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Neuroscience

Zebrafish लार्वा में दृश्य प्रतिक्रिया के Electroretinogram विश्लेषण

doi: 10.3791/52662 Published: March 16, 2015

Abstract

electroretinogram (एर्ग) रेटिना समारोह का निर्धारण करने के लिए एक noninvasive electrophysiological विधि है। कॉर्निया की सतह पर एक इलेक्ट्रोड की नियुक्ति के माध्यम से, बिजली की गतिविधि मापा जाता है और इन विवो में रेटिना की कोशिकाओं की गतिविधि का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्रकाश के जवाब में उत्पन्न। इस पांडुलिपि zebrafish में दृश्य समारोह को मापने के लिए एर्ग के उपयोग का वर्णन है। Zebrafish लंबे कारण morpholino oligonucleotides और औषधीय हेरफेर से जीन दमन की आसानी के लिए हड्डीवाला विकास के लिए एक मॉडल के रूप में उपयोग किया गया है। 5-10 DPF पर, केवल शंकु लार्वा रेटिना में कार्य कर रहे हैं। इसलिए, zebrafish, अन्य जानवरों के विपरीत, विवो में कोन दृश्य समारोह के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है। इस प्रोटोकॉल मानक संज्ञाहरण, micromanipulation और zebrafish अनुसंधान करते हैं कि प्रयोगशालाओं में आम हैं कि stereomicroscopy प्रोटोकॉल का उपयोग करता है। उल्लिखित तरीकों मानक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी EQ का उपयोग करनाuipment और एक कम लाइट कैमरा लार्वा कॉर्निया पर रिकॉर्डिंग microelectrode की नियुक्ति मार्गदर्शन करने के लिए। अंत में, हम मूल रूप से चूहों के साथ प्रयोग के लिए डिजाइन एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एर्ग उत्तेजक / रिकॉर्डर आसानी से zebrafish के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि कैसे प्रदर्शित करता है। लार्वा zebrafish के एर्ग एक morpholino oligonucleotide इंजेक्शन द्वारा संशोधित किया गया है कि पशुओं में कोन दृश्य समारोह परख करने की क्रिया के उत्कृष्ट पद्धति के रूप में अच्छी तरह से जैसे जिंक फिंगर न्युक्लिअसिज़ (ZFNs) के रूप में नए जीनोम इंजीनियरिंग तकनीक प्रदान करता है, प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह effector के न्युक्लिअसिज़ (TALENS), और नियमित रूप से संकुल interspaced लघु मुरजबंध संबंधी पुनर्प्रसारण (CRISPR) / बहुत दक्षता और zebrafish में लक्षित जीन की प्रभावकारिता में वृद्धि हुई है, जो सभी के Cas9,। इसके अलावा, हम photoresponse के लिए योगदान है कि आणविक घटकों का मूल्यांकन करने के लिए zebrafish लार्वा घुसना करने के लिए औषधीय एजेंटों की क्षमता का लाभ ले। इस प्रोटोकॉल संशोधित और शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक सेटअप की रूपरेखाविभिन्न प्रयोगात्मक लक्ष्यों के साथ।

Introduction

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electroretinogram (एर्ग) मनुष्यों में रेटिना के समारोह का निर्धारण करने के लिए क्लिनिक में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है कि एक noninvasive electrophysiological विधि है। एक प्रकाश उत्तेजना के जवाब में बिजली की गतिविधि कॉर्निया की बाहरी सतह पर रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड रखकर मापा जाता है। उत्तेजना प्रतिमान और प्रतिक्रिया तरंग की विशेषताओं प्रतिक्रिया के लिए योगदान दे रेटिना न्यूरॉन्स को परिभाषित। इस विधि चूहों और zebrafish सहित पशु मॉडलों के एक नंबर के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया गया है। ठेठ कशेरुकी एर्ग प्रतिक्रिया चार प्रमुख घटक हैं: फोटोरिसेप्टर सेल गतिविधि से प्राप्त कॉर्निया नकारात्मक संभावित है, जो एक-लहर; बी-लहर, द्विध्रुवी कोशिकाओं से व्युत्पन्न एक कॉर्निया पॉजिटिव संभावित; D-लहर रवाना द्विध्रुवी कोशिकाओं की गतिविधि के रूप में व्याख्या एक कॉर्निया पॉजिटिव संभावित; और बी-लहर के बाद कई सेकंड होती है और जो सी-लहर, मुलर glia और रेत में गतिविधि को दर्शाता हैinal वर्णक उपकला 1-4। मनुष्य और मॉडल पशुओं में एर्ग विश्लेषण के इतिहास और सिद्धांतों को समझने के लिए अतिरिक्त संदर्भ में इस तरह के सिद्धांतों और विजन 4, 5 के नैदानिक ​​इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के अभ्यास के रूप यूटा और ग्रंथों के विश्वविद्यालय से ऑनलाइन पाठ्यपुस्तक, Webvision, कर रहे हैं।

देनियो rerio (zebrafish) लंबे समय के कारण अंग प्रणालियों, व्यवहार assays के noninvasive रूपात्मक विश्लेषण और आगे दोनों और रिवर्स आनुवंशिक स्क्रीन (समीक्षा के लिए, Fadool और देखने के लिए अनुमति देता है जो अपनी तेजी से परिपक्वता और पारदर्शिता के लिए, हड्डीवाला विकास के लिए एक मॉडल के रूप में इष्ट किया गया है Dowling 6)। Zebrafish लार्वा, उनके उच्च उपजाऊपन के साथ युग्मित है, जब उन्हें उच्च throughput जैविक विश्लेषण के लिए एक उत्कृष्ट पशु मॉडल बनाने के लिए जो आनुवंशिक और औषधीय हेरफेर करने के लिए अत्यधिक उत्तरदायी हैं। लार्वा zebrafish में छड़ को शंकु के उच्च अनुपात - मोटे तौर पर 1: 1 चूहों (~ 3% शंकु की तुलनास) - कोन समारोह 7-9 के अध्ययन के लिए उन्हें विशेष रूप से उपयोगी है।

हड्डीवाला रेटिना में, शंकु छड़ 10 से पहले का विकास। दिलचस्प है, zebrafish शंकु कि स्टेज 6, 11,12 पर शंकु के चुनिंदा electrophysiological विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, के रूप में जल्दी 4 DPF रूप ऑपरेटिव हैं। इसके विपरीत, छड़ में एर्ग प्रतिक्रियाओं 11 और 21 से 13 DPF के बीच दिखाई देते हैं। इसलिए, 4-7 पर zebrafish लार्वा DPF एक सब-कोन रेटिना के रूप में कार्यात्मक रूप में सेवा करते हैं। हालांकि, 4-7 DPF लार्वा की देशी photopic एर्ग प्रतिक्रिया बी-लहर का प्रभुत्व है। (+) - - 2-अमीनो-4-phosphono-butyric एसिड (एल AP4), metabotropic ग्लूटामेट के लिए एक agonist द्विध्रुवी कोशिकाओं द्वारा व्यक्त (mGluR6) रिसेप्टर को प्रभावी ढंग से ब्लॉक पीढ़ी ऐसे एल के रूप में औषधीय एजेंटों के आवेदन बी-लहर की और पृथक कोन बड़े पैमाने पर रिसेप्टर संभावित ("एक लहर") 14-17 पता चलता है।

यहाँ हम एक सरल और reliabl का वर्णनzebrafish लार्वा के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया गया है कि चूहों के साथ प्रयोग के लिए बनाया व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एर्ग उपकरण का उपयोग कर एर्ग विश्लेषण के लिए ई विधि। इस प्रणाली के दृश्य संवेदनशीलता और प्रकाश अनुकूलन 16 के लिए योगदान है कि रास्ते संकेतन की पहचान में शोधकर्ताओं सहायता करने के लिए, आनुवंशिक पृष्ठभूमि बदलती है, साथ ही औषधीय एजेंटों के साथ इलाज के रूप में उन की zebrafish लार्वा पर ​​उपयोग किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं दृष्टि से संबंधित जैविक सवालों की एक किस्म का जवाब देने के एर्ग विश्लेषण के उपयोग में जांचकर्ताओं को मार्गदर्शन, और एक लचीला एर्ग सेटअप के निर्माण का प्रदर्शन करेंगे।

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Protocol

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पशु रखरखाव और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल नॉर्थ कैरोलिना विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा मंजूरी दे दी, और प्रयोगशाला पशु कल्याण एनआईएच कार्यालय और आकलन और प्रयोगशाला पशु की देखभाल इंटरनेशनल के प्रत्यायन के लिए एसोसिएशन की सभी आवश्यकताओं को पूरा कर रहे थे।
नोट: मानक zebrafish पशुपालन और रखरखाव के लिए एर्ग विश्लेषण के लिए लार्वा को प्राप्त करने के लिए, प्रकाशित प्रोटोकॉल 18 कार्यरत थे। लार्वा प्राकृतिक प्रजनन के माध्यम से प्राप्त की है और एक 14 घंटा प्रकाश / 10 घंटा अंधेरे चक्र के तहत आते हैं। इस प्रोटोकॉल के बाद निषेचन (DPF) 5-7 दिनों में लार्वा के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन आदर्श प्रक्रिया के लिए छोटे संशोधनों के साथ पुराने मछली पर प्रदर्शन किया जा सकता है। इधर, 5 DPF पर जंगली प्रकार zebrafish लार्वा की टीएल तनाव का उपयोग करें।

1. Micropipette उत्पादन

  1. साथ आग पॉलिश borosilicate ग्लास केशिकाओं 1.5 एक्स 0.86 मिमी (भीतरी व्यास द्वारा बाहरी व्यास) का उपयोग कर कई micropipettes खींचोरेशा (821 डिग्री सेल्सियस, तापमान के पिघलने) और एक पी-97 ज्वलंत / ब्राउन micropipette डांड़ी बॉक्स गर्मी फिलामेंट के साथ लगाया। तालिका 1 में वर्णित micropipettes fashioning के लिए इस कार्यक्रम का उपयोग करें।
  2. सुझावों व्यास में 10-15 माइक्रोन कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक उपयुक्त graticule शासक के साथ एक खुर्दबीन के तहत प्रत्येक micropipette की जाँच करें और एक चिकनी टिप खोलने (यानी, कोई दांतेदार किनारों) है।
  3. ध्यान से धूल करने के लिए टिप नुकसान और प्रदर्शन को रोकने के micropipettes की दुकान। भंडारण विकल्प प्रयोगशाला टेप, फोम लाइन बक्से, या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध micropipette का भंडारण कंटेनर के साथ पेट्री डिश में शामिल हैं।
    नोट: अन्य micropipette खींचने और कांच केशिकाओं सही micropipette के व्यास और एक उच्च गुणवत्ता वाले टिप हासिल की है के रूप में लंबे समय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
दबाव गर्मी खींचें वेग टाइम
500 560 - 30 200
500 450 - 30 200
500 410 55 40 200

तालिका 1: एक बॉक्स गर्मी फिलामेंट के साथ लगे एक पी-97 ज्वलंत / ब्राउन micropipette डांड़ी का उपयोग कर micropipettes के उत्पादन के लिए कार्यक्रम Micropipettes फिलामेंट के साथ आग पॉलिश borosilicate ग्लास केशिकाओं 1.5 एक्स 1.0 मिमी 2 (भीतरी व्यास द्वारा बाहरी व्यास) का उपयोग किया जाता है। (पिघलने के तापमान, 821 डिग्री सेल्सियस)।

2. बफर तैयारी

  1. Microelectrode केशिका में, ऑक्सीजन सुनहरी घंटी बफर 19 फ़िल्टर्ड का उपयोग करें और लार्वा प्रयोगों के लिए रखा जाता है पर जो polyvinyl शराब (PVA) स्पंज तर करने के लिए। वैकल्पिक रूप से, E3 के उपयोग भ्रूण मीडिया या हांक संतुलित नमक समाधान।
  2. 7.8 पीएच को समायोजित करें, और एक .22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर बाँझ और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10x शेयर की दुकान तालिका 2 में वर्णित के रूप में 10x सुनहरी घंटी समाधान तैयार करें।
  3. विआयनीकृत, आसुत जल के साथ 1x को 10x घंटी समाधान गिराए द्वारा प्रयोग के दिन पर एक काम समाधान बनाएँ। 0.22 माइक्रोन फिल्टर प्रणाली का उपयोग कर फ़िल्टर। 10 मिनट के लिए 95% ओ के साथ 2/5% सीओ 2 गैस बुदबुदाती द्वारा आक्सीजन के साथ मिलना। कसकर बाद कैप समाधान ऑक्सीजन बनी हुई है कि यह सुनिश्चित करने के लिए।
NaCl 1.25 मीटर
KCl 26 मिमी
2 CaCl 25 मिमी
2 MgCl 10 मिमी
ग्लूकोज़ 100 मिमी
HEPES 100 मिमी
jove_content "> तालिका 2: 10x सुनहरी घंटी समाधान की तैयारी।

3. Electroretinogram प्लेटफार्म

  1. शोर अनुपात करने के लिए संकेत सुधार करने के लिए एक फैराडे पिंजरे के अंदर एक विरोधी कंपन मेज पर एर्ग प्रयोगों प्रदर्शन। हेक्स पागल का उपयोग कर विरोधी कंपन तालिका करने के लिए एक कस्टम इस्पात मंच संलग्न। प्रकाश स्रोत के तहत मेज पर एक viscoelastic urethane बहुलक सदमे को अवशोषित नीचे के साथ एक चल प्लास्टिक मंच रखें।
  2. जंगम प्लास्टिक मंच पर नीचे के उद्देश्य से एक चुम्बकीय स्टैंड के साथ कैमरा, स्थिति। जंगम प्लास्टिक मंच के अधिकार के लिए एक दूसरे चुम्बकीय स्टैंड के साथ (रिकॉर्डिंग microelectrode का आयोजन करेगा, जिसमें) micromanipulator स्थिति। कैमरा और micromanipulator के अन्य उपकरणों के आंदोलन से परेशान नहीं किया जाएगा कि और वे प्रकाश स्रोत से रोशनी ब्लॉक नहीं है कि सुनिश्चित करें।
  3. एक वीडियो निगरानी के लिए कैमरा कनेक्ट और की आंख देखने के लिए यह स्थितिउचित स्थिति में इलेक्ट्रोड रखने के लिए लार्वा।
  4. सेटअप ठीक से तांबे के तार के साथ आधारित है कि सुनिश्चित करें। शोर की जांच करने के लिए, घंटी समाधान के साथ भरा एक 35 मिमी पेट्री डिश में रिकॉर्डिंग microelectrode के संदर्भ इलेक्ट्रोड और टिप जगह है। एक आस्टसीलस्कप या एर्ग तंत्र के एक निर्मित में सुविधा के साथ सेटअप के बिजली के शोर के स्तर की जाँच करें। शोर का स्तर आधारभूत से अधिक नहीं ± 10 μV होना चाहिए।

4. स्पंज तैयारी

  1. एक 35 मिमी पेट्री डिश में snugly फिट होगा कि शुष्क PVA स्पंज के एक छोटे आयत काटें। स्पंज की मोटाई पकवान की गहराई से बड़ा नहीं होना चाहिए। काटने के लिए एक साफ धार के साथ एक उपयोगिता चाकू का प्रयोग करें।
  2. (स्पंज के नीचे या छोटे सिरों में से एक के माध्यम से खड़ी कटौती एक तितली पर लंबाई में या तो एक उथले कटौती) संदर्भ इलेक्ट्रोड को समायोजित करने के लिए स्पंज में एक अतिरिक्त कटौती करें।
  3. एक रासायनिक प्रतिरोधी मार्कर का उपयोग करेंकैमरा स्थिति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि स्पंज (लार्वा रखा जाएगा जहां) पर एक छोटा सा डॉट चिह्नित करने के लिए।
  4. संतृप्त जब तक घंटी समाधान में PVA स्पंज भिगोएँ। 2-3 बार निकालें और एक कागज तौलिया पर जल्दी से दाग। एक स्वच्छ 35 मिमी पेट्री डिश में स्पंज रखें।
  5. मार्क कैमरे द्वारा देखे जा सकते हैं कि इस तरह के प्लास्टिक के मंच पर स्पंज युक्त पेट्री डिश स्थिति।

5. इलेक्ट्रोड तैयारी

नोट: zebrafish सेटअप घंटी समाधान संतृप्त PVA स्पंज और कॉर्निया के साथ संपर्क में एक रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के साथ संपर्क में एक संदर्भ इलेक्ट्रोड के होते हैं। संदर्भ इलेक्ट्रोड एक एजी / AgCl गोली के होते हैं। रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड एक एजी तार युक्त एक microelectrode धारक द्वारा घंटी समाधान के साथ भरा है और आयोजित एक खींच कांच micropipette है।

  1. 5 मिनट (रिकॉर्डिंग माइकर के लिए 6-9% सोडियम हाइपोक्लोराइट (ब्लीच) में भिगोने से इलेक्ट्रोड क्लोराइडoelectrode तार) या 15 मिनट (संदर्भ इलेक्ट्रोड)। 5 मिनट के लिए एक Kimwipe पर शुष्क हवा।
    1. 4.2 कदम में की गई कटौती की शैली पर निर्भर करता है, स्पंज (तल पर लंबाई में उथले कटौती के लिए) (ऊर्ध्वाधर तितली कटौती के लिए) या नीचे में संदर्भ इलेक्ट्रोड के एजी / AgCl गोली जगह है। रिकॉर्डिंग प्रणाली के संदर्भ इलेक्ट्रोड नेतृत्व संलग्न।
    2. एर्ग सेटअप जगह की कमी है या एजी / AgCl इलेक्ट्रोड से विशेष रूप से मजबूत फोटोवोल्टिक कलाकृतियों अगर वहाँ वैकल्पिक रूप से, प्रकाश पथ से बाहर इलेक्ट्रोड स्थानांतरित करने के लिए एक अगर नमक पुल के माध्यम से स्पंज के संदर्भ इलेक्ट्रोड कनेक्ट।
  2. एक 5 मिलीलीटर गैर luer ताला सिरिंज ~ उचित आकार ट्यूबिंग के 40 सेमी संलग्न। घंटी समाधान के साथ सिरिंज भरें। दबाव बंदरगाहों आम तौर पर एडेप्टर के साथ जहाज रखने microelectrode धारकों, "3/32" 1/8 1/16 के भीतरी व्यास के साथ ट्यूबिंग समायोजित "या 5/32" करने के लिए।
  3. के साथ एक 1 मिलीलीटर गैर luer ताला सिरिंज भरेंएक माइक्रो-फिल का उपयोग कर घंटी समाधान और, ध्यान से microelectrode धारक भरें। बुलबुले के गठन को रोकने।
  4. ट्यूबिंग साथ microelectrode धारक के दबाव के बंदरगाह के लिए 5 मिलीलीटर सिरिंज देते हैं और microelectrode धारक घंटी समाधान से भरा हुआ है कि यह सुनिश्चित करने के लिए इसका इस्तेमाल करते हैं। घंटी समाधान के साथ भरा माइक्रो-फिल और 1 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग, टिप से micropipette का गिलास भरने और कोई बुलबुले मौजूद हैं कि सुनिश्चित करते हैं।
  5. बिजली तार सीधे रखने के लिए सावधान किया जा रहा है, microelectrode धारक को कांच micropipette संलग्न। एक बार, सुरक्षित समाधान की एक छोटी राशि नोक पर दिखाई देता है जब तक ध्यान से microelectrode के माध्यम से घंटी समाधान के लिए मजबूर करने के लिए 5 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करें। Micropipette टिप में, धूल या नमक संचय के कारण हवाई बुलबुले, साथ ही occlusions के गठन को रोकने जाएगा (कॉर्निया के लिए लागू नहीं है जब) सिरिंज के लिए दबाव की समसामयिक आवेदन।
    1. समाधान एक धारा के रूप में बाहर आता है, जी की जगहलड़की micropipette, टिप खोलने बहुत बड़ी है या क्षतिग्रस्त हो जाता है।
  6. ध्यान से micromanipulator में रिकॉर्डिंग microelectrode जगह और रिकॉर्डिंग प्रणाली का नेतृत्व करने देते हैं।

6. Electroretinogram विश्लेषण

नोट: रिकॉर्डिंग के लिए तैयारी अप्रत्यक्ष सफेद रोशनी के निम्न स्तर के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं जब लार्वा रेटिना के कोन प्रभुत्व के लिए, उच्च गुणवत्ता एर्ग परिणाम प्राप्त किया जा सकता है कारण (<1 लक्स) या साथ संक्षिप्त अवधि के उच्च तीव्रता का (<1 मिनट) ( ≤250 लक्स) काम कर रहे प्रकाश। तमोनुकूलन की एक छोटी अवधि अभी भी रिकॉर्डिंग करने से पहले आवश्यक है (कदम 6.7 देखें)। हालांकि, प्रयोगों एक अवरक्त के प्रति संवेदनशील कैमरे का उपयोग मंद लाल या अवरक्त प्रकाश के तहत किया जा सकता है। सभी प्रयोगों यूएनसी Zebrafish एक्वाकल्चर सुविधा से फिल्टर निष्फल (0.22) प्रणाली पानी में प्रदर्शन किया गया है, लेकिन वैकल्पिक भ्रूण मीडिया का इस्तेमाल किया जा सकता है।

  1. लगभग एक मापने कट कागज तौलिया चौकों2 सेमी।
  2. पृथक कोन बड़े पैमाने पर रिसेप्टर संभावित मापने है, तो 5 मिनट के लिए 500 माइक्रोन (±) -2-एमिनो-4-phosphonobutyric एसिड (एपीबी) के साथ प्रणाली के पानी में 3-5 लार्वा सेते हैं।
    नोट: एपीबी एक सक्रिय (एल) के racemic मिश्रण और AP4 के निष्क्रिय (आर) के रूपों है, यह एल AP4 के रूप में प्रभावी है और कम खर्चीला है।
  3. 0.02% अनुत्तरदायी, के बारे में 1-2 मिनट तक (डब्ल्यू / वी) Tricaine के साथ प्रणाली के पानी में 3-5 लार्वा anesthetize।
  4. ध्यान से न्यूनतम रोशनी (<1 मिनट के लिए ≤250 लक्स) का उपयोग कर एक विदारक स्टिरियोस्कोप के तहत कागज तौलिया चौराहों पर अलग-अलग लार्वा हस्तांतरण करने के लिए एक पाश्चर विंदुक और पिपेट पंप का प्रयोग करें। प्रत्येक लार्वा की स्थिति की जाँच करें और एक unoccluded आँख के साथ पृष्ठीय पक्ष है कि एक उम्मीदवार का चयन करें।
    1. विस्तारित रिकॉर्डिंग (> 30 मिनट) के लिए, करने के लिए शरीर को ग्लेज़िंग लेकिन ठीक एक ऊंट-बाल ब्रश का उपयोग कर 3% methylcellulose के साथ सिर सहित नहीं द्वारा नम लार्वा रहते हैं।
  5. संदंश का प्रयोग, कागज तौलिया squar हस्तांतरणनम PVA स्पंज करने के लार्वा के साथ ई।
    1. विस्तारित रिकॉर्डिंग (> 30 मिनट) के लिए, आसुत जल से युक्त एक तरफ हाथ कुप्पी में एक airstone के माध्यम से गैस बुदबुदाती द्वारा लार्वा पर ​​पानी संतृप्त 100% ओ 2 गैस की एक सतत स्ट्रीम लागू होते हैं। लार्वा के सिर के पास humidified ऑक्सीजन बता देते हैं कि कुप्पी की ओर हाथ के बाहर निकलने ट्यूबिंग स्थिति।
      नोट: चरण 6.4.1 और कदम 6.5.1 मछली 16 के जीवन को लम्बा होगा।
  6. कम से कम रोशनी के तहत, नाक और आंख की दुम सिरों के बीच मध्य में microelectrode टिप स्थिति के लिए micromanipulator और कैमरे का उपयोग करें और कॉर्निया की पृष्ठीय सीमा पर दबाएँ धीरे।
    नोट: कॉर्निया के दूर के बाहर के क्षेत्रों के लिए इलेक्ट्रोड टिप के गुम उलट polarity के एर्ग waveforms में परिणाम कर सकते हैं।
  7. करने के लार्वा 5-10 मिनट के लिए डार्क अनुकूल अनुमति दें।
  8. Avai का उपयोग कर एक एलईडी प्रकाश स्रोत या ऑप्टिकल उत्तेजक से प्रदान की रोशनी करने के लिए रिकॉर्ड परीक्षण फ्लैश प्रतिक्रियाएंlable उत्तेजना और रिकॉर्डिंग उपकरण। ऐसे फ़्लैश तीव्रता, फ्लैश लंबाई, फ्लैश रंग, पृष्ठभूमि तीव्रता और प्रयोग फिट करने के लिए रंग और फिल्टर सेटिंग्स के रूप में प्रोटोकॉल मापदंडों को समायोजित करें।
  9. प्रयोग के साथ समाप्त हो, AVMA / IACUC दिशा निर्देशों के अनुसार लार्वा euthanize।

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Representative Results

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आमतौर पर, ERGs अध्ययन का एक नंबर इस चरण 9, 16,20 में एर्ग रिकॉर्डिंग प्रकाशित किया है, के बाद से 5 DPF पर zebrafish लार्वा से दर्ज हैं। लारवल प्रतिक्रियाओं सफेद एलईडी प्रकाश की एक 20 मिसे उत्तेजना का उपयोग कर कोई पृष्ठभूमि रोशनी के साथ काले अनुकूलित शर्तों के तहत मापा गया। हम एक Ganzfeld प्रकाश उत्तेजक और कंप्यूटर नियंत्रक / रिकॉर्डर से मिलकर एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एर्ग प्रणाली का उपयोग किया। उत्तेजक पृष्ठभूमि और फ्लैश प्रोत्साहन दोनों के luminance नियंत्रित करने के लिए एक कसकर नियंत्रित मालिकाना पल्स चौड़ाई मॉडुलन (PWM) प्रणाली का उपयोग करता है। प्रतिक्रियाएँ डिजिटल कनवर्टर (एडीसी) के लिए एक 16-बिट अनुरूप ड्राइविंग एक हार्डवेयर विरोधी aliasing फिल्टर के साथ एक मालिकाना पूरी तरह से अंतर एम्पलीफायर का उपयोग कर दर्ज किया गया। उत्तेजना और प्रतिक्रिया रिकॉर्डिंग निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार उपकरणों के साथ शामिल मालिकाना सॉफ्टवेयर के द्वारा नियंत्रित किया गया। हमारे उपकरण एक kHz के एक नमूना दर का उपयोग करने के लिए प्रोग्राम था, डिजिटल बेसल CASCएडीई फिल्टर 0.312 हर्ट्ज और 300 हर्ट्ज, और अतिरिक्त शोर को दूर करने के लिए एक 60 हर्ट्ज निशान फिल्टर के बीच की एक bandpass करने के लिए निर्धारित किया है। काले अनुकूलित लार्वा में प्रकाश की तीव्रता में वृद्धि के साथ आयाम में बी-लहर बढ़ जाती है (चित्रा 1)। एक लहर आमतौर पर बी-लहर से छिप जाता है और मज़बूती से नहीं पाया जा सकता। बी-लहर metabotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर (mGluR6) एगोनिस्ट साथ लार्वा incubating द्वारा अवरुद्ध किया जा सकता है, चार-phosphono-butyric एसिड (एपीबी)। यह पता लगाया जा करने के लिए (या "एक लहर") कोन बड़े पैमाने पर रिसेप्टर क्षमता के लिए अनुमति देता है। प्रकाश की बढ़ती तीव्रता के साथ आयाम में इस 'एक लहर "प्रतिक्रिया बढ़ जाती है (चित्रा 2)।

अतिरिक्त लद बुनियादी दृश्य समारोह और संवेदनशीलता से परे दृश्य मापदंडों का परीक्षण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। एक दोहरी फ्लैश प्रतिमान के उपयोग के माध्यम से, एक प्रारंभिक प्रोत्साहन (चित्रा 3A) से उबरने के लिए कोन photoresponse की क्षमता उपाय कर सकते हैं। Interstimulus अंतराल के रूप में(आईएसआई) प्रारंभिक प्रोत्साहन (3B चित्रा) से वसूली का संकेत है, दूसरी प्रतिक्रिया बढ़ जाती है के आयाम बढ़ जाती है। प्रस्तुत एपीबी-पृथक "एक लहर" निशान तीन sweeps के औसत रहे हैं और इसी तरह की उत्तेजना लद दो, 9,16 उपयोग zebrafish लार्वा ERGs की प्रकाशित रिपोर्ट के अनुरूप।

चित्र 1
चित्रा 1: लार्वा zebrafish DPF 5 में विशिष्ट एर्ग रिकॉर्डिंग। तीव्रता श्रृंखला काले अनुकूलित शर्तों के तहत प्राप्त हुई थी। मछली तीव्रता 1, 10, 25, 50 में 125, 250, 500, 1250, 2500 और 5000 सीडी / 2 मीटर के बराबर के साथ 20 मिसे की अवधि के लिए एलईडी सफेद प्रकाश के संपर्क में हैं। प्रकाश उत्तेजना की शुरुआत बिंदीदार खड़ी रेखा से चिह्नित है। नकारात्मक संभावित एक लहर (ऊर्ध्वाधर तीर) सकारात्मक है, जबकि भेद करना मुश्किल हैसंभावित बी-लहर (angled तीर) तरंग के प्रमुख शिखर है। एक छोटा सा फोटोवोल्टिक विरूपण साक्ष्य एक लहर की शुरुआत करने से पहले एक मामूली सकारात्मक विक्षेपन के रूप में मनाया जा सकता है। इनसेट, नाका-रशटन समीकरण 21, 22 का उपयोग करते हुए फिट किया गया है कि प्रकाश की तीव्रता में वृद्धि के साथ बी-लहर प्रतिक्रिया आयाम औसत। त्रुटि सलाखों SEM प्रतिनिधित्व करते हैं।

चित्र 2
चित्रा 2:। 5 DPF पर काले अनुकूलित शर्तों के तहत प्राप्त लार्वा zebrafish तीव्रता श्रृंखला से दर्ज एपीबी पृथक कोन बड़े पैमाने पर रिसेप्टर संभावित। प्रोत्साहन 1, 10, 25, 50 में 125, 250, 500, 1250, 2500 और 5000 सीडी / एम 2 के बराबर तीव्रता के साथ एक 20 मिसे एलईडी सफेद प्रकाश है। प्रकाश उत्तेजना की शुरुआत बिंदीदार खड़ी रेखा से चिह्नित है। संभावित पृथक कोन बड़े पैमाने पर रिसेप्टर ("एक लहर") तरंग (तीर) का प्रमुख तत्व है। एक छोटा साफोटोवोल्टिक विरूपण साक्ष्य कोन प्रतिक्रिया की शुरुआत करने से पहले एक मामूली सकारात्मक विक्षेपन के रूप में मनाया जा सकता है। इनसेट, नाका-रशटन समीकरण का उपयोग फिट किया गया है कि प्रकाश की तीव्रता में वृद्धि के साथ प्रतिक्रिया आयाम औसत। त्रुटि सलाखों SEM प्रतिनिधित्व करते हैं।

चित्र तीन
चित्रा 3:।। एक दोहरी फ्लैश प्रतिमान का उपयोग कोन बड़े पैमाने पर रिसेप्टर संभावित रिकॉर्डिंग एपीबी इलाज लार्वा DPF एक 5 1000 सीडी / 2 मीटर के एक तीव्रता के साथ सफेद प्रकाश एलईडी (स्रोत) के दो 20 मिसे चमक, प्रत्येक के अधीन था (ए) दो सेकंड के बराबर interstimulus अंतराल (आईएसआई) के साथ दो लगातार चमक के जवाब। लाइट जोखिम बिंदीदार खड़ी रेखा से चिह्नित कर रहे हैं। दूसरी प्रतिक्रिया के आयाम अधूरा प्रतिक्रिया वसूली का संकेत है, पहली प्रतिक्रिया की तुलना में कम है। (बी) अधिकतम पृथक कोन बड़े पैमाने पर रिसेप्टर poten के अनुपातप्रत्येक आईएसआई के लिए प्रारंभिक प्रोत्साहन की है कि दूसरे प्रोत्साहन की प्रतिक्रिया Tial। एक सबसे अच्छा फिट गैर रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण लागू किया गया है। आईएसआई बढ़ता है, फोटोरिसेप्टर संवेदनशीलता के प्रगतिशील वसूली का संकेत प्रारंभिक प्रोत्साहन के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए आयाम सापेक्ष में दूसरा प्रोत्साहन बढ़ जाती है के जवाब। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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इस प्रोटोकॉल में लार्वा zebrafish के एर्ग रिकॉर्डिंग के लिए एक सरल प्रक्रिया विस्तृत है। ध्यान में रखा जाना चाहिए कि प्रक्रिया के दौरान कई महत्वपूर्ण कदम यह प्रक्रिया दृश्य function.There की एक त्वरित और व्यापक परख के लिए अनुमति देता है। प्रयोग संभावित दवा उपचार के दौरान मौत को रोकने और एर्ग रिकॉर्डिंग के दौरान लंबे समय तक आजीविका सुनिश्चित करने के लिए पहले zebrafish लार्वा स्वस्थ होना चाहिए। इसके अलावा, यह प्रयोगों में उपयोग लार्वा बारीकी उम्र से मिलान कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण है। इस वजह से रेटिना (कोन उपप्रकार की, यानी अंतर विकास) और भी लार्वा के समग्र आकृति विज्ञान और शरीर विज्ञान के तेजी से विकास के लिए है। उदाहरण के लिए, उपकला वाष्पोत्सर्जन की दक्षता DPF 7 के बाद इसे और अधिक कठिन जिंदा मछली रखने के लिए बना घट जाती है। एक अन्य महत्वपूर्ण कारक रिकॉर्डिंग और संदर्भ इलेक्ट्रोड की गुणवत्ता है। किसी न किसी धार टी को रोकने के लिए कांच केशिकाओं खींच जब ध्यान रखा जाना चाहिएआईपीएस। एक micropipette microforge संकेत अधिग्रहण सुधार करने के लिए इलेक्ट्रोड और मदद खींचा आग पॉलिश करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, एजी / AgCl इलेक्ट्रोड की गुणवत्ता बनाए रखने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। प्रयोग करने के बाद, वे तुरंत सूख आसुत जल और हवा के साथ rinsed होना चाहिए। (गहरे लाल रंग के लिए पीले रंग) कलंकित या खड़ा इलेक्ट्रोड से बचा जाना चाहिए, प्रदर्शन को प्रभावित कर समय के साथ होते हैं और नहीं कर सकते इलेक्ट्रोड की बाहरी सतह का काला है। प्रोटीन संदूषण प्रतिकूल इलेक्ट्रोड व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं, हाथों से निपटने के इलेक्ट्रोड से बचें। अंत में, यह एजी / AgCl इलेक्ट्रोड सहज हैं और संरक्षित नहीं अगर फ्लैश कलाकृतियों को जन्म दे सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। हालांकि, हम कम से कम होना करने के लिए इन कलाकृतियों मिल गया है (1 आंकड़े को किंवदंतियों और देखना 2) और उत्तेजनाओं फ्लैश करने के लिए लार्वा zebrafish प्रतिक्रियाओं के बारे में हमारी माप के साथ हस्तक्षेप नहीं करते। वैकल्पिक रूप से, एक नमक पुल एक अगर एसए के माध्यम से स्पंज करने के लिए एजी / AgCl इलेक्ट्रोड कनेक्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैलेफ्टिनेंट पुल प्रकाश पथ से बाहर इलेक्ट्रोड स्थानांतरित करने के लिए। एक नमक पुल इलेक्ट्रोड संभावित 23 को स्थिर करने के लिए प्रत्यक्ष वर्तमान (डीसी) रिकॉर्डिंग में इस्तेमाल किया जाता है, एर्ग रिकॉर्डिंग वर्तमान (एसी) बारी का इस्तेमाल करता। विशेष स्थापना जगह की कमी या विशेष रूप से मजबूत फोटोवोल्टिक कलाकृतियों की है, इसलिए इस प्रणाली में एक नमक पुल का एकमात्र उद्देश्य होगा।

एर्ग दृश्य समारोह को मापने के लिए अन्य तकनीकों पर कई फायदे हैं। प्राथमिक लाभ यह है कि एक vivo में रिकॉर्डिंग है। नुकसान यह है कि रेटिना में फोटोरिसेप्टर और अन्य कोशिकाओं के सक्शन इलेक्ट्रोड या पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए मामला होगा के रूप में विशिष्ट कोशिकाओं की गतिविधि को सीधे मापा बजाय तरंग से inferred किया जाना चाहिए। आम तौर पर, सक्शन इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग, पैच दबाना रिकॉर्डिंग और पूरे रेटिना ERGs औषधीय एजेंटों आसानी से आणविक घटकों को परिभाषित करने की कोशिकाओं में पेश किया जा सकता है कि फायदा हैप्रतिक्रिया की, जबकि इस स्तनधारी मॉडल का उपयोग vivo में अधिक कठिन है। ऐसे एजेंटों के लिए zebrafish लार्वा की पारगम्यता इस नुकसान पर काबू।

औषधीय एजेंटों के अभाव में काले अनुकूलित लार्वा का विश्लेषण बी-लहर का वर्चस्व एक एर्ग तरंग, अन्य समूहों के 2, 9,24 -26 के एक नंबर के द्वारा देखा गया है कि एक परिणाम पैदा करता है। हम लार्वा zebrafish घुसना करने के लिए औषधीय एजेंटों की क्षमता का लाभ लेने से कोन बड़े पैमाने पर रिसेप्टर संभावित को अलग करने की क्षमता प्रदर्शित करता है। एपीबी के साथ इलाज लार्वा "एक लहर" 14-17 देखे जा करने की इजाजत दी, बी-लहर का निराकरण प्रदर्शित करते हैं। शोर अनुपात करने के लिए उत्कृष्ट संकेत के साथ waveforms 3 sweeps के औसत से प्राप्त किया गया। प्रतिक्रिया waveforms में भिन्नता का उल्लेख किया है, कभी कभी होता है, लेकिन Makhankov एट अल। दो ही जानवर से दोहराया माप में विचरण कम है सूचित किया है किव्यक्तियों के बीच देखा है कि अधिक से। इसलिए, विचरण तकनीक में जैविक विभिन्नता के बजाय परिवर्तनशीलता का परिणाम होने की संभावना है।

हम भी पृष्ठभूमि रोशनी 9, 16 की उपस्थिति और अनुपस्थिति में प्रकाशित परिणामों के समान एक दोहरी फ्लैश प्रतिमान का उपयोग vivo में कोन वसूली की जांच करने के एर्ग विश्लेषण का उपयोग किया। यह आईएसआई बदलती के लगातार चमक का जवाब करने के लार्वा रेटिना की क्षमता को मापने के द्वारा पूरा किया गया। TALENS मार्ग लक्ष्यों बाहर दस्तक करने के लिए के रूप में औषधीय एजेंटों या इस तरह के जीनोम इंजीनियरिंग रणनीतियों के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया, zebrafish कोन अनुकूलन और दृश्य वसूली की आणविक यांत्रिकी के vivo अध्ययन के लिए शक्तिशाली प्रणाली है।

हमारे प्रक्रिया और उपकरणों को आसानी से 28 पृथक लार्वा आँखें, पुराने zebrafish या अन्य रीढ़ 27 जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। वास्तव में, एर्ग उत्तेजना और रिकॉर्डिंग प्रणालीहम मुख्य रूप से चूहों पर प्रयोग के लिए संशोधित फिर एक नैदानिक ​​सेटिंग में इस्तेमाल के लिए डिजाइन किया गया था और है कि रोजगार। Zebrafish लार्वा के लिए मंच आदत डाल सीधा था और आसानी से कम लागत के लिए अन्य प्रयोगशालाओं में दोहराया जा सकता है। शास्त्रीय electrophysiological उपकरणों से मिलकर समान setups कम लागत के लिए निर्माण किया जा सकता है, और विश्वसनीय परिणाम 16 प्रदान करने के लिए प्रदर्शन किया गया है। कुल मिलाकर, इस तकनीक का दृश्य समारोह के तंत्र के अध्ययन के शोधकर्ताओं के लिए काफी लाभदायक है।

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Faraday cage 80/20 Inc custom Custom designed aluminum "Industrial Erector Set" for Cage framework
PVA sponge Amazon B000ZOWG1C Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae
150 ml Sterile Filter systems Corning 431154 Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes
Espion E2 Diagnosys, LLC contact Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com
Colordome Diagnosys, LLC contact Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com
Micromanipulator Drummond 3-000-024-R Holding and positioning the recording microelectrode
Magnetic ring stand Drummond 3-000-025-MB Holding and positioning of the camera and refrence electrode
Lead extensions Grass Technologies F-LX Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes
Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor Grass Technologies DF-215/10 Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins
Window screen frame (metal) and spline Lowes or Home Depot various For attaching copper mesh to Faraday cage framework
Steriflip 50 ml filters Millipore SCGP00525 Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes
BNC adaptor Monoprice 4127 Connecting camera to BNC cable
BNC cable Monoprice 626 Connecting camera to video adaptor
Camera lens Navitar 1582232 Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Camera coupler Navitar 1501149 Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Luna BNC to VGA + HDMI Converter Sewell SW-29297-PRO BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor
APB Sigma A1910 mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential
Borosilicate glass Sutter BF-150-86-10 Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821°C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter) 
P97 Flaming/Brown puller Sutter P97 For pulling glass micropipettes
Sorbothane sheet Thorlabs SB12A Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size
Breadboard Thorlabs B2436F Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen
Passive Isolation Mounts Thorlabs PWA074 Provides vibration isolation to breadboard
Copper mesh TWP 022X022C0150W36T To line Faraday Cage
Pipette pump VWR 53502-233 Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae
Pasteur pipettes VWR 14672-608 Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae
Camera Watec WAT-902B Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea
Tricaine (MS-222) Western Chemical Tricaine-S Pharmaceutical-grade anesthetic,
Micro-fil WPI MF28G-5 Filling microelectrode holder and microelectrode glass
Microelectrode holder WPI MEH2SW15 Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment
Reference Electrode WPI DRIREF-5SH Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode
Reference Electrode (alternative) WPI EP1 Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead
Low-noise cable for Microelectrode holder WPI 13620 Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard

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References

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Zebrafish लार्वा में दृश्य प्रतिक्रिया के Electroretinogram विश्लेषण
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Chrispell, J. D., Rebrik, T. I., Weiss, E. R. Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (97), e52662, doi:10.3791/52662 (2015).More

Chrispell, J. D., Rebrik, T. I., Weiss, E. R. Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (97), e52662, doi:10.3791/52662 (2015).

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