. 14 (3), 155-160 (2004).
- Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat Rev Immunol. 6 (10), 715-727 (2006).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
- Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).
- Pachynski, R. K., et al. The chemoattractant chemerin suppresses melanoma by recruiting natural killer cell antitumor defenses. J Exp Med. 209 (8), 1427-1435 (2012).
- Hoffman, R. M. Transgenic nude mice ubiquitously expressing fluorescent proteins for color-coded imaging of the tumor microenvironment. Methods Mol Biol. 1194, 353-365 (2014).
- Mansfield, J. R. Imaging in cancer immunology:phenotyping immune cell subsets in situ in FFPE tissue sections. MLO Med Lab Obs. 46 (6), 12-13 (2014).
- Serres, S., O'Brien, E. R., Sibson, N. R. Imaging angiogenesis, inflammation, and metastasis in the tumor microenvironment with magnetic resonance imaging. Adv Exp Med Biol. 772, 263-283 (2014).
- Schietinger, A., et al. Longitudinal confocal microscopy imaging of solid tumor destruction following adoptive T cell transfer. Oncoimmunology. 2 (11), e26677 (2013).
- Singh, A. S., Radu, C. G., Ribas, A. P. E. T. imaging of the immune system: immune monitoring at the whole body level. Q J Nucl Med Mol Imaging. 54 (3), 281-290 (2010).
- Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135 (2013).
- Habibollahi, P., et al. Fluorescent nanoparticle imaging allows noninvasive evaluation of immune cell modulation in esophageal dysplasia. Mol Imaging. 13 (3), 1-11 (2014).
- Balducci, A., et al. A novel probe for the non-invasive detection of tumor-associated inflammation. Oncoimmunology. 2 (2), e23034 (2013).
- Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J Clin Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
- Hadeiba, H., et al. CCR9 expression defines tolerogenic plasmacytoid dendritic cells able to suppress acute graft-versus-host disease. Nat Immunol. 9 (11), 1253-1260 (2008).
- McLean, M., et al. A BALB/c murine lung alveolar carcinoma used to establish a surgical spontaneous metastasis model. Clin Exp Metastasis. 21 (4), 363-369 (2004).
- Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of immune cells from primary tumors. J Vis Exp. (64), e3952 (2012).
- Shafer-Weaver, K. A., et al. Cutting Edge: Tumor-specific CD8+ T cells infiltrating prostatic tumors are induced to become suppressor cells. J Immunol. 183 (8), 4848-4852 (2009).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry A. 71 (6), 379-385 (2007).
- Hackstein, H., et al. Heterogeneity of respiratory dendritic cell subsets and lymphocyte populations in inbred mouse strains. Respir Res. 13, 94 (2012).
- Ostrand-Rosenberg, S. Myeloid-derived suppressor cells: more mechanisms for inhibiting antitumor immunity. Cancer Immunol Immunother. 59 (10), 1593-1600 (2010).
- Curran, M. A., Montalvo, W., Yagita, H., Allison, J. P. PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4275-4280 (2010).
- Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion. Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).
