Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Chicken İnsan Multipl Miyelom Xenograftlarında Modeli Kurulması Tümör Büyüme, Invasion ve Anjiogenez Eğitim için

Published: May 1, 2015 doi: 10.3791/52665
* These authors contributed equally

Summary

İnsan multipl miyeloma (MM) hücreler, mezenkimal hücreler ve hayatta kalma ve proliferasyon için hücre dışı matris bileşenlerinin destek mikro-gerektirir. Biz tümör büyümesi, işgali ve anjiyogenez üzerine kanser ilaçlarının etkilerini incelemek için engrafted insan miyelom ve mezenkimal hücreler ile in vivo tavuk embriyo modelini kurdu.

Abstract

Multipl miyelom (MM), malign plazma hücre hastalığı, çaresiz kalır ve yeni ilaçlar hastaların prognozu iyileştirmek için gereklidir. Nedeniyle, kemik mikro-ve oto / parakrin büyüme faktörlerinin eksikliği insan MM hücrelerinin yetiştirilmesi güçtür. Bu nedenle, insan MM hücreleri üzerinde yeni bir terapötik etkisini incelemek için in vitro ve in vivo kültür sistemlerinde uygun kurmak için acil bir ihtiyaç vardır. Burada, in vitro ve in vivo olarak kompleks 3 boyutlu bir ortamda insan multipl miyeloma hücrelerinin büyümesi için bir model sunmaktadır. MM hücre hatları OPM-2 ve RPMI-8226 transgen GFP ifade transfekte edildi ve insan mezenkimal hücreler ve kolajen varlığında yetiştirilmiştir tip-I üç boyutlu küremsi olarak matris. Buna ek olarak, sferoidler, tavuk embriyo koriyoalantoik membran ı (CAM) üzerinde aşılandı ve tümör büyümesi stereo flöresanlı mikroskobu ile kontrol edilmiştir. Her iki model de yeni terapötik dru çalışma izinkarmaşık bir 3D ortamı ve bir transgen özgü GFP-ELISA greft homojenizasyon sonrası tümör hücre kitlesinin nicelleştirmesinde gs. Ayrıca, onun altında bulunan bir konukçu dokusuna ev ve tümör hücrelerinin invazyonu anjiyojenik tepkilerin bir stereo mikroskop ile günlük olarak takip edilmekte ve insan tümör hücreleri (Ki-67, CD138, vimentin) ya da ana duvar hücreleri kapsayan kan damarları karşı immunohistokimyasal lekeleme ile analiz edilebilir (desmin / ASMA).

Sonuç olarak, onplant sistem karmaşık bir 3D ortamda MM hücre büyümesini ve anjiyogenez okuyan izin verir ve MM hücrelerinin hayatta kalma ve çoğalmasını hedefleyen yeni terapötik bileşikler için tarama sağlar.

Protocol

Laboratuar Hayvan Refah hatching.The NIH Ofisi, bu alanda (http yazılı kılavuzu sağlamıştır kadar Avusturya hukuk ve ABD kamu sağlık hizmeti kuş embriyo Laboratuvarı Hayvan Refahı Dairesi'ne göre, canlı omurgalı hayvanlar olarak kabul edilmez: // www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm ve NIH Yayın No .: 06-4515).

1. Hücre Kültürü ve lentiviral transfeksiyonu

  1. Kültür MM hücre çizgileri OPM-2, RPMI-8226 ve RPMI1640 ortam maddesi, kemik iliğinden insan mezenkimal kök hücreleri, varlığında,% 10 sığır cenin dana serumu ve 100 IU / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve 2 mM glutamin ile desteklenmiş 37 ° C'de% 5 CO2 içinde.
  2. Transfect 5 x 10 ila 30 ul, lipozomal transfeksiyon reaktifi ve transfeksiyon ortamı (10 mi) kullanılarak viral paketleme karışımı (9 ug) DNA ve 3 ug pLenti6 / V5 hedef EGFP vektörü ile 6 HEK 293FT hücreleri. 12 saat sonra, transfeksiyon aracı maddesi çıkarın veve% 10 buzağı serumu ve% 1 temel olmayan amino asitler (NEAA), 10 ml DMEM ortamı ilave edin.
  3. 5 gün sonra, yüzme hücreleri (1000 xg, 5 dakika) santrifüje edilmesinden sonra HEK293FT hücre süpernatantlar toplamak. Başka bir yerde 28 açıklandığı gibi, gerçek zamanlı PCR ile viral titresi belirleyin.
  4. Tam büyüme ortamı içinde 24 oyuklu bir plaka içerisinde EGFP lentiviral parçacıklar (1 x 10 5 parçacıklar) 1 x 10 6 MM hücreleri transfekte. 3 gün sonra, 2 ug / ml kültür ortamına blastisidin ekleyerek seçim süreci başlar. Ticari olarak temin edilebilen EGFP lentivirüs için, 500 ug / ml neomisin kullanın.
  5. Seçimin 2 hafta sonra, MM hücrelerini ifade eGFP kümeleri görünecektir; santrifüj (1000 xg, 5 dk) tarafından hücreleri toplamak ve deneyler için OPM-2 eGFP ve RPMI-8226 eGFP alt hatları olarak genişletmek (bölüm 2 ve 3).

2. 3D-Multipl Miyelom Sferoid Modeli

  1. Chill kollajen tip I çözümü ve 10 x DMEM on buz.
  2. Kollajen matrisi içine 10 x DMEM ortamı içinde 1/10 hacim karıştırın; 7.4 arasında bir pH değerine, asidik kolajen çözeltisi nötralize etmek için NaOH (0.2 N) ilave et; Mağaza kollajen / buz üzerinde, orta bir çözüm.
  3. Transgenik MM hücre hatları (OPM-2 eGFP veya RPMI-8226 eGFP; sfero başına 250.000) karıştırın insan mezenkimal hücreler (50,000 hücre / sfero, yani 30 ul damla) ile.
  4. 15 ml tüpler (1000 xg, 5 dakika) Santrifüj hücre karışımı, hücre peleti soğuk hazırlanan kollajen karışımı (1 mL) ekleyin ve (1.000 ul ucu) ile iyice karıştırın.
  5. Hemen steril parafın film üzerinde 24 oyuklu bir plaka (100 | il ucu ile) kollajen / hücre karışımından 30 ul pipet ve hücre / kollajen karışımı 37 ° C'de (Şekil 1A bakınız), 30 dakika boyunca polimerize izin verir.
  6. 1, 10 ve 100 nM Bortezomibin ihtiva eden 1 ml kültür ortamı ile Bindirme MM sferoidler (Şekil 1B'ye bakınız).
  7. 37 ° C'de inkübasyondan 72 saat sonra, belge tarafından sferoidlerfloresan stereomikroskobi (Şekil 1C bakınız).
  8. GFP ölçümü için, bir reaksiyon tüpü içinde geniş düz çeneli forseps kullanılarak her bir sfero aktarın (Şekil 1D bakınız).

CAM 3. 3D Multipl Miyelom Ksenograft Modeli

  1. Üç gün için özel bir 37 ° C 'de kuş yumurtaları için inkübatöre ve% 70 nemde tavuk yumurtası inkübe edin.
  2. Bundan sonra, açık yumurta ve embriyo transferi hücre kültürü plaka kapağı ile etanol, kare, 10 cm plastik tartım tekneler sterilize etmek ve CAM (Şekil 2A) geliştirmek mümkün olduğu, böylece daha altı gün boyunca "ex ovo" kuluçkaya yatmaktadır.
  3. Hissedilen kolajen tip-I çözeltisi ve buz üzerinde 10 x DMEM, 7.4 olan bir pH değerine asidik kolajen çözeltisi nötralize edilmesi için (N 0.2) NaOH ekleyin, kollajen matris 10 x DMEM ortamı içinde 1/10 hacim karışımı; Mağaza kollajen / buz üzerinde, orta bir çözüm.
  4. Transgenik MM hücre hatları (OPM-2 eGFP veya MixRPMI-8226 eGFP; Insan mezenkimal hücreler ile sfero) başına 250.000 (50.000 hücre / sfero).
  5. 15 ml tüpler Santrifüj hücreleri (1,000 x g, 5 dk; her bir test bileşiği 1 şişe için) hücre pelletine (istenilen çalışma konsantrasyonunda) ilaç ile 1 ml soğuk hazırlanan kollajen karışımı ekleyin ve iyice karıştırın (1000 ul ucu ile birlikte).
  6. 37 ° C'de hücre dışı matrisin polimerizasyonun izin vermek için 30 dakika süreyle de Pate, bir 6 kolajen damla Parafilm (30 ul her) yerleştirin.
  7. (2 cm uzakta embriyodan) 9 gün eski tavuk embriyolarının CAM işlem görmemiş yüzeyine forseps kullanımı ile adım 3,6 Transferi "onplants" (her tavuk embriyo için 4 onplants, Şekil 2B bakınız)
  8. Floresan stereomikroskobi in vivo 37 ° C'de bir yumurta inkübatör büyüme ve% 70 nem, belge ksenograftlarının 5 gün sonra (bakınız Şekil 2c). 5 saat buzdolabında 4 ° C'de hipotermi ile tavuk embriyoları Euthanize.
  9. Bir göz makas ile alttaki CAM dokusu ile xenografts çıkarın ve geniş düz çeneleri ile forseps. GFP ölçümü için bunları kullanın (bölüm 4, Şekil 2D) ya da kan damarları ve / veya işgalci tümör hücreleri (bölüm 5) immünohistokimyasal analizi için.

ELISA ile EGFP Protein Niceleme 4.

  1. 0.5 mi, RIPA tamponunun 200 ug / ml proteaz inhibitörleri ihtiva eden her bir AA sfero veya kesilmiş xenograft aktarın.
  2. Buz üzerinde bir doku homojenleştirici ile sfero / xenograft homojenize.
  3. Sıvı nitrojen içinde üç dondurma / çözülme-döngüleri ve 37 ° C su banyosu gerçekleştirin.
  4. 20 dakika (12,000 g), ve mağaza süpernatanları 4 ° C'de santrifüje homojenat.
  5. Numuneleri ELISA kiti deney tamponu (200 ul) içinde 1:20 seyreltilir. Üreticinin protokolüne uygun olarak, biyotinile edilmiş anti-GFP antikorları kullanılarak ticari bir GFP ELISA kiti ile GFP düzeyleri ölçülür.

5. ImmunohiKan gemiler ve istila Tümör Hücrelerinin stochemical Analizi

  1. 4 ° C'de /% 4 paraformaldehit O'da N CAM alanı ile eksize ksenograftları sabitleyin.
  2. Gömme kasetlerin içine sabit xenografts yerleştirin ve artan kademeli alkol serisi (% 50,% 70,% 80,% 95 etanol, ksilol ve parafin, her adım 60 dk) ile bir doku gömme istasyonu içine aktarabilirsiniz.
  3. Bir Benchtop döner mikrotom kullanılarak Bölüm ksenogrefleri (5 um). 56 ° C'de cam slaytlar O / N üzerinde parafin kesitler pişirin.
  4. Iki kez damıtılmış su ile azalan bir kademeli alkol serisi ile Deparaffinize bölümler (ksilol,% 95,% 80,% 70,% 50 etanol, iki kez damıtılmış su, her bir adım, 10 dakika).
  5. Bir antijen alma çözeltisi bir su banyosu (95 ° C, 20 dakika) içinde antijen alımı gerçekleştirmek (sitratla tamponu; pH 7.0; hacim 100 ul).
  6. 30 dakika boyunca 100 ul% 3 H 2 O 2 / metanol endojen peroksidaz etkinliğini bloke eder.
  7. PBS içeren Blok bölümleri45 dakika boyunca (hacim 100 ul)% 10 fetal dana serumu.
  8. PBS oda sıcaklığında% 1 fetal buzağı serumu ihtiva eden seyreltilmiş primer antikor (1 ug / ml) 100 ul ile 1 saat için leke.
  9. PBS içinde 3-kere yıkandıktan sonra, oda sıcaklığında PBS,% 1 fetal buzağı serumu ihtiva eden biyotinile edilmiş ikincil antikor (0.1 ug / ml) ile 1 saat süreyle inkübe edin.
  10. PBS içinde 3-kere yıkandıktan sonra, üreticinin talimatlarına uygun olarak, avidin / biyotin-kompleksi (ABC) ve diaminobenzidin (DAB) alt-tabaka çözeltisi ile renk reaksiyonu gerçekleştirmek.
  11. 5.11. Hematoksilen ile çifte damıtılmış su, karşıt Bölümleri aktararak reaksiyonu durdurmak ve sentetik montaj ortamı ile bölümleri monte edin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

3D multipl miyelom küremsi deneylerinde hedef bileşiklerin in vitro analizlerde

In vitro olarak, birincil insan AA hücrelerin kültürlenmesi sınırlama kemik iliğinden hücre dışı büyüme matrisi ve destekleyici primer insan mezenkimal hücreler kullanarak, insan MM hücre hatları için yeni 3D, in vitro kültür modellerinde kuruldu (Şekil 1A, B). EGFP transgenik MM hücre hatları küremsilerde 3D büyüme sonrası görselleştirme ve MM tümör kitlesinin ölçümü sağlar. Hem MM hücre çizgileri OPM-2 EGFP ve RPMI-8226 eGFP bir stereo flöresanlı mikroskop GFP ekspresyonu ile görselleştirilmiştir bortezomib ve tümörlerin artan konsantrasyonlarının (1, 100 nM) varlığında 3 gün süre ile kültive edilmiştir (Şekil 1C) . Tümör hücre kütlesi bir GFP-ELISA (Şekil 1 ile sferoidlerinin homojenizasyon ve ölçüm eGFP içerikleri sonra ölçüldüD).

Tavuk embriyo çoklu miyelom ksenograftlarda hedef bileşiklerin in vivo analizi

Üç günlük tavuk embriyoları 6 gün boyunca karıştırılmakta ve AA hücreleri (Şekil 2A) aşılama için kullanılan 9. günde ex ovo yetiştirildi. Birlikte insan kemik iliği mezenkimal hücrelerle EGFP transgenik miyelom hücreleri (OPM-2 eGFP) ekstrasellüler matriks bileşeni olarak kollajen tip-I gömüldü. Hedef maddenin bortezomib 1 nmol (Şekil 2B) ile topikal bir şekilde uygulanmıştır. Her bir hayvan 4 "onplants" tavuk embriyolarının korioallantoik membran (CAM) üzerine aşılanmıştır. 5 gün sonra, AA ksenogrefleri EGFP ekspresyonu tarafından sunulacak bir görüntü tümörleri oluşturulmuş. Kontrollerde, ksenograftlarda MM hücrelerinin bortezomib inhibe büyüme ile karşılaştırıldığında. Greftler daha az yeşil MM tümör hücre kütlesi (Şekil 2C) gösterilir. Inci Tek MM ksenogrefleriree Farklı hayvanlar (n = 12), homojen, kesilmiş ve bundan sonra, GFP, ELISA ile ölçüldü. Kontrol doğrudan karşılaştırıldığında Bortezomib tedavi edilen ksenograftlarda önemli ölçüde azaltılmış miyeloma hücre kütlesinin (Şekil 2D) vardı.

Anjiyojenik tepkiler ve tavuk embriyoları miyelom ksenograftlarının işgali in vivo analizlerde

Onplants çevresinde en anjiyojenik yanıtlar stereomikroskobi tarafından gözlemlenebilir. Ksenograftlarının vaskülarizasyon anlamlı ilaçla tedavi edilen ksenograftlarda (1 nMol Plitidepsin, Şekil 3) içinde indirgenmiştir. Anjiyojenik yanıtlar Ribatti ve ark., 21 tarafından jelatin sünger deneyi için tarif edildiği gibi onplant filizlenmeyi kan damarlarının sayılarak ölçüldü.

Invazyon analizi için, ksenogrefleri bitişik CAM alanı ile çıkarıldı. Ksenograftlar, sabit parafın içine gömülmüş ve bölümler (Şekil 4 hazırlandı (Şekil 4) tespit etmek için, insan Ki-67, vimentin ve CD138 karşı antikor ile boyandı.

Şekil 1,
Şekil 1. 3D Multipl Miyelom Spheroids. OPM-2 eGFP ve RPMI-8226 hücre dışı matris bileşeni olarak, birincil insan kemik iliği mezenkimal hücreler ve kolajen tip I eGFP sferoidler. (B), küremsi (A) üretimi, kültür ortamı ve bortezomib ilgili konsantrasyon (1 ile inkübe edilmiştir 100 nM). (C), MM sferoidler 3 gün boyunca büyütülmüştür ve stereo-floresan mikroskobu ile fotoğraflandı. Barlar 500 mikron göstermektedir. (D) Tek SPHeroids liziz tamponu içinde homojenize edildi ve daha sonra, bir GFP ELISA ölçüldü. Tek bir küremsi GFP konsantrasyonları (n = 5, ortalama ± SEM) hesaplanmıştır. Yıldız p değerleri 0.05 <gösterir; Co = kontrolü; BZB = bortezomib. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
2. Multipl Miyelom Xenograftlarında Modeli Şekil. 9 ex-ovo tavuk embriyoları deneyler aşılanması için kullanıldı gelişim günde (A). (B), OPM-2 EGFP ve RPMI-8226 EGFP primer insan kemik iliği mezenkimal hücreler ile karıştırıldı, kolajen tip I hücre dışı matris bileşeni olarak ve bortezomib 1 nM. Katılaşma sferoidler (n = 4), tavuk embriyo koriyoalantoik zan üzerinde aşılı edildikten sonras. (C) CAM 5 gün MM greft sonra eGFP ifadesi ile görüntülenebilir. Ksenogrefleri stereo-floresan mikroskop günlük fotoğraflandı edilebilir. Çubuklar 500 um. (D) Bir AA ksenogrefleri liziz tamponu içinde homojenize edildi ve bir GFP ELISA ile ölçülür, alttaki CAM dokusu ile eksize edildi göstermektedir. Tek tümörlerin GFP konsantrasyonları (n = 12, ortalama ± SEM) hesaplanmıştır. Yıldız p değerleri 0.05 <gösterir; BZB = bortezomib. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Miyelom anjiyogenez Şekil 3. analizi. MM ksenogratflardır (OPM-2 eGFP) beş gün tavuk embriyolarının CAM naklinden sonra belgelenmiştir. Greft kontrol etmek karşılaştırma, suların içindeplitidepsin ile ent (1nMol, n = 10) CAM dokusu az vaskülarize edildi yüzeysel büyüyen tümörler ile sonuçlanmıştır. Kan damarı türleri grafik modelinde gösterildiği gibi onplants (kırmızı) büyüyen kan damarlarının sayılmıştır. Barlar 1 mm gösteriyor. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Miyelom hücre işgali Şekil 4. Analizi. Alttaki CAM konak dokuya (kontrollere karşı bortezomıb-tedavi) ile MM ksenograftlan (OPM-2 eGFP) immünohistokimyasal analizi. Prolifere insan MM hücreleri Ki-67, CD138 ve Vimentinin pozitif leke ve hücre kümeleri doku ev sahipliği olarak işgal. Tavuk kan damarları duvar hücre belirteçleri ASMA (büyük gemiler ve arterler) ve desmin (kılcal damarlar) ile boyandı. Magnificati200x üzerine, yıldız CAM kan damarları göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Refrakter MM için yeni terapötik maddelerin geliştirilmesi ilaçların insan MM hücrelerinin duyarlılığını değerlendirmek için daha az zaman alıcı ve pahalı in vivo sistemlerini gerektirmektedir. Şimdiye kadar, sadece birkaç in vivo sistem yeni bir anti-miyeloma terapisi klinik öncesi değerlendirilmesi için kullanılabilir. Bunların hepsi birleşik kütüphaneler 29 büyük ölçekli tarama için kendi sınırlamaları vardır.

İnsan MM hücreleri için en iyi güncel modeller oldukça bağışıklık eksikliği olan farelerde 7,13,30 ve hindi embriyolar 29 vardır. SCID fare ve kuş embriyo ksenograft modelleri Hem MM biyolojisini çalışmak ve yeni terapötik bileşikleri test etmek için kullanılır. Ancak, fare sistemleri doğuştan genotip, teknik olarak zorlu prosedürler, uzun gözlem süreleri ve yüksek maliyetler dahil çeşitli sınırlamalar var.

Bu çalışmada, yeni bir 3D sfero ve kuş ksenograft modeli, insan mes varlığını gerektirir insan MM hücre biyolojisi okuyan sunulmuşturhücreleri ve hücre dışı matriks olarak destekleyici bileşenleri kök enchymal. MM hücreleri güçlü, ilgili mikro-bağlı hayatta kalma ve 31-33 çoğalmaya stroma türevli büyüme faktörleri, sitokinler ile ECM bileşenlerinin varlığı, yani. Buna ek olarak, uyuşturucu verimsiz veya miyelom hücreleri kendi yerel mikroçevresinin 31,34 ile korunmaktadır zaman değişmiş aktiviteyi gösterebilir.

Kemirgen modelleri, in vitro olarak tarif edilen 3D ve in vivo model sistemlerinde de karşılaştırıldığında, pahalı, hızlı ve kullanımı kolay değildir. Buna ek olarak, 3D MM nakli tavuk embriyoları küremsilerin miyelom ile indüklenen anjiyojenez analizine izin verir. Sistemimizde bir sınırlaması MM hücre büyümesinin kısa bir süre olduğunu ve bu nedenle, kuş kemik metastazı analizi mümkün değildir. Bizim modellerin bir diğer kısıtlılığı karaciğer enzimleri tarafından sistemik uygulamalar ve ilaç ciro / modifikasyon yansıtmıyor olabilir CAM ilaçların topikal uygulama ile çalışmak olmasıdır. Içindeek olarak, aşılama olana kadar yaklaşık olarak% 50 hayatta kalma oranı nedeniyle, tavuk embriyo gelişim koşulları ovo ex gözlenmiştir. İHK analizi için endotel belirteçleri ile ilgili olarak, endotel hücreleri leke için insan ve fare bölümünde kullanılan en belirteçler tavuk kan damarlarının özgü değildir. Bu nedenle, biz duvar hücre belirteçleri desmin / ASMA veya tavuk embriyoları 35 içine Lektinlerin enjeksiyon için boyama öneririz. Tüm mevcut insan miyelom hücre hatları tavuk konak dokuya invaziv büyümeye ve yüzeysel bir büyüme gösterecektir. Bu mikrotomda bölümleri kestikten sonra yıkılan dokuda neden olacaktır. Ayrıca, özel bakım (seçim antibiyotikler) transfekte hücreler nedeniyle kalıcı genetik düzenlenmeleri veya DNA metilasyonu süreçleri, zaman içinde GFP transgen ifadesi kaybetmek yok dikkat edilmelidir.

Sonuç olarak, stromal desteği ile insan MM hücre eden tavuk embriyo ksenograft modeli Stu in vivo modeli, yeniden üretilebilir ve tahmin sağlardy insan MM hücre büyümesi ve anjiyogenez. Bu MM modeli geliştirme süresini ve yeni ilaçlar için maliyetleri azaltmak için yardımcı hızlı in vivo anti-MM ilaçların tarama süreçlerinin kolaylaştırabilir nitelendirdi. Bu tür kemik değiştirme malzemesi, karmaşık ECM matris olarak daha fazla iyileştirilmesi adımlarla, ve sistem hasta numunelerinin karşı da terapötikleri test için geliştirilmiş olabilir sitokinler. Bu kişiye kanser tıp ve bireysel refrakter MM hastalarında ilaç duyarlılık testi için bir ön koşuldur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını var

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI-8226 cells DSMZ ACC 9 STR profiled
OPM-2 cells DSMZ ACC 50 STR profiled
Human mesenchymal stem cells  PromoCell PC-C-12974
HEK293FT cells  Invitrogen R700-07
RPMI1640 Medium Sigma Aldrich R0883
Fetal Bovine Serum  HyClone ThermoScientific SH30070.03
L-Glut- Pen- Strep solution Sigma G6784
DMEM Medium Gibco 31966
NEAA Sigma Life Sciences M7145
Transfection Medium/Opti-MEM  Gibco 51985
eGFP lentiviral particles GeneCopoeia LPP-EGFP-LV105 Ready to use viral particles
pLenti6/V5Dest6 eGFP vector Invitrogen PN 35-1271 from authors
ViralpowerTM packaging mix  Invitrogen P/N 35-1275
Transfection reagent/ Lipofectamin 2000 Invitrogen 11668-027
Blasticidin Invitrogen R210-01
Neomycin Biochrom A2912
Collagen-Type1  Rat Tail BD Biosciences 354236
DMEM powder Life Technologies Art.Nr. 10338582
plitidepsin Pharmamar
bortezomib LKT Lab., Inc. B5871
SPF-white hen eggs Charles River Fertilized  white Leghorn  chicken eggs
Plastic weighing boats neoLab Art.Nr. 1-1125 for ex-ovo culture
Petridish square (Lids) Simport D210-16 for ex-ovo culture
RIPA Buffer (10x) Cell Signaling #9806
Protease Inhibitor Tablets Roche 11 836 170 001
Complete Mini EDTA-free
GFP ELISA Cell Biolabs, Inc. AKR-121
Histocette II Simport M493-6
PFA  37% Roth 7398.1
DPBS Lonza BE17-512F
Ethanol absolut Normapur 20,821,321
Roti-Histol Roth Art.Nr.6640.4
Paraplast Sigma A6330
SuperFrost Microscope Slides R. Langenbrinck  Art.-Nr.
Labor- u. Medizintechnik 03-0060
DakoCytomation Wash Buffer 10x DakoCytomation Code-Nr.
S 3006
Target Retrieval Solution (10x)  pH 6,1 DAKO Code-Nr.
S 1699
H2O2 Merck
m-a-hu ASMA clone 1A4 DAKO M0851
m-a-hu CD138 clone MI15 DAKO M7228
m-a-hu Vimentin clone V9 DAKO M0725
m-a-hu Desmin clone D33 DAKO  M0760
m-a-hu Ki67  clone MIB-1   DAKO  M7240
biotinylated goat- anti-mouse IgG Vector Laboratories Inc. BA-9200
Vectastain Elite ABC Kit Vector Laboratories Inc. # PK-6100
FAST DAB Tablet Set. Sigma Biochemicals # D4293
Mayer’s haemalaun solution Merck 1,092,490,500
Roti Histokitt Roth Art.Nr.6638.2
Bench top rotary microtome Thermo Electron, Shandon Finesse ME+
Tissue embedding station Leica, TP1020
Egg-Incubator Grumbach  BSS160
Stereo fluorescence microscope equipped with an connected with a digital camera (Olympus E410) and flexible cold light  Olympus, SZX10
Ultra Turrax  IKA T10 Homogenizer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kuehl, W. M., Bergsagel, P. L. Multiple myeloma: evolving genetic events and host interactions. Nat.Rev.Cancer. 2 (3), 175-187 (2002).
  2. Kumar, S. K., Gertz, M. A. Risk adapted therapy for multiple myeloma: back to basics. Leuk.Lymphoma. , (2014).
  3. Prideaux, S. M., Conway, O. E., Chevassut, T. J. The genetic architecture of multiple myeloma. Adv.Hematol. 2014, 864058 (2014).
  4. Chauhan, D., et al. A novel orally active proteasome inhibitor ONX 0912 triggers in vitro and in vivo cytotoxicity in multiple myeloma. Blood. 116 (23), 4906-4915 (2010).
  5. Kuehl, W. M. Mouse models can predict cancer therapy. Blood. 120 (2), 238-240 (2012).
  6. Nefedova, Y., Gabrilovich, D. Mechanisms and clinical prospects of Notch inhibitors in the therapy of hematological malignancies. Drug Resist.Updat. 11 (6), 210-218 (2008).
  7. Yaccoby, S., Barlogie, B., Epstein, J. Primary myeloma cells growing in SCID-hu mice: a model for studying the biology and treatment of myeloma and its manifestations. Blood. 92 (8), 2908-2913 (1998).
  8. Dazzi, F., et al. Normal and chronic phase CML hematopoietic cells repopulate NOD/SCID bone marrow with different kinetics and cell lineage representation. Hematol.J. 1 (5), 307-315 (2000).
  9. Lock, R. B., et al. The nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mouse model of childhood acute lymphoblastic leukemia reveals intrinsic differences in biologic characteristics at diagnosis and relapse. Blood. 99 (11), 4100-4108 (2002).
  10. Feuring-Buske, M., et al. Improved engraftment of human acute myeloid leukemia progenitor cells in beta 2-microglobulin-deficient NOD/SCID mice and in NOD/SCID mice transgenic for human growth factors. Leukemia. 17 (4), 760-763 (2003).
  11. Pearce, D. J., et al. AML engraftment in the NOD/SCID assay reflects the outcome of AML: implications for our understanding of the heterogeneity of AML. Blood. 107 (3), 1166-1173 (2006).
  12. Li, M., et al. Combined inhibition of Notch signaling and Bcl-2/Bcl-xL results in synergistic antimyeloma effect. Mol.Cancer Ther. 9 (12), 3200-3209 (2010).
  13. Tassone, P., et al. A clinically relevant SCID-hu in vivo model of human multiple myeloma. Blood. 106 (2), 713-716 (2005).
  14. Ranga, A., Gjorevski, N., Lutolf, M. P. Drug discovery through stem cell-based organoid models. Adv.Drug Deliv.Rev. 69-70, 19-28 (2014).
  15. Pereira, R. F., Barrias, C. C., Granja, P. L., Bartolo, P. J. Advanced biofabrication strategies for skin regeneration and repair. Nanomedicine.(Lond). 8 (4), 603-621 (2013).
  16. Fischbach, C., et al. Engineering tumors with 3D scaffolds). Nat.Methods. 4 (10), 855-860 (2007).
  17. Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken embryo. J.Vis.Exp. (41), (2010).
  18. Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chapter 2. Chick embryo chorioallantoic membrane models to quantify angiogenesis induced by inflammatory and tumor cells or purified effector molecules. Methods Enzymol. 444, 21-41 (2008).
  19. Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochem.Cell Biol. 130 (6), 1119-1130 (2008).
  20. Kern, J., et al. GRP-78 secreted by tumor cells blocks the antiangiogenic activity of bortezomib. Blood. 114 (18), 3960-3967 (2009).
  21. Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Presta, M. The gelatin sponge-chorioallantoic membrane assay. Nat.Protoc. 1 (1), 85-91 (2006).
  22. Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Exp.Cell Res. , (2014).
  23. Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J.Vis.Exp. (33), (2009).
  24. Kobayashi, T., et al. A chick embryo model for metastatic human prostate cancer. Eur.Urol. 34 (2), 154-160 (1998).
  25. Koop, S., et al. Fate of melanoma cells entering the microcirculation: over 80% survive and extravasate. Cancer Res. 55 (12), 2520-2523 (1995).
  26. Martowicz, A., Spizzo, G., Gastl, G., Untergasser, G. Phenotype-dependent effects of EpCAM expression on growth and invasion of human breast cancer cell lines. BMC.Cancer. 12, 501 (2012).
  27. Martowicz, A., et al. EpCAM overexpression prolongs proliferative capacity of primary human breast epithelial cells and supports hyperplastic growth. Mol.Cancer. 12, 56 (2013).
  28. Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. 6, 34 (2006).
  29. Farnoushi, Y., et al. Rapid in vivo testing of drug response in multiple myeloma made possible by xenograft to turkey embryos. Br.J.Cancer. 105 (11), 1708-1718 (2011).
  30. Wunderlich, M., Krejci, O., Wei, J., Mulloy, J. C. Human CD34+ cells expressing the inv(16) fusion protein exhibit a myelomonocytic phenotype with greatly enhanced proliferative ability. Blood. 108 (5), 1690-1697 (2006).
  31. Hideshima, T., Mitsiades, C., Tonon, G., Richardson, P. G., Anderson, K. C. Understanding multiple myeloma pathogenesis in the bone marrow to identify new therapeutic targets. Nat.Rev.Cancer. 7 (8), 585-598 (2007).
  32. Parikh, M. R., Belch, A. R., Pilarski, L. M., Kirshner, J. A three-dimensional tissue culture model to study primary human bone marrow and its malignancies. J.Vis.Exp. (85), (2014).
  33. Schuler, J., Ewerth, D., Waldschmidt, J., Wasch, R., Engelhardt, M. Preclinical models of multiple myeloma: a critical appraisal. Expert.Opin.Biol.Ther. 13, Suppl 1. S111-S123 (2013).
  34. Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112 (7), 2935-2945 (2008).
  35. Jilani, S. M., et al. Selective binding of lectins to embryonic chicken vasculature. J.Histochem.Cytochem. 51 (5), 597-604 (2003).

Tags

Tıp Sayı 99 CAM anjiyojenez mezenkimal hücreler çoklu myeloma GFP 3 boyutlu doku kültürü ksenogrefler tümör
Chicken İnsan Multipl Miyelom Xenograftlarında Modeli Kurulması Tümör Büyüme, Invasion ve Anjiogenez Eğitim için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martowicz, A., Kern, J., Gunsilius,More

Martowicz, A., Kern, J., Gunsilius, E., Untergasser, G. Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis. J. Vis. Exp. (99), e52665, doi:10.3791/52665 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter