Abstract
في مخطط كهربية الشبكية (أرج) هي طريقة الكهربية موسع لتحديد وظيفة الشبكية. من خلال وضع إلكترود على سطح القرنية، ولدت النشاط الكهربائي في استجابة للضوء يمكن قياسها واستخدامها لتقييم نشاط الخلايا الشبكية في الجسم الحي. توضح هذه المخطوطة استخدام أرج لقياس وظيفة البصرية في الزرد. منذ فترة طويلة تستخدم الزرد كنموذج للتنمية الفقارية بسبب سهولة قمع الجينات التي أليغنوكليوتيد] morpholino والتلاعب الدوائي. في 5-10 إدارة الشرطة الاتحادية، والأقماع فقط وظيفية في شبكية العين اليرقات. ولذلك، فإن الزرد، على عكس الحيوانات الأخرى، هو نظام نموذج قوي لدراسة مخروط وظيفة البصرية في الجسم الحي. يستخدم هذا البروتوكول التخدير القياسية، والمجهرية والبروتوكولات stereomicroscopy التي هي مشتركة في المختبرات التي تقوم بإجراء البحوث الزرد. الأساليب المذكورة الاستفادة من معيار الكهربية مكافئuipment وكاميرا الإضاءة الخافتة للاسترشاد بها في وضع تسجيل مسرى مكروي على القرنية اليرقات. وأخيرا، علينا أن نظهر كيف أن يتوفر تجاريا أرج مشجعا / مسجل مصممة أصلا للاستخدام مع الفئران يمكن بسهولة أن تتكيف للاستخدام مع الزرد. أرج من الزرد اليرقات يوفر وسيلة ممتازة لمعايرة مخروط وظيفة البصرية في الحيوانات التي تم تعديلها من قبل morpholino الحقن قليل النوكليوتيد وكذلك أحدث التقنيات الهندسية الجينوم مثل الزنك فنجر Nucleases (ZFNs)، النسخ المنشط على غرار المستجيب Nucleases (TALENs)، و تتجمع بانتظام Interspaced قصيرة المتناوب يكرر (كريسبر) / Cas9، والتي زادت بشكل كبير من كفاءة وفعالية استهداف الجينات في الزرد. وبالإضافة إلى ذلك، علينا أن نستفيد من قدرة وكلاء الدوائية لاختراق اليرقات الزرد لتقييم المكونات الجزيئية التي تساهم في photoresponse. ويعرض هذا البروتوكول الإعداد التي يمكن تعديلها واستخدامها من قبل الباحثينمع أهداف التجريبية المختلفة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Faraday cage | 80/20 Inc | custom | Custom designed aluminum "Industrial Erector Set" for Cage framework |
| PVA sponge | Amazon | B000ZOWG1C | Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae |
| 150 ml Sterile Filter systems | Corning | 431154 | Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes |
| Espion E2 | Diagnosys, LLC | contact | Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com |
| Colordome | Diagnosys, LLC | contact | Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com |
| Micromanipulator | Drummond | 3-000-024-R | Holding and positioning the recording microelectrode |
| Magnetic ring stand | Drummond | 3-000-025-MB | Holding and positioning of the camera and refrence electrode |
| Lead extensions | Grass Technologies | F-LX | Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes |
| Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor | Grass Technologies | DF-215/10 | Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins |
| Window screen frame (metal) and spline | Lowes or Home Depot | various | For attaching copper mesh to Faraday cage framework |
| Steriflip 50 ml filters | Millipore | SCGP00525 | Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes |
| BNC adaptor | Monoprice | 4127 | Connecting camera to BNC cable |
| BNC cable | Monoprice | 626 | Connecting camera to video adaptor |
| Camera lens | Navitar | 1582232 | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
| Camera coupler | Navitar | 1501149 | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
| Luna BNC to VGA + HDMI Converter | Sewell | SW-29297-PRO | BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor |
| APB | Sigma | A1910 | mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential |
| Borosilicate glass | Sutter | BF-150-86-10 | Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821°C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter) |
| P97 Flaming/Brown puller | Sutter | P97 | For pulling glass micropipettes |
| Sorbothane sheet | Thorlabs | SB12A | Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size |
| Breadboard | Thorlabs | B2436F | Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen |
| Passive Isolation Mounts | Thorlabs | PWA074 | Provides vibration isolation to breadboard |
| Copper mesh | TWP | 022X022C0150W36T | To line Faraday Cage |
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae |
| Pasteur pipettes | VWR | 14672-608 | Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae |
| Camera | Watec | WAT-902B | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
| Tricaine (MS-222) | Western Chemical | Tricaine-S | Pharmaceutical-grade anesthetic, |
| Micro-fil | WPI | MF28G-5 | Filling microelectrode holder and microelectrode glass |
| Microelectrode holder | WPI | MEH2SW15 | Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment |
| Reference Electrode | WPI | DRIREF-5SH | Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode |
| Reference Electrode (alternative) | WPI | EP1 | Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead |
| Low-noise cable for Microelectrode holder | WPI | 13620 | Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard |
References
- Dowling, J. E. The retina: an approachable part of the brain. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1987).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).
- Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. J Neurophysiol. 91, 1134-1142 (2004).
- Heckenlively, J. R., Arden, G. B. Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , 2nd edn, The MIT Press. Cambridge, MA. (2006).
- Perlman, I. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. Kolb, H., Nelson, R., Fernandez, E., Jones, B. , (1995).
- Fadool, J. M., Dowling, J. E. Zebrafish: a model system for the study of eye genetics. ProgRetin. Eye Res. 27, 89-110 (2008).
- Doerre, G., Malicki, J. Genetic analysis of photoreceptor cell development in the zebrafish retina. Mech. Dev. 110, 125-138 (2002).
- Brockerhoff, S. E., et al. Light stimulates a transducin-independent increase of cytoplasmic Ca2+ and suppression of current in cones from the zebrafish mutant nof. J Neurosci. 23, 470-480 (2003).
- Rinner, O., Makhankov, Y. V., Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C. Knockdown of cone-specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone response recovery and delayed dark adaptation. Neuron. 47, 231-242 (2005).
- Harada, T., Harada, C., Parada, L. F. Molecular regulation of visual system development: more than meets the eye. Genes Dev. 21, 367-378 (2007).
- Branchek, T. The development of photoreceptors in the zebrafish, brachydaniorerio. II. Function. J Comp Neurol. 224, 116-122 (1984).
- Schmitt, E. A., Dowling, J. E. Early retinal development in the zebrafish, Daniorerio: light and electron microscopic analyses. J Comp Neurol. 404, 515-536 (1999).
- Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish. Dev Dyn. 222, 564-570 (2001).
- Wong, K. Y., Adolph, A. R., Dowling, J. E. Retinal bipolar cell input mechanisms in giant danio. I. Electroretinographic analysis. J Neurophysiol. 93, 84-93 (2005).
- Nelson, R. F., Singla, N. A spectral model for signal elements isolated from zebrafish photopicelectroretinogram. Vis Neurosci. 26, 349-363 (2009).
- Korenbrot, J. I., Mehta, M., Tserentsoodol, N., Postlethwait, J. H., Rebrik, T. I. EML1 (CNG-modulin) controls light sensitivity in darkness and under continuous illumination in zebrafish retinal cone photoreceptors. J Neurosci. 33, 17763-17776 (2013).
- Gurevich, L., Slaughter, M. M. Comparison of the waveforms of the ON bipolar neuron and the b-wave of the electroretinogram. Vision Res. 33, 2431-2435 (1993).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Daniorerio). , 5th edn, University of Oregon Press. Portland, OR. (2007).
- Kim, D. Y., Jung, C. S. Gap junction contributions to the goldfish electroretinogram at the photopic illumination level. Korean J PhysiolPharmacol. 16, 219-224 (2012).
- Brockerhoff, S. E., Dowling, J. E., Hurley, J. B. Zebrafish retinal mutants. Vision Res. 38, 1335-1339 (1998).
- Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from colour units in the retina of fish (Cyprinidae). J Physiol. 185, 536-555 (1966).
- Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae). J Physiol. 185, 587-599 (1966).
- Shao, X. M., Feldman, J. L. Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials. J Neurosci. Methods. 159, 108-115 (2007).
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. ProcNatlAcadSci. U S A. 92, 10545-10549 (1995).
- Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish. CSH protocols. , (2008).
- Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. Ganzfeld ERG in zebrafish larvae. Doc Ophthalmol. 104, 57-68 (2002).
- Kainz, P. M., Adolph, A. R., Wong, K. Y., Dowling, J. E. Lazy eyes zebrafish mutation affects Müller glial cells, compromising photoreceptor function and causing partial blindness. J Comp Neurol. 463, 265-280 (2003).
- Lewis, A., et al. Celsr3 is required for normal development of GABA circuits in the inner retina. PLoS. genetics. 7, e1002239 (2011).
