Abstract
Электроретинограммы (ERG) является неинвазивного электрофизиологического метода определения функции сетчатки. Путем размещения электрода на поверхности роговицы, электрической активности генерируется в ответ на света может быть измерена и использована для оценки активности клеток сетчатки в естественных условиях. Эта рукопись описывает использование ЭРГ для измерения зрительную функцию у рыбок данио. Данио рерио уже давно используется в качестве модели для позвоночных развития из-за легкости подавления генов с помощью морфолино олигонуклеотидов и фармакологической манипуляции. У 5-10 DPF, только шишки функционал в личиночной сетчатки. Таким образом, данио, в отличие от других животных, является мощным модельной системой для изучения конуса зрительной функции в живом организме. Этот протокол использует стандартный анестезии, микроманипуляция и стереомикроскопия протоколы, которые являются общими в лаборатории, которые проводят данио исследования. Изложенные методы использовать стандартный электрофизиологии эквоборудования, а также малой освещенности для направления размещения записи микроэлектрода на личиночной роговицы. Наконец, показано, как коммерчески доступный ЭРГ стимулятор / записывающее устройство первоначально разработана для использования с мышами могут быть легко адаптированы для использования с данио. ERG личинок рыбок данио обеспечивает отличную метод опробования конуса зрительную функцию у животных, которые были изменены морфолиновой инъекции олигонуклеотидов, а также новые технические методы, генома, такие как цинковый палец нуклеаз (ZFNs), активатора транскрипции-Like Effector Нуклеазы (Таленс), и Кластерные Регулярно Interspaced Короткие палиндромную повторов (CRISPR) / Cas9, все из которых привели к значительному увеличению эффективности и действенности генного таргетинга у рыбок данио. Кроме того, мы воспользуемся возможностью фармакологических агентов проникнуть данио личинки оценить молекулярные компоненты, которые способствуют фотоотклике. Этот протокол описывает установку, которая может быть изменена и используется исследователямис различных экспериментальных целей.
Introduction
Электроретинограммы (ERG) является неинвазивного электрофизиологического метода, который широко используется в клинике для определения функции сетчатки у людей. Электрической активности в ответ на световой раздражитель измеряется путем помещения записи электродов на внешней поверхности роговицы. Характеристики стимула парадигмы и сигнала отклика определить нейронов сетчатки, способствующих ответ. Этот метод был адаптирован для использования с рядом моделей животных, включая мышей и данио. Типичный позвоночных ответ ERG имеет четыре основных компонента: а-волна, которая роговица-отрицательный потенциал происходит от фоторецепторов активности клеток; б-волна, роговица-положительный потенциал происходит от биполярного клеток; D-Wave, роговица-положительный потенциал интерпретируется как деятельности ВЫКЛ биполярных клеток; и C-волна, которая наступает через несколько секунд после того, как б-волны и отражает деятельность в Müller глии и в отставкеИнал пигментный эпителий 1-4. Дополнительные ссылки для понимания истории и принципы анализа ERG в организме человека и модельных животных онлайн учебник, WebVision из Университета штата Юта и текстов, таких как Принципы и практика клинического электрофизиологии Видение 4, 5.
Danio rerio (данио) уже давно выступает в качестве модели для позвоночных развития, в связи с быстрым созреванием и прозрачность, что позволяет для неинвазивной морфологического анализа систем органов, поведенческих тестов и прямом и обратном генетических экранов (для обзора см Fadool и Даулинг 6). Данио рерио личинки очень поддается генетической и фармакологической манипуляции, которые, в сочетании с их высокой плодовитостью, сделать их отличная модель животного для высокопроизводительного биологического анализа. Чем выше отношение конусам, чтобы стержней в личиночной данио - примерно 1: 1 по сравнению с мышами (~ 3% конусаS) - делают их особенно полезными при изучении функции конуса 7-9.
В сетчатки позвоночных, конусы развивать до стержней 10. Интересно, что данио конусы действуют уже в 4 денье, позволяя селективного электрофизиологического анализа конусов на этом этапе 6, 11,12. В отличие от этого, ответы эрг стержней появляются между 11 и 21 DPF 13. Таким образом, данио личинки 4-7 DPF служить функционально, как все-конуса сетчатки. Тем не менее, родной фотопического ERG ответ 4-7 DPF личинок преобладают б-волны. Применение фармакологических агентов, таких как L - (+) - 2-амино-4-фосфоно-масл ную кислоту (L-АР4), агонист для метаботропного глутамата (mGluR6) рецептора выражается ПО биполярных клеток, эффективно блокирует генерации В-волны и раскрывает изолированный рецепторный потенциал конус массу, ("волны") 14-17.
Здесь мы опишем простой и reliablе метод анализа ERG с использованием коммерчески доступного ERG оборудование, предназначенное для использования с мышами, которые были адаптированы для использования с данио личинок. Эта система может быть использована на данио личинок различной генетический фон, а также у пациентов, получавших фармакологических агентов, чтобы помочь исследователей в определении путей, которые способствуют визуальной чувствительности и световой сигнализации 16 адаптации. Экспериментальные методики, изложенные в этом протоколе поможет следователям в использовании анализа ERG, чтобы ответить на различные биологические вопросов, относящихся к видению, а также продемонстрировать строительство гибкой настройки ERG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Животное содержание и экспериментальные протоколы были одобрены уходу и использованию Институциональные комитеты животных университета Северной Каролины в Чапел-Хилл, и отвечают всем требованиям NIH Управления лабораторных животных благосостояния и ассоциации по оценке и аккредитации лаборатории по уходу за животными International.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения личинок для анализа ERG, опубликованные протоколы для стандартного данио хозяйства и обслуживания были заняты 18. Личинки получают путем естественного размножения и размещены под 14 ч света / 10 ч темноты. Этот протокол был оптимизирован для личинок 5-7 дней после оплодотворения (DPF), но может быть идеально осуществляется на старшей рыбы с небольшими изменениями в процедуре. Здесь использование штамма TL дикого типа данио личинок 5 DPF.
1. Микропипетки Производство
- Потяните несколько микропипетки с помощью 1,5 х 0,86 мм (наружный диаметр по внутреннему диаметру) огневой полировкой боросиликатного стекла капилляров снить (температура плавления 821 ° C) и P-97 Flaming / коричневый микропипетки Puller оснащены коробка тепла нити. Используйте программу для вылепляя микропипетки, описанные в таблице 1.
- Проверьте каждый микропипетку под микроскопом с соответствующим координатной сетки правителя для того, чтобы советы 10-15 мкм в диаметре и имеет плавное открывание наконечник (то есть не зазубренными краями).
- Тщательно храните микропипетки для предотвращения повреждений наконечника и воздействия пыли. Параметры хранения включают чашки Петри с лабораторного ленты, с подкладкой из пенопласта коробки, или коммерчески доступных контейнеров для хранения микропипетка.
Примечание: Другие микропипетки съемники и стеклянные капилляры могут быть использованы до тех пор, как правильный диаметр микропипетки и наконечник высокого качества достигается.
| Давление | Тепло | Тянуть | Скорость Время | |
| 500 | 560 | - | 30 | 200 |
| 500 | 450 | - | 30 | 200 |
| 500 | 410 | 55 | 40 | 200 |
Таблица 1: Программа для производства микропипетки с использованием P-97 Пламенный / коричневый микропипетки съемник, снабженную окно тепловой нити Микропипетки изготовлены с использованием 1,5 х 1,0 мм 2 (наружный диаметр по внутреннему диаметру) огневой полировкой боросиликатного стекла капилляров с нитью. (температура плавления, 821 ° С).
2. Подготовка буфера
- Используйте фильтруют, буфер кислородом золотых рыбок Рингера 19 в микроэлектродов капилляра и насытить поливиниловый спирт (ПВС) губку, на которую помещены личинки для экспериментов. Кроме того, использование E3 эмбрион СМИ или сбалансированный солевой раствор Хенкса.
- Получают раствор 10x золотых рыбок Рингера, как описано в таблице 2. доведения рН до 7,8, и стерилизуют с использованием фильтра 0,22 мкм и хранить 10x запас при 4 ° С.
- Создание рабочего раствора в день эксперимента путем разбавления раствора с 10-кратным Рингера до 1 раза деионизированной, дистиллированной воды. Фильтр с использованием системы фильтр 0,22 мкм. Кислородсодержащих барботажем 95% O 2/5% CO 2 газ в течение 10 минут. Крышка плотно после для того, чтобы решение остается кислородом.
| NaCl | 1,25 M |
| KCl | 26 мм |
| CaCl 2 | 25 мм |
| MgCl 2 | 10 мм |
| глюкоза | 100 мМ |
| HEPES | 100 мМ |
3. электроретинограммы Платформа
- Выполнение ЭРГ эксперименты на столе амортизирующего внутри клетки Фарадея, чтобы улучшить отношение сигнал-шум. Прикрепите пользовательские стальная платформа с таблицей анти-вибрации с помощью гайки. Разместить подвижную платформу с пластиковой вязкоупругого уретана полимер амортизирующим нижней на столе под источником света.
- Установите камеру с намагниченной стенде, направленных вниз, на подвижной пластиковой платформе. Установите микроманипулятор (который будет содержать записи микроэлектрода) со вторым намагниченной Встаньте справа подвижного пластиковой платформе. Убедитесь, что камера и микроманипулятор не будет беспокоить движения другого оборудования, и что они не блокируют освещение от источника света.
- Подключите камеру к видео монитор и установите его для просмотра глазЛичинка для размещения электрода в правильном положении.
- Убедитесь, что установка должным образом заземлен с медной проволокой. Чтобы проверить шум, поместите электрод сравнения и кончик записи микроэлектродом в 35 мм чашки Петри, заполненную раствором Рингера. Проверьте электрические уровень шума установки с помощью осциллографа или встроенную функцию аппарата ERG. Уровень шума должен быть не более ± 10 мкВ от базовой линии.
4. Губка Подготовка
- Вырезать небольшой прямоугольник сухого ПВА губка, которая будет плотно прилегать в 35 мм чашки Петри. Толщина губки не должны быть больше, чем глубина чашки. Используйте нож с чистой бритвой для резки.
- Сделать дополнительный разрез в губку, чтобы разместить электрод сравнения (либо мелкой разрезают вдоль по нижней части губки или бабочки сократить вертикально через одну из меньших сторон).
- Используйте химически стойкого маркерчтобы отметить маленькую точку на губке (где будут размещены личинка), которые могут быть использованы для позиционирования камеры.
- Замочите губку ПВА в растворе Рингера до насыщения. Снимите и быстро пятном на бумажное полотенце 2-3 раза. Поместите губку в чистой 35 мм чашки Петри.
- Установите чашку Петри, содержащую губку на пластиковой платформе, такой, что знак могут быть визуализированы с помощью камеры.
5. Подготовка электрода
Примечание: данио установка состоит из электрода в контакте с раствором, насыщенным PVA губки Рингера и записи электрода в контакте с роговицей. Электрод состоит из гранул Ag / AgCl. Электрод записи вытащил стекло микропипетка заполнена раствором Рингера и провел держателем микроэлектродов, содержащего провод Ag.
- Хлорида электроды путем замачивания их в 6-9 гипохлорита% натрия (отбеливатель) в течение 5 мин (запись mıcroelectrode проволоки) или 15 мин (электрод сравнения). Воздух сухой на Kimwipe в течение 5 мин.
- В зависимости от стиля надреза в шаге 4.2, установите Ag / AgCl осадок опорного электрода в (для вертикального разреза бабочки) или под (для мелкой разрезать вдоль на дне) губки. Прикрепите электродный провод к системе записи.
- С другой стороны, если установка ЭРГ имеет пространственных ограничений или есть особо прочные фотоэлектрические артефакты из электрода Ag / AgCl, соединить электрод на губку с помощью агаровой солевого мостика, чтобы переместить электрод из пути прохождения света.
- Прикрепите ~ 40 см подходящего размера трубы до 5 мл, не Luer замок шприцев. Заполните шприц с раствором Рингера. Держатели Микроэлектродные, обладающие порты давления, как правило, поставляются с адаптерами для размещения трубопроводов с внутренними диаметрами 1/16 ", 3/32", 1/8 "или 5/32".
- Заполните 1 мл нон-люэровского шприц сРаствор Рингера и, используя микро-фил, внимательно заполните держатель микроэлектродного. Не допускать образование пузырьков.
- Прикрепите шприц 5 мл с портом давления держателя микроэлектродов с трубкой и использовать его, чтобы убедиться, что держатель микроэлектрод полна раствор Рингера. Использование Micro-фил и 1-мл шприц, наполненный раствором Рингера, заполнить микропипетки стекла от кончика и обеспечить, чтобы не было пузырей нет.
- Прикрепите стекло микропипетки в держатель микроэлектродов, будьте осторожны, чтобы электродной проволоки прямой. После защиты использовать шприц 5 мл тщательно заставить раствор Рингера через микроэлектрода до небольшое количество раствора не видна на кончике. Иногда приложение давления к шприцу (если не применяется к роговице) предотвратит образование пузырьков воздуха, а также окклюзии из-за пыли или накопления соли, на кончике микропипетки.
- Если решение выходит в виде потока, заменить гдевушка микропипетка, как открытый, слишком большой или поврежден.
- Осторожно положите микроэлектрод записи в микроманипулятором и прикрепите провод к системе записи.
6. Анализ электроретинограммы
ПРИМЕЧАНИЕ: В связи с конусом доминирования личиночной сетчатки, высокое качество результатов ERG могут быть получены при подготовке к записи выполняются при низких уровнях косвенного белого света (<1 лк) или с короткими периодами (<1 мин) более высокой интенсивности ( ≤250 люкс) рабочее освещение. Короткий период адаптации к темноте по-прежнему требуется до записи (см шаг 6,7). Тем не менее, эксперименты могут быть выполнены при тусклом красном или инфракрасном свете с помощью инфракрасной чувствительная камера. Все эксперименты проводились в стерилизованным фильтрацией (0,22 мкм) системы воды из UNC данио рерио аквакультуры среды, но альтернативные носители эмбрион может быть использован.
- Вырежьте квадраты бумажного полотенца размером примерно 1см 2.
- Если измерения изолированных рецепторного потенциала конуса массы, инкубировать 3-5 личинок в воде системы с 500 мкМ (±) -2-амино-4-phosphonobutyric кислоты (APB) в течение 5 мин.
Примечание: В то время как АПБ представляет собой рацемическую смесь активного (L) и неактивные (R) формы AP4, это же эффективным, как L-AP4 и дешевле. - Обезболить 3-5 личинок в воде системы с 0,02% (вес / объем) до Tricaine отвечает, около 1-2 мин.
- Используйте пипетку Пастера и пипетки насос тщательно передачи индивидуальный личинок на бумажные полотенца квадратов под рассекает стереоскоп, используя минимальное освещение (≤250 люкс для <1 мин). Проверьте положение каждого личинки и выбрать кандидата, который является спинной стороной вверх с unoccluded глаза.
- При длительном записи (> 30 мин), держать личинки влажной остеклением тело до, но не включая голову 3% метилцеллюлозы с помощью тонкой верблюжьей шерсти.
- Использование щипцов, передача бумажных полотенец Squarе с личинки на влажной ПВА губки.
- Для расширенных записей (> 30 мин), применяются непрерывный поток воды, насыщенной 100% O 2 газа над личинки барботированием газа через airstone в боковой рукоятки колбу, содержащую дистиллированную воду. Расположите трубку из колбы боковой рычаг, который передает увлажненного кислорода вблизи головы личинки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 6.4.1 и шаг 6.5.1 продлит жизнь рыбы 16.
- Для расширенных записей (> 30 мин), применяются непрерывный поток воды, насыщенной 100% O 2 газа над личинки барботированием газа через airstone в боковой рукоятки колбу, содержащую дистиллированную воду. Расположите трубку из колбы боковой рычаг, который передает увлажненного кислорода вблизи головы личинки.
- При минимальных освещения, используйте микроманипулятора и камеру для позиционирования зонда микроэлектродного в середине между носовой и хвостовой концы глаза и слегка нажмите на спинной границе роговицы.
ПРИМЕЧАНИЕ: смещениям кончика электрода к далеко дистальных отделах роговицы может привести к ЭРГ сигналов обратной полярности. - Разрешить личинка до темно-адаптации в течение 5-10 мин.
- Запись тест флэш ответы на свете, предоставленного из светодиодного источника света или оптического стимулятор, используя Avaíэтикетку стимулирование и записывающие устройства. Отрегулируйте параметры протоколов, такие как интенсивность вспышки, длиной вспышка, вспышка цвета, интенсивности фона и цвета и параметры фильтра, чтобы соответствовать эксперимент.
- После завершения эксперимента, усыпить личинки в соответствии с директивами AVMA / IACUC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Как правило, эрг, записанные на рыбок данио личинок 5 DPF, так как ряд исследований опубликованы ЭРГ записи на данном этапе 9, 16,20. Личиночные ответы были измерены в соответствии адаптируются к темноте условиях без фоновой подсветки с использованием 20 мс стимул белый светодиод. Мы использовали имеющийся в продаже ERG систему, состоящую из Ganzfeld света стимулятора и компьютерной контроллера / регистратора. Стимулятор использует жестко контролируется импульсная модуляция (ШИМ) системы собственностью импульса для управления яркостью как фон и вспышки раздражения. Ответы были записаны с использованием запатентованной полностью дифференциальный усилитель с аппаратным сглаживающего фильтра рулем 16-битный аналого-цифровой преобразователь (АЦП). Стимул и реакция записи были под контролем проприетарного программного обеспечения в комплекте с оборудованием в соответствии с протоколом производителя. Наше оборудование было запрограммировано, чтобы использовать частоту дискретизации 1 кГц, цифровой Бесселя CASCADE фильтры установлен в полосе пропускания в диапазоне от 0,312 Гц и 300 Гц, и 60 Гц режекторного фильтра, чтобы удалить избыточный шум. В темно-адаптированы личинки Б-волн увеличивается по амплитуде с ростом интенсивности света (рисунок 1). Волны, как правило, скрыты от б-волны и не может быть надежно обнаружен. Б-волна может быть заблокирована путем инкубации личинок с метаботропный рецептора глутамата (mGluR6) агониста, 4-фосфоно-масл ную кислоту (АПБ). Это позволяет рецепторного потенциала массового конуса (или "волны"), чтобы быть обнаружены. Это "волны" увеличивается реагирования по амплитуде с ростом интенсивности света (рисунок 2).
Дополнительные парадигмы могут быть использованы для проверки визуальных параметров за пределы основной зрительной функции и чувствительности. Благодаря использованию двойной флэш-парадигмы, можно измерить способность конуса фотоотклике, чтобы оправиться от первоначального раздражителя (рис 3а). Как межстимульный интервала(ISI), увеличивается, амплитуда второго возрастает реагирования, что указывает на восстановление после первоначального стимула (фиг.3В). В APB-изолированные "волны" следы Представлены среднем три зачисток и соответствовать опубликованные отчеты данио личинок эрг, использующих подобные стимуляции парадигмы 2, 9,16.
Рисунок 1: Типичная запись ERG в 5 DPF личинок рыбок данио. Серия интенсивность была получена при адаптируются к темноте условиях. Рыба подвергаются светодиодный Белый свет для продолжительности 20 мс с интенсивностями, равная 1, 10, 25, 50 125, 250, 500, 1250, 2500 и 5000 кд / м 2. Начало световой раздражитель обозначается пунктирной вертикальной линии. Отрицательный потенциал волны (вертикальная стрелка) трудно отличить, в то время как положительноеПотенциал б-волна (под углом стрелка) является доминирующим пик волны. Небольшой фотоэлектрической артефакт можно наблюдать как незначительные положительном отклонении до появления а-волны. Вставка, в среднем амплитуды отклика B-волны при увеличении интенсивности света, которые были соответствовать используя уравнение Нака-Rushton 21, 22. Усы представляют SEM.
Рисунок 2: APB-изолированные конус масса рецепторный потенциал записывается личинками данио серии интенсивности, полученным под темно-адаптированы условиях при 5 DPF.. Стимул 20 мс LED белый свет с интенсивностью, равных 1, 10, 25, 50 125, 250, 500, 1250, 2500 и 5000 кд / м 2. Начало световой стимуляции обозначается пунктирной вертикальной линии. Изолированных конус масса рецепторный потенциал ("волна") является доминирующим элементом сигнала (стрелка). Небольшойфотоэлектрические артефакт можно наблюдать как незначительные положительном отклонении до появления реакции конуса. Вставка, в среднем амплитуды отклика с увеличением интенсивности света, которые были соответствовать используя уравнение Naka-Rushton. Усы представляют SEM.
Рисунок 3:.. Масса рецепторный потенциал записи конуса с использованием двойной вспышкой парадигму 5 DPF APB обработанной личинки был подвергнут двух 20 мс вспышки белого света (LED источник), каждый с интенсивностью 1000 кд / м 2 () Ответ на 2 последовательных вспышек с межстимульный интервале (ISI), равной 2 сек. Легкие воздействия отмечены пунктирными вертикальными линиями. Амплитуда второй ответ ниже, чем в первой реакции, что указывает на неполное восстановление ответа. (B) отношение максимальной POTEN масса рецептора изолированные конусасительной реакцию второй стимул к количеству исходного стимула для каждого ISI. Наиболее подходящая анализ нелинейной регрессии был применен. По мере увеличения ISI, ответ на второй увеличивается стимулом в относительной амплитуды к ответу на Первоначальным стимулом указанием постепенное восстановление чувствительности фоторецепторов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе простая процедура ERG записи личинок рыбок данио подробно. Эта процедура позволяет быстро и всестороннего анализа визуального function.There несколько важных шагов в течение всей процедуры, которые должны храниться в памяти. Личинки данио должны быть здоровыми, прежде чем эксперимент, чтобы предотвратить смерть во время возможных медикаментозного лечения и обеспечить длительную средств к существованию во время записи ЭРГ. Кроме того, важно, что личинки используют в экспериментах тесно соответствующего возраста. Это связано с быстрым развитием сетчатки (т.е., дифференциал развития конуса подтипов), а также общей морфологии и физиологии личинок. Например, после 7 DPF эффективности эпителия транспирации уменьшается, что делает его более трудным держать рыбу живым. Другим важным фактором является качество записи и электродов сравнения. Необходимо соблюдать осторожность при извлечении стеклянных капиллярах, чтобы предотвратить грубое краями тIPS. Микропипетка microforge может быть использована для тушения ногтей вытащил электроды и помощь, чтобы улучшить обнаружение сигнала. Кроме того, поддержание качества электродов Ag / AgCl является очень важным. После использования, они должны быть промыты дистиллированной водой и сушили на воздухе сразу же. В то время как потемнение наружной поверхности электродов может происходить с течением времени и не влияет на производительность, запятнали (от желтого до темно-красного) или косточек электроды следует избегать. Избегать контакта с электродами с голыми руками, так как загрязнение белка может отрицательно влиять на поведение электрода. Наконец, следует отметить, что Ag / AgCl электроды светочувствительного и может привести к флэш-артефактов, если не защищены. Тем не менее, мы нашли эти артефакты, чтобы быть минимальным (см легенды к рисункам 1 и 2) и не вмешиваться в наши измерения личиночной данио ответов на флэш-стимулы. В качестве альтернативы, соль мост может быть использован для подключения к Ag / AgCl электрода губки с помощью агаровой SALt мост, чтобы переместить электрод из пути света. Хотя солевой мостик используется в постоянного тока (DC) записей для стабилизации потенциала электрода 23, записи ERG утилизирует переменного тока (AC). Поэтому единственная цель солевого мостика в этой системе было бы, если конкретную установку имеет пространственных ограничений или особенно сильные фотоэлектрических артефакты.
ERG имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методами для оценки зрительной функции. Основным преимуществом является то, что записи в естественных условиях. Недостатком является то, что активность определенных клеток должны быть выведены из сигнала, а не непосредственно измеренного, как было бы в случае для всасывания электрод или патч зажим записи фоторецепторов и других клеток в сетчатке. Как правило, всасывающий электрод записи, патч зажим записи и вся сетчатка эрг имеют то преимущество, что фармакологические агенты могут быть легко введены в клетки, чтобы определить молекулярные компонентыответа, в то время как это труднее в естественных условиях с использованием модели млекопитающих. Проницаемость данио личинок на такие агенты преодолевает этот недостаток.
Анализ темно-адаптированы личинок в отсутствие фармакологических агентов производит волны ЭРГ преобладают б-волны, результат, который был наблюдались в ряде других групп 2, 9,24 -26. Мы демонстрируем возможность изолировать рецепторный потенциал конус массовой воспользовавшись возможностью фармакологических агентов проникнуть личинок данио. Личинки обрабатывали APB отображать отмену б-волны, что позволяет "волны" для визуализации 14-17. Формы волны с превосходной сигнал-шум получены путем усреднения 3 зачистки. Изменение формы сигналов отклика иногда отмечено, но Makhankov др. 2 сообщили, что дисперсия в повторных измерений от тех же животных меньшечем видел между людьми. Таким образом, дисперсия может быть результатом биологической вариации, а не изменчивости в технике.
Мы также использовали анализ ERG изучить восстановление конус в естественных условиях, используя двойной флэш-парадигму, аналогичную опубликованных результатов в присутствии и отсутствии фоновой подсветки 9, 16. Это было достигнуто путем измерения способности личинок сетчатки реагировать на последовательных вспышек различной ISI. При использовании в сочетании с фармакологическими препаратами или генной инженерии стратегий, таких как Talens выбить направлениями развития целей, данио является мощная система для исследования в естественных условиях молекулярной механики адаптации конуса и восстановления зрения.
Наша процедура и оборудование может быть легко адаптирован для изучения изолированных личинок глаза, старую данио или других позвоночных 27, 28. В самом деле, стимуляция и запись системы ЭРГчто мы используем был, предназначенные главным образом для использования в клинических условиях, а затем модифицированы для экспериментов на мышах. Адаптация платформу для рыбок данио личинок была простой и легко может быть воспроизведен в других лабораториях для низкой стоимости. Похожие установок, состоящих из классической электрофизиологического оборудования может быть построена для минимальной стоимости, и уже было показано, чтобы обеспечить надежные результаты 16. В целом, данная методика представляет большую пользу для исследователей, изучающих механизмы зрительной функции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Faraday cage | 80/20 Inc | custom | Custom designed aluminum "Industrial Erector Set" for Cage framework |
| PVA sponge | Amazon | B000ZOWG1C | Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae |
| 150 ml Sterile Filter systems | Corning | 431154 | Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes |
| Espion E2 | Diagnosys, LLC | contact | Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com |
| Colordome | Diagnosys, LLC | contact | Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com |
| Micromanipulator | Drummond | 3-000-024-R | Holding and positioning the recording microelectrode |
| Magnetic ring stand | Drummond | 3-000-025-MB | Holding and positioning of the camera and refrence electrode |
| Lead extensions | Grass Technologies | F-LX | Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes |
| Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor | Grass Technologies | DF-215/10 | Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins |
| Window screen frame (metal) and spline | Lowes or Home Depot | various | For attaching copper mesh to Faraday cage framework |
| Steriflip 50 ml filters | Millipore | SCGP00525 | Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes |
| BNC adaptor | Monoprice | 4127 | Connecting camera to BNC cable |
| BNC cable | Monoprice | 626 | Connecting camera to video adaptor |
| Camera lens | Navitar | 1582232 | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
| Camera coupler | Navitar | 1501149 | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
| Luna BNC to VGA + HDMI Converter | Sewell | SW-29297-PRO | BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor |
| APB | Sigma | A1910 | mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential |
| Borosilicate glass | Sutter | BF-150-86-10 | Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821°C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter) |
| P97 Flaming/Brown puller | Sutter | P97 | For pulling glass micropipettes |
| Sorbothane sheet | Thorlabs | SB12A | Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size |
| Breadboard | Thorlabs | B2436F | Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen |
| Passive Isolation Mounts | Thorlabs | PWA074 | Provides vibration isolation to breadboard |
| Copper mesh | TWP | 022X022C0150W36T | To line Faraday Cage |
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae |
| Pasteur pipettes | VWR | 14672-608 | Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae |
| Camera | Watec | WAT-902B | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
| Tricaine (MS-222) | Western Chemical | Tricaine-S | Pharmaceutical-grade anesthetic, |
| Micro-fil | WPI | MF28G-5 | Filling microelectrode holder and microelectrode glass |
| Microelectrode holder | WPI | MEH2SW15 | Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment |
| Reference Electrode | WPI | DRIREF-5SH | Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode |
| Reference Electrode (alternative) | WPI | EP1 | Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead |
| Low-noise cable for Microelectrode holder | WPI | 13620 | Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard |
References
- Dowling, J. E. The retina: an approachable part of the brain. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1987).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).
- Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. J Neurophysiol. 91, 1134-1142 (2004).
- Heckenlively, J. R., Arden, G. B. Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , 2nd edn, The MIT Press. Cambridge, MA. (2006).
- Perlman, I. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. Kolb, H., Nelson, R., Fernandez, E., Jones, B. , (1995).
- Fadool, J. M., Dowling, J. E. Zebrafish: a model system for the study of eye genetics. ProgRetin. Eye Res. 27, 89-110 (2008).
- Doerre, G., Malicki, J. Genetic analysis of photoreceptor cell development in the zebrafish retina. Mech. Dev. 110, 125-138 (2002).
- Brockerhoff, S. E., et al. Light stimulates a transducin-independent increase of cytoplasmic Ca2+ and suppression of current in cones from the zebrafish mutant nof. J Neurosci. 23, 470-480 (2003).
- Rinner, O., Makhankov, Y. V., Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C. Knockdown of cone-specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone response recovery and delayed dark adaptation. Neuron. 47, 231-242 (2005).
- Harada, T., Harada, C., Parada, L. F. Molecular regulation of visual system development: more than meets the eye. Genes Dev. 21, 367-378 (2007).
- Branchek, T. The development of photoreceptors in the zebrafish, brachydaniorerio. II. Function. J Comp Neurol. 224, 116-122 (1984).
- Schmitt, E. A., Dowling, J. E. Early retinal development in the zebrafish, Daniorerio: light and electron microscopic analyses. J Comp Neurol. 404, 515-536 (1999).
- Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish. Dev Dyn. 222, 564-570 (2001).
- Wong, K. Y., Adolph, A. R., Dowling, J. E. Retinal bipolar cell input mechanisms in giant danio. I. Electroretinographic analysis. J Neurophysiol. 93, 84-93 (2005).
- Nelson, R. F., Singla, N. A spectral model for signal elements isolated from zebrafish photopicelectroretinogram. Vis Neurosci. 26, 349-363 (2009).
- Korenbrot, J. I., Mehta, M., Tserentsoodol, N., Postlethwait, J. H., Rebrik, T. I. EML1 (CNG-modulin) controls light sensitivity in darkness and under continuous illumination in zebrafish retinal cone photoreceptors. J Neurosci. 33, 17763-17776 (2013).
- Gurevich, L., Slaughter, M. M. Comparison of the waveforms of the ON bipolar neuron and the b-wave of the electroretinogram. Vision Res. 33, 2431-2435 (1993).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Daniorerio). , 5th edn, University of Oregon Press. Portland, OR. (2007).
- Kim, D. Y., Jung, C. S. Gap junction contributions to the goldfish electroretinogram at the photopic illumination level. Korean J PhysiolPharmacol. 16, 219-224 (2012).
- Brockerhoff, S. E., Dowling, J. E., Hurley, J. B. Zebrafish retinal mutants. Vision Res. 38, 1335-1339 (1998).
- Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from colour units in the retina of fish (Cyprinidae). J Physiol. 185, 536-555 (1966).
- Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae). J Physiol. 185, 587-599 (1966).
- Shao, X. M., Feldman, J. L. Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials. J Neurosci. Methods. 159, 108-115 (2007).
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. ProcNatlAcadSci. U S A. 92, 10545-10549 (1995).
- Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish. CSH protocols. , (2008).
- Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. Ganzfeld ERG in zebrafish larvae. Doc Ophthalmol. 104, 57-68 (2002).
- Kainz, P. M., Adolph, A. R., Wong, K. Y., Dowling, J. E. Lazy eyes zebrafish mutation affects Müller glial cells, compromising photoreceptor function and causing partial blindness. J Comp Neurol. 463, 265-280 (2003).
- Lewis, A., et al. Celsr3 is required for normal development of GABA circuits in the inner retina. PLoS. genetics. 7, e1002239 (2011).
