Abstract
O electrorretinograma (ERG) é um método não invasivo para a determinação electrofisiológico da função retiniana. Através da colocação de um eléctrodo sobre a superfície da córnea, a actividade eléctrica gerada em resposta à luz pode ser medido e utilizado para avaliar a actividade das células da retina in vivo. Este manuscrito descreve o uso do ERG para medir a função visual em peixe-zebra. Zebrafish têm sido utilizada como um modelo para o desenvolvimento dos vertebrados, devido à facilidade de supressão do gene por oligonucleótidos morfolino e manipulação farmacológica. Em 5-10 dpf, apenas cones são funcionais na retina das larvas. Por isso, o peixe-zebra, ao contrário de outros animais, é um sistema poderoso modelo para o estudo da função visual cone in vivo. Este protocolo utiliza anestesia standard, micromanipulação e protocolos lupa estereoscópica que são comuns em laboratórios que realizam pesquisa de peixe zebra. Os métodos descritos fazer uso de eq eletrofisiologia padrãouipment e uma câmera de luz baixa para orientar o posicionamento da microeletrodos gravação sobre a córnea larval. Finalmente, é mostrado como um ERG estimulador / gravador comercialmente disponível originalmente concebido para ser utilizado com os ratos podem ser facilmente adaptados para uso com o peixe-zebra. ERG de peixe-zebra larval proporciona um excelente método de ensaio de função visual cone em animais que tenham sido modificadas por morfolino injecção de oligonucleótidos, bem como mais recentes técnicas de engenharia do genoma, tais como nucleases dedo de zinco (ZFNs), activador de transcrição-Como efector As nucleases (TALENS), e Agrupamentos regularmente espaçadas Curtas Palindromic Repete (CRISPR) / Cas9, todos os quais têm aumentado consideravelmente a eficiência e eficácia do gene alvo em peixes-zebra. Além disso, tirar vantagem de a capacidade de agentes farmacológicos para penetrar larvas de peixes-zebra para avaliar os componentes moleculares que contribuem para o foto-resposta. Este protocolo descreve uma instalação que pode ser modificado e utilizado pelos investigadorescom vários objetivos experimentais.
Introduction
O electrorretinograma (ERG) é um método não invasivo electrofisiológico que tem sido amplamente utilizado na clínica para determinar a função da retina em seres humanos. A actividade eléctrica em resposta a um estímulo de luz é medida colocando os eléctrodos de gravação sobre a superfície externa da córnea. As características do paradigma do estímulo e a resposta forma de onda de definir os neurónios da retina que contribuem para a resposta. Este método foi adaptado para utilização com um número de modelos animais, incluindo ratinhos e peixes-zebra. A resposta típica do ERG vertebrado tem quatro componentes principais: a uma onda, que é um potencial negativo córnea provêm de uma actividade celular de fotorreceptores; da onda b, um potencial positivo córnea derivado da EM células bipolares; a-d onda, um potencial positivo córnea interpretado como a actividade das células bipolares Off; e o c-ondas, que ocorre alguns segundos após a onda b e reflecte a actividade em Müller glia e a retinal epitélio pigmentar 1-4. Referências adicionais para a compreensão da história e os princípios de análise ERG em humanos e animais modelo são o livro on-line, WebVision, da Universidade de Utah e textos como os Princípios e Práticas de Eletrofisiologia Visual Clínica 4, 5.
Danio rerio (peixe-zebra) tem sido favorecido como um modelo para o desenvolvimento dos vertebrados, devido à sua rápida maturação e transparência, o que permite uma análise morfológica não invasivo dos sistemas de órgãos, e ensaios comportamentais e inverso telas genéticos (para revisão, ver e Fadool Dowling 6). Larvas do peixe são altamente passíveis de manipulação genética e farmacológica, que, quando combinada com sua alta fecundidade, torná-los um modelo animal excelente para análises biológicas de alto rendimento. A maior proporção de cones para hastes no peixe-zebra larval - cerca de 1: 1 em comparação com os ratinhos (~ 3% de cones) - os tornam particularmente úteis para o estudo da função dos cones 7-9.
Na retina de vertebrados, cones desenvolver antes de hastes 10. Curiosamente, cones de peixe-zebra são operativas logo em 4 dpf, permitindo a análise eletrofisiológica seletiva de cones nessa fase 6, 11,12. Em contraste, as respostas de ERG em hastes aparece entre 11 e 21 dpf 13. Portanto, larvas do peixe em 4-7 dpf servir funcionalmente como uma retina all-cone. No entanto, o photopic ERG resposta nativo de 4-7 larvas dpf é dominado pela onda b. Aplicação de agentes farmacológicos, tais como a L - (+) - 2-amino-4-butírico-ácido fosfono (L-AP4), um agonista para o receptor de glutamato metabotrópico (mGluR6) expressa pela SOBRE células bipolares, bloqueia eficazmente a geração da onda b e revela o potencial isolado massa cone receptor, (a "uma onda") 14-17.
Aqui nós descrevemos um simples e reliable método para análise do ERG usando equipamentos disponíveis comercialmente ERG concebido para utilização com ratos que foram adaptados para uso com larvas de peixes-zebra. Este sistema pode ser utilizado em larvas do peixe de diferentes origens genéticas, bem como aqueles tratados com agentes farmacológicos, para ajudar os investigadores na identificação de vias de sinalização que contribuem para a sensibilidade visual e adaptação de luz 16. Os procedimentos experimentais descritos neste protocolo vai orientar os pesquisadores no uso de análise ERG para responder a uma variedade de questões biológicas relacionadas à visão, e demonstrar a construção de uma configuração flexível ERG.
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Protocol
Manutenção de animais e protocolos experimentais foram aprovados pelos cuidados e uso Comitês da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill Animais Institucional, e atender a todas as necessidades do Gabinete NIH of Laboratory Animal Welfare e da Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care International.
NOTA: Para obter larvas para análise ERG, publicado protocolos para criação de peixe-zebra padrão e manutenção foram empregados 18. As larvas são obtidas através da reprodução natural e alojados sob um ciclo claro / escuro de 10 horas 14 horas de luz. Este protocolo foi optimizado para as larvas em 5-7 dias pós-fertilização (DPF), mas poderia idealmente ser realizada em peixes mais velhos com pequenas modificações para o procedimento. Aqui, use a tensão TL de tipo selvagem larvas do peixe em 5 dpf.
1. Micropipeta Produção
- Puxe vários micropipettes usando 1,5 x 0,86 milímetros (diâmetro externo de diâmetro interno) capilares de vidro de borosilicato polido-fogo comfilamento (temperatura de fusão, 821 ° C) e um P-97 Flaming / Brown Micropipeta extrator equipado com filamento caixa calor. Usar o programa para formar micropipetas descritos na Tabela 1.
- Verifique cada micropipeta sob um microscópio com um governante graticule adequadas para garantir que as pontas são de 10-15 m de diâmetro e tem uma abertura de ponta suave (ou seja, sem bordas irregulares).
- Armazenar cuidadosamente micropipetas para evitar danos ponta e exposição ao pó. As opções de armazenamento incluem placas de Petri com fita laboratório, caixas forradas com espuma, ou recipientes de armazenamento micropipeta comercialmente disponíveis.
NOTA: Outros puxadores de micropipeta de vidro capilares e podem ser usadas, desde que o diâmetro correcta da micropipeta e uma ponta de alta qualidade seja atingido.
| Pressão | Calor | Puxe | Velocidade Tempo | |
| 500 | 560 | - | 30 | 200 |
| 500 | 450 | - | 30 | 200 |
| 500 | 410 | 55 | 40 | 200 |
Tabela 1: Programa para a produção de micropipetas usando um P-97 flamejante / castanho Micropipeta Puller equipado com um filamento caixa de calor são feitas usando micropipetas de 1,5 x 1,0 mm2 (diâmetro exterior de diâmetro interno) capilares de vidro de borosilicato-polidas ao fogo, com filamentos. (temperatura de fusão, 821 ° C).
2. Preparação Tampão
- Use filtrada, tampão oxigenado de Ringer peixe 19 no capilar de microeléctrodos e para saturar a esponja de álcool polivinílico (PVA), sobre o qual as larvas são colocadas para experiências. Como alternativa, use E3 meios de embrião ou de Solução Salina Equilibrada de Hank.
- Preparar a solução de Ringer 10x peixe, tal como descrito na Tabela 2. Ajustar a pH 7,8, esterilizar e utilizando um filtro de 0,22 um e armazenar o estoque de 10x a 4 ° C.
- Criar uma solução de trabalho no dia do experimento, diluindo a solução 10x de Ringer para 1x com água deionizada, destilada. Filtrar através de um sistema de filtro de 0,22 um. Composto oxigenado por borbulhamento com 95% de O2 / 5% de CO 2 gasoso durante 10 minutos. Cap firmemente depois de assegurar que a solução permanece oxigenado.
| NaCl | 1,25 M |
| KCl | 26 mM |
| CaCl2 | 25 mM |
| MgCl2 | 10 mM |
| glicose | 100 mM |
| HEPES | 100 mM |
3. Eletrorretinograma Platform
- Realizar experiências ERG sobre uma mesa de anti-vibração no interior de uma gaiola de Faraday para melhorar a relação sinal-ruído. Anexar uma plataforma de aço sob encomenda para a mesa de anti-vibração utilizando porcas. Coloque uma plataforma móvel de plástico com um polímero uretano de absorção de choque inferior viscoelástico sobre a mesa sob a fonte de luz.
- Posicione a câmera com um stand magnetizado, voltado para baixo, para a plataforma móvel de plástico. Posicione o micromanipulator (que vai realizar a gravação de microeletrodos) com um segundo posto magnetizado para a direita da plataforma de plástico móvel. Assegure-se que a câmara e micromanipulador não será perturbada pelo movimento de outros equipamentos e que não bloqueiam a iluminação proveniente da fonte luminosa.
- Ligue a câmara a um monitor de vídeo e posicioná-la para ver o olho dolarva para colocar o eletrodo na posição adequada.
- Certifique-se de que a instalação esteja devidamente aterrado com fio de cobre. Para verificar o barulho, coloque o eletrodo de referência e na ponta do microeletrodos de gravação em um prato de 35 milímetros Petri preenchido com solução de Ringer. Verifique os níveis de ruído elétrico da instalação com um osciloscópio ou um recurso embutido do aparelho ERG. Os níveis de ruído não deve ser mais do que ± 10 mV a partir da linha de base.
4. Esponja Preparação
- Corte um retângulo pequeno de esponja de PVA seco que vai caber confortavelmente em uma placa de Petri de 35 mm. A espessura da esponja não deve ser maior do que a profundidade do prato. Use uma faca com uma lâmina de barbear limpa para o corte.
- Realizar uma redução adicional na esponja para acomodar o eléctrodo de referência (ou um corte raso longitudinalmente na parte inferior da esponja ou uma borboleta cortado verticalmente através de uma das extremidades mais pequenas).
- Use um marcador resistente a produtos químicospara marcar um pequeno ponto na esponja (onde a larva será colocado) que pode ser utilizado para posicionar a câmara.
- Mergulhe a esponja PVA na solução de Ringer até à saturação. Retire e seque rapidamente sobre uma toalha de papel 2-3 vezes. Coloque a esponja em um ambiente limpo 35 milímetros placa de Petri.
- Posicionar a placa de Petri contendo a esponja sobre a plataforma de plástico de modo a que a marca pode ser visualizado pela câmara.
5. Preparação Eletrodo
NOTA: A configuração do peixe-zebra consiste em um eléctrodo de referência em contacto com a solução saturada de PVA a esponja de Ringer e um eléctrodo de gravação em contacto com a córnea. O eletrodo de referência é constituído por uma pelota de Ag / AgCl. O eléctrodo de registo de uma micropipeta de vidro é puxado cheio com solução de Ringer e realizada por um suporte de microeléctrodo contendo um fio de Ag.
- Do cloreto de eletrodos, mergulhando-os em solução de hipoclorito de sódio a 6-9% (água sanitária) para 5 min (a micr gravaçãowire oelectrode) ou 15 minutos (o eletrodo de referência). Ar seco sobre um Kimwipe durante 5 min.
- Dependendo do estilo do corte feito no Passo 4.2, coloque o pellet Ag / AgCl do eletrodo de referência em (para o corte borboleta vertical) ou menos (para o corte raso longitudinal na parte inferior) da esponja. Fixe o cabo-eletrodo de referência para o sistema de gravação.
- Alternativamente, se a configuração do ERG tem limitações de espaço ou não são particularmente fortes artefatos fotovoltaicos do eletrodo Ag / AgCl, conecte o eletrodo de referência para a esponja através de uma ponte de sal agar para mover o eletrodo para fora do caminho da luz.
- Anexar ~ 40 cm do tubo de tamanho adequado para a 5 ml de não-bloqueio Luer da seringa. Encha a seringa com solução de Ringer. Titulares microeletrodos que possuem portas de pressão são tipicamente enviados com adaptadores para acomodar tubos com diâmetros internos de 1/16 ", 3/32", 1/8 "ou 5/32".
- Encha um 1 ml Luer não seringa fechadura comSolução de Ringer e, usando um Micro-fil, preencha cuidadosamente o suporte de microeletrodos. Evitar a formação de bolhas.
- Fixe a seringa de 5 ml para a porta de pressão do titular do microeletrodos com tubulação e usá-lo para garantir que o titular da microeletrodos está cheio de solução de Ringer. Usando o Micro-fil e 1 ml cheia com solução de Ringer, encher o copo micropipeta a partir da ponta e assegurar que não há bolhas de ar.
- Fixe a micropipeta de vidro para o titular da microeletrodos, tendo o cuidado de manter a linha reta fio do eletrodo. Uma vez garantido, a utilizar seringa de 5 ml para forçar cuidadosamente solução de Ringer através do microeléctrodo até que uma pequena quantidade de solução é visível na ponta. Aplicação ocasional de pressão para a seringa (não quando aplicado a córnea) vai impedir a formação de bolhas de ar, bem como oclusões devido à acumulação de pó ou sal, na ponta da micropipeta.
- Se a solução sai como uma corrente, substituir o gmicropipeta moça, como a abertura da ponta é muito grande ou está danificado.
- Com cuidado, coloque o microeletrodos de gravação no micromanipulator e anexar a liderança para o sistema de gravação.
6. Análise Eletroretinograma
NOTA: Devido ao predomínio cone da retina larval, os resultados do ERG de alta qualidade pode ser obtido quando os preparativos para a gravação são realizadas sob baixos níveis de luz branca indireta (<1 lux) ou com curtos períodos de tempo (<1 min) de maior intensidade ( ≤250 lux) luz de trabalho. Um curto período de adaptação ao escuro ainda é necessária antes da gravação (veja o passo 6.7). No entanto, experimentos podem ser realizados sob luz vermelha ou infravermelha dim usando uma câmera infravermelha de minúsculas. Todos os experimentos foram realizados em esterilizada por filtração (0,22 mm) de água do sistema do Mecanismo UNC Zebrafish aquicultura mas a mídia embrião alternativos podem ser utilizados.
- Corte quadrados de papel toalha medindo aproximadamente 1cm 2.
- Se a medição potencial de receptor isolado massa cone, incubar 3-5 larvas em água do sistema com 500 uM (±) -2-4-Amino-phosphonobutyric ácido (APB) durante 5 min.
NOTA: Enquanto APB é uma mistura racémica do composto activo (G) e inactivos formas de AP4 (R), é tão eficaz como a L-AP4 e é menos dispendiosa. - Anestesiar 3-5 larvas em água sistema com 0,02% (w / v) tricaina até sem resposta, cerca de 1-2 min.
- Use uma bomba de pipeta e pipeta Pasteur para transferir cuidadosamente larvas indivíduo para quadrados de papel toalha sob um estereoscópio dissecando com uma iluminação mínima (≤250 lux para <1 min). Verifique a posição de cada larva e escolher um candidato que é lateral-se dorsal com um olho não obstruído.
- Para gravações prolongados (> 30 min), manter a larva úmida por vidros do corpo até, mas não incluindo a cabeça com 3% de metilcelulose usando um pincel fino de pêlo de camelo.
- Utilizando uma pinça, transferir o squar toalha de papele com a larva à esponja úmida PVA.
- Para as gravações prolongados (> 30 min), aplicar um fluxo contínuo de água saturado de 100% de O2 do gás através da larva, fazendo borbulhar o gás através de um difusor em um frasco de braço lateral contendo água destilada. Posicione o tubo que sai do lado do braço balão que transmite o oxigênio umidificado perto da cabeça do larva.
NOTA: Passo 6.4.1 e 6.5.1 passo irá prolongar a vida do peixe 16.
- Para as gravações prolongados (> 30 min), aplicar um fluxo contínuo de água saturado de 100% de O2 do gás através da larva, fazendo borbulhar o gás através de um difusor em um frasco de braço lateral contendo água destilada. Posicione o tubo que sai do lado do braço balão que transmite o oxigênio umidificado perto da cabeça do larva.
- De acordo com um mínimo de iluminação, use o micromanipulator e câmera para posicionar a ponta de microeletrodos no ponto médio entre o nasal e extremidades caudais do olho e pressione suavemente sobre o limite dorsal da córnea.
NOTA: Extravio da ponta do eletrodo para as áreas muito distantes da córnea pode resultar em formas de onda ERG de polaridade invertida. - Permitir larva para dark-se adaptar para 5-10 min.
- Registrar as respostas flash de teste a luz fornecida a partir de uma fonte de luz LED ou estimulador ótico usando o avaiestimulação e gravação de equipamentos lable. Ajuste os parâmetros do protocolo, como a intensidade do flash, comprimento flash, cor flash, intensidade de fundo e configurações de cores e filtros para atender o experimento.
- Quando terminar com o experimento, a eutanásia larvas de acordo com as diretrizes AVMA / IACUC.
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Representative Results
Normalmente, ERGs são registrados a partir de larvas do peixe em 5 dpf, uma vez que uma série de estudos publicados gravações ERG, nesta fase, 9, 16,20. Respostas larval foram medidos em condições de adaptação ao escuro, sem iluminação de fundo usando a 20 ms estímulo de luz LED branco. Utilizamos um sistema ERG comercialmente disponível consiste em um estimulador luz Ganzfeld e computador controller / gravador. O estimulador utiliza um sistema de modulação de largura de pulso rigidamente controlado proprietário (PWM) para controlar a luminosidade de fundo e ambos os estímulos flash. As respostas foram gravadas usando um amplificador totalmente diferenciado proprietária com um filtro anti-aliasing hardware dirigindo um analógico de 16 bits para conversor digital (ADC). Estímulo e resposta gravações foram controlados por um software proprietário fornecido com o equipamento de acordo com o protocolo do fabricante. Nosso equipamento foi programado para utilizar uma taxa de amostragem de 1 kHz, digitais casc Besselfiltros ade definido como um passa-banda de entre 0.312 Hz e 300 Hz e 60 Hz um filtro de corte para remover o excesso de ruído. No larva de adaptação ao escuro os aumentos de b-onda de amplitude com o aumento da intensidade de luz (Figura 1). A onda é tipicamente um obscurecida pela onda b e não pode ser detectado de forma segura. A-ondas b pode ser bloqueada através da incubação das larvas com o agonista do receptor de glutamato metabotrópico (mGluR6), ácido 4-fosfono-butírico (APB). Isto permite que o potencial receptor de massa do cone (ou "uma onda") para serem detectados. Essa "uma onda" resposta aumenta em amplitude com intensidades crescentes de luz (Figura 2).
Paradigmas adicionais pode ser utilizado para testar os parâmetros visuais para além da função visual básico e sensibilidade. Através da utilização de um paradigma flash dual, pode-se medir a capacidade do cone photoresponse de recuperar a partir do estímulo inicial (Figura 3A). Como o intervalo interstimulus(ISI) aumenta, a amplitude da segunda resposta aumenta, indicando a recuperação a partir do estímulo inicial (Figura 3B). Os APB-isolado "uma onda" vestígios apresentados são a média de três varreduras e estar de acordo com relatórios publicados sobre o peixe-zebra ERGs larvais utilizando paradigmas de estimulação semelhantes 2, 9,16.
Figura 1: gravação ERG típica em 5 dpf zebrafish larval. A série intensidade foi obtido em condições de adaptação ao escuro. Os peixes são expostos à luz branca LED para uma duração de 20 ms com intensidades igual a 1, 10, 25, 50 125, 250, 500, 1.250, 2.500 e 5.000 cd / m 2. O início do estímulo de luz é indicada pela linha vertical tracejada. O potencial de uma onda negativa (seta vertical) é difícil de distinguir, enquanto que o positivopotencial da onda b (seta dobrado) é o pico da forma de onda dominante. Um pequeno artefacto fotovoltaica pode ser observado como um desvio positivo menor anterior ao início da onda-um. Inset, em média amplitudes de resposta b-wave com o aumento da intensidade de luz que foram caber usando a equação Naka-Rushton 21, 22. As barras de erro representam SEM.
Figura 2: potencial receptor massa APB-isolado cone registrada da série Intensity zebrafish larval obtido em condições de adaptação ao escuro em 5 dpf.. O estímulo é um diodo emissor de luz branca 20 mseg com intensidades igualando 1, 10, 25, 50 125, 250, 500, 1.250, 2.500 e 5.000 cd / m 2. O início da estimulação luminosa é indicado pela linha vertical a tracejado. O isolado receptor massa cone potencial ("a onda") é o elemento dominante da forma de onda (seta). Um pequenofotovoltaica artefacto pode ser observado como um desvio positivo menor anterior ao início da resposta de cones. Inset, em média amplitudes de resposta com o aumento da intensidade de luz que foram caber usando a equação Naka-Rushton. As barras de erro representam SEM.
Figura 3:.. Cone receptor potencial de massa de gravação utilizando um paradigma flash dual Uma larva de 5 dpf tratados com APB foi submetido a duas ondas de 20 mseg de luz branca (LED) fonte, cada um com uma intensidade de 1000 cd / m 2 (A) A resposta aos dois flashes sucessivas com intervalo interstimulus (ISI) igual a 2 sec. Exposições de luz são marcadas por linhas verticais a tracejado. A amplitude da segunda resposta é menor do que a da primeira resposta, indicando a recuperação da resposta incompleta. (B) A razão entre o poten máxima isolado cone receptor de massaTiAl resposta do segundo estímulo à do estímulo inicial para cada ISI. Uma análise de regressão não-linear de melhor ajuste foi aplicado. Como o ISI aumenta, a resposta às segundo aumenta estímulo em amplitude em relação à resposta ao estímulo inicial indicando recuperação progressiva da sensibilidade de fotorreceptores. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste protocolo um procedimento simples para gravações ERG de peixe-zebra larval é detalhado. Este procedimento permite uma análise rápida e abrangente de function.There visual são vários passos críticos em todo o procedimento que deve ser mantido em mente. O larvas do peixe deve ser saudável antes do experimento para impedir a morte durante os tratamentos potenciais da droga e garantir meios de subsistência prolongada durante as gravações do ERG. Além disso, é importante que as larvas utilizadas nas experiências são estreitamente ajustado para a idade. Isto é devido ao rápido desenvolvimento da retina (isto é, o desenvolvimento diferencial de subtipos de cone) e também a morfologia global e fisiologia das larvas. Por exemplo, após 7 dpf a eficiência da transpiração epitelial diminui tornando-o mais difícil de manter o peixe vivo. Outro fator importante é a qualidade da gravação e os eléctrodos de referência. Cuidados devem ser tomados quando se puxa capilares de vidro para evitar grosseiro tips. A microforge micropipeta poderia ser empregada para o fogo-polonês puxado eletrodos e ajuda a melhorar a aquisição de sinal. Além disso, a manutenção da qualidade dos eléctrodos de Ag / AgCl é muito importante. Após a utilização, eles devem ser enxaguados com água destilada e seco ao ar imediatamente. Enquanto escurecimento da superfície exterior de eléctrodos pode ocorrer com o tempo e não afecta o desempenho, manchada (amarelo para vermelho escuro) ou eléctrodos sem caroço deve ser evitada. Evite eletrodos de manipulação com as mãos, como a contaminação de proteína pode afetar negativamente o comportamento do eletrodo. Finalmente, deve notar-se que os eléctrodos de Ag / AgCl são fotossensíveis e pode levar a artefactos de flash se não for protegido. No entanto, nós encontramos esses artefatos para ser mínimo (ver lendas das Figuras 1 e 2) e não interferem com as nossas medições das respostas de peixe-zebra larval a piscar estímulos. Em alternativa, uma ponte de sal pode ser usada para ligar o eléctrodo de Ag / AgCl para a esponja por meio de um sa ágarponte lt para mover o eletrodo para fora do caminho da luz. Embora uma ponte de sal é utilizado em corrente contínua (DC) gravações directos para estabilizar o potencial de eléctrodo 23, o registo do ERG utiliza corrente alterna (AC). Portanto, a única finalidade de uma ponte de sal neste sistema seria se a configuração particular tem limitações de espaço ou particularmente fortes artefatos fotovoltaicos.
ERG tem várias vantagens sobre outras técnicas para medir a função visual. A principal vantagem é que se trata de uma gravação in vivo. A desvantagem é que a actividade de células específicas devem ser inferidas a partir da forma de onda, em vez de ser medido directamente, como seria o caso para eléctrodos de sucção ou patch clamp gravações de fotorreceptores e de outras células da retina. Normalmente, as gravações de eléctrodos de sucção, gravações de fixação de membranas e todo ERGs retina têm a vantagem de que os agentes farmacológicos pode ser facilmente introduzida em células para definir os componentes molecularesda resposta, ao passo que este é mais difícil in vivo utilizando modelos de mamíferos. A permeabilidade das larvas de peixes-zebra para tais agentes supera esta desvantagem.
Análise de larvas de adaptação ao escuro, na ausência de agentes farmacológicos produz uma forma de onda do ERG dominado pela onda-b, um resultado que foi observado por um número de outros grupos 2, -26 9,24. Nós demonstramos a capacidade de isolar o receptor de potencial de massa cone, tirando partido da capacidade de agentes farmacológicos para penetrar zebrafish larval. As larvas tratadas com APB exibir uma revogação da onda b, permitindo que a "uma onda" para ser visualizado 14-17. Formas de onda com excelente relações sinal-ruído foram obtidos pela média de três varreduras. Variação das formas de onda de resposta às vezes é observado, mas Makhankov et al. 2 relataram que a variância em medições repetidas do mesmo animal é menosdo que a observada entre os indivíduos. Portanto, a variância é provável que seja o resultado de variação, em vez de variabilidade biológica na técnica.
Também utilizado análise ERG para examinar recuperação cone in vivo utilizando um paradigma flash dual, semelhante aos resultados publicados na presença e ausência de iluminação de fundo 9, 16. Isto foi realizado através da medição da capacidade da retina das larvas para responder aos pisca sucessivas de diferentes ISI. Quando usado em combinação com agentes farmacológicos ou estratégias de engenharia genoma tais como TALENS para derrubar alvos da via, o peixe-zebra é poderoso sistema para o estudo in vivo dos mecanismos moleculares da adaptação cone e recuperação visual.
O nosso procedimento e o equipamento pode ser facilmente adaptado para examinar os olhos de larvas de peixe-zebra, isolados mais velhos ou outros vertebrados 27, 28. Na verdade, o sistema de estimulação e registo do ERGque empregamos foi principalmente concebidos para uso em um ambiente clínico e depois modificado para a experimentação em ratos. Adaptação da plataforma para larvas do peixe foi simples e pode ser facilmente replicada em outros laboratórios de baixo custo. Configurações similares que compreendem os aparelhos electrofisiológico clássica poderia ser construída por um custo mínimo, e têm demonstrado proporcionar resultados fiáveis 16. No geral, esta técnica é de grande benefício para os investigadores que estudam os mecanismos da função visual.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Faraday cage | 80/20 Inc | custom | Custom designed aluminum "Industrial Erector Set" for Cage framework |
| PVA sponge | Amazon | B000ZOWG1C | Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae |
| 150 ml Sterile Filter systems | Corning | 431154 | Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes |
| Espion E2 | Diagnosys, LLC | contact | Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com |
| Colordome | Diagnosys, LLC | contact | Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com |
| Micromanipulator | Drummond | 3-000-024-R | Holding and positioning the recording microelectrode |
| Magnetic ring stand | Drummond | 3-000-025-MB | Holding and positioning of the camera and refrence electrode |
| Lead extensions | Grass Technologies | F-LX | Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes |
| Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor | Grass Technologies | DF-215/10 | Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins |
| Window screen frame (metal) and spline | Lowes or Home Depot | various | For attaching copper mesh to Faraday cage framework |
| Steriflip 50 ml filters | Millipore | SCGP00525 | Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes |
| BNC adaptor | Monoprice | 4127 | Connecting camera to BNC cable |
| BNC cable | Monoprice | 626 | Connecting camera to video adaptor |
| Camera lens | Navitar | 1582232 | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
| Camera coupler | Navitar | 1501149 | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
| Luna BNC to VGA + HDMI Converter | Sewell | SW-29297-PRO | BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor |
| APB | Sigma | A1910 | mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential |
| Borosilicate glass | Sutter | BF-150-86-10 | Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821°C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter) |
| P97 Flaming/Brown puller | Sutter | P97 | For pulling glass micropipettes |
| Sorbothane sheet | Thorlabs | SB12A | Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size |
| Breadboard | Thorlabs | B2436F | Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen |
| Passive Isolation Mounts | Thorlabs | PWA074 | Provides vibration isolation to breadboard |
| Copper mesh | TWP | 022X022C0150W36T | To line Faraday Cage |
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae |
| Pasteur pipettes | VWR | 14672-608 | Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae |
| Camera | Watec | WAT-902B | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
| Tricaine (MS-222) | Western Chemical | Tricaine-S | Pharmaceutical-grade anesthetic, |
| Micro-fil | WPI | MF28G-5 | Filling microelectrode holder and microelectrode glass |
| Microelectrode holder | WPI | MEH2SW15 | Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment |
| Reference Electrode | WPI | DRIREF-5SH | Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode |
| Reference Electrode (alternative) | WPI | EP1 | Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead |
| Low-noise cable for Microelectrode holder | WPI | 13620 | Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard |
References
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