Summary
المايلوما المتعددة (MM) الخلايا البشرية تتطلب المكروية داعمة للخلايا اللحمة المتوسطة ومكونات المصفوفة خارج الخلية من أجل البقاء والانتشار. أنشأنا في الجسم الحي الدجاج نموذج جنين مع خلايا الورم النقوي والوسيطة الإنسان المغروسة لدراسة آثار عقاقير مضادة للسرطان على نمو الورم والغزو والأوعية الدموية.
Abstract
المايلوما المتعددة (MM)، وهو مرض الخلية البلازما خبيث، لا يزال غير قابل للشفاء ويطلب أدوية جديدة لتحسين تشخيص المرضى. ونظرا لعدم وجود المكروية العظام وعوامل النمو لصناعة السيارات / نظير الصماوي الخلايا MM الإنسان يصعب زراعتها. ولذلك، هناك حاجة ملحة لإنشاء السليم في التجارب المختبرية ونظم الاستزراع الجسم الحي لدراسة عمل علاجات جديدة على الخلايا MM الإنسان. هنا نقدم نموذجا لزراعة خلايا المايلوما المتعددة الإنسان في بيئة 3D المعقدة في المختبر والمجراة. و transfected خطوط الخلايا MM OPM-2 وRPMI-8226 للتعبير عن GFP التحوير وزرعها في وجود خلايا اللحمة المتوسطة الإنسان والكولاجين النوع الأول المصفوفة كما الكروية ثلاثية الأبعاد. بالإضافة إلى ذلك، والمطعمة الكروية على غشاء مشيمائي (CAM) من أجنة الدجاج ومراقبة نمو الورم عن طريق مضان ستيريو المجهر. كلا النموذجين تسمح دراسة درو علاجية جديدةع في بيئة 3D المعقدة وتقدير من كتلة الخلايا السرطانية بعد التجانس الطعوم في التحوير محددة GFP-ELISA. وعلاوة على ذلك، يمكن رصد ردود عائية المضيف وغزو الخلايا السرطانية في الأنسجة المضيف تحتاني يوميا المجهر ستيريو وتحليلها بواسطة تلطيخ المناعى ضد الخلايا البشرية الورم (كي-67، CD138، Vimentin) أو الخلايا الجدارية المضيفة التي تغطي الأوعية الدموية (desmin / ASMA).
في الختام، ونظام onplant يسمح دراسة MM نمو الخلايا والأوعية الدموية في بيئة 3D معقدة ويمكن الكشف عن مركبات علاجية جديدة تستهدف بقاء وتكاثر الخلايا MM.
Protocol
وفقا للقانون النمساوي، ومكتب مختبر رعاية الحيوان في خدمة الصحة العامة أجنة الطيور الولايات المتحدة لا تعتبر الحيوانات الفقارية الحية حتى قدم مكتب NIH hatching.The مختبر رعاية الحيوان الإرشادات المكتوبة في هذا المجال (HTTP: // www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm وNIH النشر رقم: 06-4515).
1. خلية الثقافة وLentiviral ترنسفكأيشن
- خطوط ثقافة الخلية MM OPM-2، RPMI-8226 والخلايا الجذعية الوسيطة من النخاع العظمي في RPMI1640 المتوسطة، على أن تستكمل مع 10٪ الأبقار مصل الجنين العجل و 100 وحدة دولية / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / الستربتومايسين مل و 2 ملي الجلوتامين في وجود من 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية.
- Transfect 5 × 10 6 خلايا كلوة 293FT مع مزيج الفيروسي التعبئة والتغليف (9 ميكروغرام) DNA و 3 ميكروغرام pLenti6 / V5 دست EGFP ناقلات عن طريق استخدام 30 ميكرولتر liposomal كاشف ترنسفكأيشن وترنسفكأيشن المتوسطة (10 مل). إزالة ترنسفكأيشن المتوسطة بعد 12 ساعة وإضافة 10 مل DMEM المتوسطة مع 10٪ مصل بقري العجل و1٪ الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA).
- بعد 5 أيام، وجمع supernatants من الخلايا HEK293FT بعد الطرد المركزي الخلايا السباحة (1000 x ج، 5min). تحديد عيار الفيروسية التي كتبها في الوقت الحقيقي PCR كما هو موضح في مكان آخر (28).
- Transfect 1 × 10 6 خلايا MM مع EGFP الجسيمات lentiviral (1 × 10 5 الجزيئات) في 24 لوحة جيدا في كامل متوسطة النمو. بعد 3 أيام، تبدأ عملية الاختيار من خلال إضافة 2 ميكروغرام / مل blasticidin إلى مستنبت. للالمتاحة تجاريا EGFP الفيروسة البطيئة، استخدم 500 ميكروغرام / مل النيومايسين.
- بعد 2 أسابيع من الاختيار، ومجموعات من EGFP معربا عن الخلايا MM تظهر. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي (1000 x ج، 5 دقائق) وتوسيعها كما OPM-2 EGFP وRPMI-8226 sublines EGFP للتجارب (القسم 2 و 3).
2. 3D-المايلوما المتعددة كروي نموذج
- النوع الأول البرد الكولاجين حل و10 × DMEM سن الجليد.
- مزيج 10/01 حجم 10 × DMEM المتوسطة في مادة الكولاجين. إضافة هيدروكسيد الصوديوم (0.2 N) لتحييد حل الكولاجين الحمضية إلى قيمة الرقم الهيدروجيني من 7.4. مخزن الكولاجين / حل متوسطة على الجليد.
- مزيج خطوط الخلايا MM المعدلة وراثيا (OPM-2 EGFP أو RPMI-8226 EGFP؛ 250000 في كروي،) مع الخلايا البشرية الوسيطة (50000 خلية / كروي، أي انخفاض 30 ميكرولتر).
- خليط الخلية الطرد المركزي في 15 مل أنابيب (1000 x ج، 5min)، إضافة الباردة مزيج الكولاجين أعد (من 1mL) إلى الخلية بيليه وتخلط جيدا (مع 1000 ميكرولتر طرف).
- ماصة على الفور 30 ميكرولتر من الخليط الكولاجين / خلية (مع 100 ميكرولتر طرف) في لوحة 24 جيدا على الفيلم البارافين العقيمة والسماح خليط الخلية / الكولاجين لتتبلمر لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C (انظر الشكل 1A).
- الكروية MM تراكب مع من 1mL الثقافة المتوسطة التي تحتوي على 1 و 10 و 100 نانومتر bortezomib (انظر الشكل 1B).
- بعد 72 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية، الكروية الوثيقةstereomicroscopy مضان (انظر الشكل 1C).
- نقل كل كروي باستخدام ملقط مع فكي مسطحة واسعة في أنبوب رد فعل لقياس GFP (انظر الشكل 1D).
3. 3D المايلوما المتعددة طعم أجنبي النموذجي في CAM
- احتضان بيض الدجاج في حاضنة خاصة للبيض الطيور في 37 ° C و 70٪ الرطوبة لمدة ثلاثة أيام.
- بعد ذلك، والبيض مفتوحة ونقل الأجنة إلى تعقيم مع الايثانول، مربع، 10 سم من البلاستيك وزنها القوارب مع زراعة الخلايا لوحة الغطاء واحتضان "البيضة السابقين" لمزيد من ستة أيام، بحيث CAM غير قادرة على تطوير (انظر الشكل 2A).
- النوع الأول البرد الكولاجين حل و10 × DMEM على الجليد، مزيج 10/01 حجم 10 × DMEM المتوسطة في مادة الكولاجين، إضافة هيدروكسيد الصوديوم (0.2 N) لتحييد حل الكولاجين الحمضية إلى قيمة الرقم الهيدروجيني من 7.4. مخزن الكولاجين / حل متوسطة على الجليد.
- مزيج خطوط الخلايا MM المعدلة وراثيا (OPM-2 EGFP أوRPMI-8226 EGFP؛ 250000 في كروي،) مع خلايا اللحمة المتوسطة الإنسان (50000 خلية / كروي).
- خلايا الطرد المركزي في 15 مل أنابيب (1000 x ج، 5min؛ لكل مركب اختبار 1 قنينة)، إضافة البارد من 1mL أعد الخليط الكولاجين مع المخدرات (على المطلوب تركيز العمل) إلى الخلية بيليه وتخلط جيدا (مع 1000 ميكرولتر طرف).
- وضع قطرات الكولاجين (30 ميكرولتر لكل منهما) على parafilm في 6 بات جيدا لمدة 30 دقيقة للسماح البلمرة من المصفوفة خارج الخلية عند 37 درجة مئوية.
- نقل "onplants" من الخطوة 3.6 مع استخدام ملقط لسطح غير المعالجة من CAM (2 سم بعيدا عن الجنين) من أجنة الدجاج القديمة 9 أيام (4 onplants لكل جنين الدجاج، انظر الشكل 2B)
- بعد 5 أيام من النمو في الجسم الحي في حاضنة البيض عند 37 درجة مئوية والرطوبة 70٪، xenografts الوثيقة التي مضان stereomicroscopy (انظر الشكل 2C). الموت ببطء أجنة الدجاج انخفاض حرارة الجسم عند 4 درجات مئوية في الثلاجة لمدة 5H.
- إزالة xenografts مع الأنسجة CAM تحتاني من قبل مقص العيون وملقط مع فكي مسطحة واسعة. استخدامها لقياس GFP (الباب 4، انظر الشكل 2D) أو للتحليل المناعى الأوعية الدموية و / أو غزو الخلايا السرطانية (القسم 5).
4. الكمي لEGFP البروتين بواسطة ELISA
- نقل كل كروي MM أو طعم أجنبي رفعه إلى 0.5 مل RIPA العازلة التي تحتوي على 200 ميكروغرام / مل مثبطات الأنزيم البروتيني.
- التجانس كروي / طعم أجنبي مع الخالط الأنسجة على الجليد.
- تنفيذ ثلاث تجميد / الذوبان دورات في النيتروجين السائل و37 ° C حمام الماء.
- الطرد المركزي جناسة في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة (12000 ز) ومتجر supernatants.
- تمييع عينات 01:20 العازلة في الفحص (200 ميكرولتر) من عدة ELISA. قياس مستويات GFP من قبل GFP التجاري ELISA كيت باستخدام المعقدة البيروكسيديز أضداد GFP، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
5. Immunohiتحليل stochemical الأوعية الدموية وغزو الخلايا السرطانية
- إصلاح xenografts رفعه مع منطقة CAM في 4٪ امتصاص العرق O / N عند 4 درجات مئوية.
- وضع xenografts الثابتة إلى أشرطة التضمين ونقلها إلى محطة التضمين الأنسجة مع زيادة سلسلة الكحول متدرج (50٪، 70٪، 80٪، 95٪ من الإيثانول، زايلول والبارافين؛ كل خطوة 60 دقيقة).
- xenografts القسم (5 ميكرون) من خلال استخدام مشراح دوار الفوق. خبز أقسام البارافين على الشرائح الزجاجية O / N عند 56 ° C.
- Deparaffinize أقسام من خفض متدرج سلسلة الكحول لضعف المياه المقطرة (زايلول، 95٪، 80٪، 70٪، 50٪ من الإيثانول، وضعف المياه المقطرة، كل خطوة 10 دقيقة).
- أداء استرجاع مستضد في حمام مائي (95 ° C، 20 دقيقة) مع محلول استرجاع مستضد (العازلة citrate-؛ 7.0 درجة الحموضة، حجم 100 ميكرولتر).
- منع النشاط البيروكسيداز الذاتية مع 100 ميكرولتر 3٪ H 2 O 2 / الميثانول لمدة 30 دقيقة.
- أقسام كتلة في PBS تحتوي على10٪ مصل العجل الجنين لمدة 45 دقيقة (حجم 100 ميكرولتر).
- وصمة عار لمدة 1 ساعة مع 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية (1μg / مل) المخفف في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ مصل العجل الجنين في RT.
- بعد غسل 3 مرات في برنامج تلفزيوني، واحتضان ل1H مع الأجسام المضادة الثانوية المعقدة البيروكسيديز (0.1 ميكروغرام / مل) في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ مصل العجل الجنين في RT.
- بعد غسل 3 مرات في برنامج تلفزيوني أداء رد فعل اللون عن طريق حل أفيدين / البيوتين المعقدة (ABC) وdiaminobenzidine (DAB) الركيزة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- 5.11. وقف رد فعل عن طريق نقل المقاطع لضعف المياه المقطرة، مباين مع الهيماتوكسيلين وجبل المقاطع مع وسيلة الاصطناعية في تصاعد مستمر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في تحليل المختبر من المركبات المستهدفة في 3D المايلوما المتعددة المقايسات كروي
يرجع ذلك إلى الحد من زراعة الخلايا MM الإنسان الأساسية في المختبر أنشأنا نماذج جديدة 3D الثقافة في المختبر لخطوط الخلايا MM الإنسان الاستفادة من مصفوفة النمو خارج الخلية وخلايا اللحمة المتوسطة الإنسان الأساسية الداعمة من نخاع العظام (الشكل 1A، B). خطوط الخلايا المعدلة وراثيا MM EGFP تسمح التصور النوعي والكمي لMM كتلة الورم بعد نمو 3D في الكروية. تم الانتهاء من زراعة كل من خطوط الخلايا MM OPM-2 EGFP وRPMI-8226 EGFP لمدة 3 أيام في وجود تركيزات زيادة (1- 100 نيوتن متر) من bortezomib والأورام وتصور عن طريق التعبير عن GFP على مضان المجهر ستيريو (الشكل 1C) . وكان كميا كتلة الخلايا السرطانية بعد تجانس الكروية وقياس محتويات EGFP من قبل GFP-ELISA (الشكل 1D).
في تحليل الجسم الحي من المركبات المستهدفة في xenografts المايلوما المتعددة في أجنة الدجاج
تم زراعتها لمدة ثلاثة أيام أجنة الدجاج القديم البيضة السابقين لمدة 6 أيام، وفي يوم 9 المستخدمة لتطعيم الخلايا MM (الشكل 2A). كانت جزءا لا يتجزأ EGFP خلايا المايلوما المعدلة وراثيا (OPM-2 EGFP) جنبا إلى جنب مع خلايا اللحمة المتوسطة النخاع العظمي الإنسان في الكولاجين النوع الأول كمكون المصفوفة خارج الخلية. تم تطبيق bortezomib جوهر الهدف موضعيا في 1 نانومول (الشكل 2B). لكل حيوان 4 "onplants" والمطعمة على غشاء مشيمائي (CAM) من أجنة الدجاج. بعد 5 أيام، xenografts MM شكلت الأورام التي يمكن تصوره عن طريق التعبير عن EGFP. مقارنة مع الضوابط، bortezomib نمو تحول دون الخلايا MM في xenografts. الطعوم عرض أقل MM الأخضر كتلة الخلايا السرطانية (الشكل 2C). xenografts MM واحدة من عشرحيوانات مختلفة العناصر الأرضية النادرة (ن = 12) ورفعه، المتجانس، وبعد ذلك، تقاس GFP ELISA. في مقارنة مباشرة مع الضوابط كان xenografts bortezomib المعاملة انخفاض كبير الكتلة الخلوية المايلوما (الشكل 2D).
في تحليل فيفو الردود عائية وغزو xenografts المايلوما في أجنة الدجاج
ردود عائية حول onplants يمكن ملاحظة من قبل stereomicroscopy. تم تخفيض الأوعية الدموية من xenografts بشكل كبير في xenografts المعالجة المخدرات (1 نانومول Plitidepsin، الشكل 3). وتم قياس كمية الردود عائية عن طريق عد الأوعية الدموية تنتشر في onplant كما هو موضح في الجيلاتين الإسفنج فحص من قبل Ribatti وآخرون. 21.
لتحليل الغزو، تم رفعه xenografts مع منطقة CAM المجاورة. تم إصلاحها Xenografts، جزءا لا يتجزأ من البارافين والمقاطع إعداد (الشكل 4 (الشكل 4).
الشكل 1. 3D متعددة المايلوما الأجسام الشبه الكروية. وحضنت (A) توليد OPM-2 EGFP وRPMI-8226 الكروية EGFP مع الخلايا الأولية الإنسان النخاع العظمي الوسيطة والكولاجين النوع الأول كمكون المصفوفة خارج الخلية. (B) الأجسام الشبه الكروية مع مستنبت وتركيز كل منها من bortezomib (1- كانت تزرع 100 الكروية نانومتر). (C) MM لمدة 3 أيام وتصويرها من قبل المجهر ستيريو ومضان. الحانات تشير 500 ميكرون. (D) SPH واحدوالمتجانس eroids في المخزن تحلل وبعد ذلك، قاس في GFP ELISA. تم حساب تركيزات GFP من الكروية واحدة (ن = 5، يعني ± SEM). نجوم تشير القيم P <0.05؛ شركة = السيطرة؛ BZB = bortezomib. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. المايلوما المتعددة طعم أجنبي النموذجي. (A) في يوم التنموي واستخدمت 9 أجنة الدجاج البيضة السابقين لتطعيم التجارب. (B) OPM-2 EGFP وRPMI-8226 EGFP كانت مختلطة مع خلايا النخاع العظمي الوسيطة الإنسان الأساسية، والكولاجين النوع الأول كمكون المصفوفة خارج الخلية و مع 1 نانومتر من bortezomib. بعد الكروية التصلب (ن = 4) والمطعمة على غشاء مشيمائي الجنين الدجاجالصورة (C) بعد 5 أيام MM الطعوم في CAM يمكن تصور عن طريق التعبير عن EGFP. Xenografts يمكن تصويرها يوميا المجهر ستيريو ومضان. وتشير الحانات ويستأصل 500 ميكرون. (D) xenografts MM واحدة مع الأنسجة CAM تحتاني، المتجانس في تحلل العازلة وتقاس في GFP ELISA. تم حساب تركيزات GFP الأورام واحدة (ن = 12، يعني ± SEM). نجوم تشير القيم P <0.05؛ BZB = bortezomib. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
وقد تم توثيق الشكل 3. تحليل الأوعية الدموية المايلوما. xenografts MM (OPM-2 EGFP) بعد خمسة أيام زرع على CAM من أجنة الدجاج. في مقارنة للسيطرة على الطعوم، treatmأدى الأنف والحنجرة مع plitidepsin (1nMol، ن = 10) في الأورام المتنامية بشكل سطحي التي كانت أقل أوعية دموية من قبل الأنسجة CAM. احصي الأوعية الدموية المتزايدة إلى onplants (الأحمر) كما هو مبين في نموذج رسومية من أنواع الأوعية الدموية. الحانات تشير 1 مم. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. تحليل غزو الخلايا المايلوما. تحليل المناعى من xenografts MM (OPM-2 EGFP) مع تحتاني الأنسجة المضيف CAM (المعاملة bortezomib مقابل الضوابط). الخلايا المتكاثرة MM الإنسان وصمة عار إيجابية لكي-67، CD138 وVimentin وتغزو شكل مجموعات الخلية المضيفة الأنسجة. هي ملطخة الأوعية الدموية الدجاج مع علامات الخلية الجدارية ASMA (السفن الكبيرة والشرايين) وdesmin (الشعيرات الدموية). Magnificatiإلى 200X، العلامات النجمية تشير إلى الأوعية الدموية في CAM. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تطوير عوامل علاجية جديدة لصهر MM تتطلب أقل استهلاكا للوقت ومكلفة نظم في الجسم الحي لتقييم حساسية الخلايا MM الإنسان للمخدرات. حتى الآن، تتوفر لتقييم ما قبل السريرية من العلاجات المضادة للالمايلوما الجديدة سوى عدد قليل من النظم في الجسم الحي. كل منهم حدودها لفحص نطاق واسع من المكتبات مجمع 29.
أفضل النماذج الحالية للخلايا MM الإنسان هي الفئران المناعة ناقصة للغاية 7،13،30 والأجنة تركيا 29. كل من الماوس SCID والطيور نماذج طعم أجنبي الجنين يمكن استخدامها لدراسة بيولوجيا MM واختبار مركبات علاجية جديدة. ومع ذلك، نظم الفئران لديها العديد من القيود، بما في ذلك النمط الجيني الفطرية والإجراءات تطلبا من الناحية الفنية، وفترات المراقبة الطويلة وارتفاع التكاليف.
في هذه الدراسة، تم عرض كروي رواية 3D ونموذج طعم أجنبي الطيور لدراسة MM البشري بيولوجيا الخلية التي تنطوي على وجود مس الإنسانenchymal الخلايا الجذعية والمصفوفة خارج الخلية مكونات داعمة كما. تعتمد خلايا MM بقوة على المكروية كل منهما، أي وجود عوامل النمو المشتق سدى، السيتوكينات ومكونات ECM من أجل البقاء والتكاثر 31-33. وبالإضافة إلى ذلك، والمخدرات قد يكون غير فعال أو عرض النشاط تغير عندما محمية من قبل خلايا المايلوما المكروية المحلية 31،34.
في مقارنة لنماذج الفئران، و3D هو موضح في التجارب المختبرية ونظم نموذج الجسم الحي ليست مكلفة وسريعة، وسهلة في التعامل معها. بالإضافة إلى ذلك، زرع 3D MM الكروية لأجنة الدجاج يسمح تحليل الناجم عن الورم النخاعي الأوعية الدموية. وجود قيود على نظامنا هو وقت قصير من نمو الخلايا MM، وبالتالي، تحليل الانبثاث العظام الطيور غير ممكن. وجود قيود مزيد من النماذج لدينا هو أن نعمل مع التطبيق الموضعي من الأدوية في CAM التي قد لا تعكس تطبيقات النظامية ودوران المخدرات / تعديل بواسطة انزيمات الكبد. فيبالإضافة إلى ذلك، لوحظ معدل البقاء على قيد الحياة ما يقرب من 50٪ حتى التطعيم بسبب البيضة السابقين ظروف نمو أجنة الدجاج. وفيما يتعلق علامات البطانية لتحليل IHC، فإن معظم المؤشرات المستخدمة في القسم الإنسان والفأر إلى وصمة عار الخلايا البطانية ليست محددة لالأوعية الدموية في الدجاج. ولذلك، فإننا نوصي تلطيخ لعلامات الخلية جدارية desmin / ASMA أو حقن يكتينس في أجنة الدجاج 35. ليس كل خطوط الخلايا المايلوما البشرية المتاحة سينمو جراحية في أنسجة المضيف الدجاج وعرضها نمو سطحي. وهذا يؤدي إلى تدمير الأنسجة بعد قطع المقاطع على مشراح. وعلاوة على ذلك، يجب توخي الحذر خاصة (المضادات الحيوية اختيار) أن الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل لا يفقد التعبير GFP التحوير في الوقت، وذلك بسبب إعادة ترتيب الوراثية دائمة أو عمليات مثيلة الحمض النووي.
في الختام، لدينا الدجاج الجنين نموذج طعم أجنبي الخلايا MM الإنسان بدعم انسجة يوفر استنساخه ويمكن التنبؤ بها نموذج في الجسم الحي لستودى نمو الخلايا MM البشري والأوعية الدموية. وصف هذا قد MM نموذج تسهيل أسرع في الجسم الحي عمليات الفرز من الأدوية المضادة للMM، مما يساعد على تقليل الوقت اللازم لتطوير وتكاليف أدوية جديدة. مع مزيد من الخطوات تحسن، مثل المواد العظام استبدال ومعقدة ECM المصفوفة والسيتوكينات يمكن تحسين النظام لاختبار العلاجات أيضا ضد عينات المرضى. هذا هو الشرط الأساسي لشخصية علاج السرطان واختبار حساسية العقاقير في الأفراد المرضى MM الحرارية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-8226 cells | DSMZ | ACC 9 | STR profiled |
| OPM-2 cells | DSMZ | ACC 50 | STR profiled |
| Human mesenchymal stem cells | PromoCell | PC-C-12974 | |
| HEK293FT cells | Invitrogen | R700-07 | |
| RPMI1640 Medium | Sigma Aldrich | R0883 | |
| Fetal Bovine Serum HyClone | ThermoScientific | SH30070.03 | |
| L-Glut- Pen- Strep solution | Sigma | G6784 | |
| DMEM Medium | Gibco | 31966 | |
| NEAA | Sigma Life Sciences | M7145 | |
| Transfection Medium/Opti-MEM | Gibco | 51985 | |
| eGFP lentiviral particles | GeneCopoeia | LPP-EGFP-LV105 | Ready to use viral particles |
| pLenti6/V5Dest6 eGFP vector | Invitrogen | PN 35-1271 | from authors |
| ViralpowerTM packaging mix | Invitrogen | P/N 35-1275 | |
| Transfection reagent/ Lipofectamin 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| Blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| Neomycin | Biochrom | A2912 | |
| Collagen-Type1 Rat Tail | BD Biosciences | 354236 | |
| DMEM powder | Life Technologies | Art.Nr. 10338582 | |
| plitidepsin | Pharmamar | ||
| bortezomib | LKT Lab., Inc. | B5871 | |
| SPF-white hen eggs | Charles River | Fertilized white Leghorn chicken eggs | |
| Plastic weighing boats | neoLab | Art.Nr. 1-1125 | for ex-ovo culture |
| Petridish square (Lids) | Simport | D210-16 | for ex-ovo culture |
| RIPA Buffer (10x) | Cell Signaling | #9806 | |
| Protease Inhibitor Tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
| Complete Mini EDTA-free | |||
| GFP ELISA | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
| Histocette II | Simport | M493-6 | |
| PFA 37% | Roth | 7398.1 | |
| DPBS | Lonza | BE17-512F | |
| Ethanol absolut | Normapur | 20,821,321 | |
| Roti-Histol | Roth | Art.Nr.6640.4 | |
| Paraplast | Sigma | A6330 | |
| SuperFrost Microscope Slides | R. Langenbrinck | Art.-Nr. | |
| Labor- u. Medizintechnik | 03-0060 | ||
| DakoCytomation Wash Buffer 10x | DakoCytomation | Code-Nr. | |
| S 3006 | |||
| Target Retrieval Solution (10x) pH 6,1 | DAKO | Code-Nr. | |
| S 1699 | |||
| H2O2 | Merck | ||
| m-a-hu ASMA clone 1A4 | DAKO | M0851 | |
| m-a-hu CD138 clone MI15 | DAKO | M7228 | |
| m-a-hu Vimentin clone V9 | DAKO | M0725 | |
| m-a-hu Desmin clone D33 | DAKO | M0760 | |
| m-a-hu Ki67 clone MIB-1 | DAKO | M7240 | |
| biotinylated goat- anti-mouse IgG | Vector Laboratories Inc. | BA-9200 | |
| Vectastain Elite ABC Kit | Vector Laboratories Inc. | # PK-6100 | |
| FAST DAB Tablet Set. | Sigma Biochemicals | # D4293 | |
| Mayer’s haemalaun solution | Merck | 1,092,490,500 | |
| Roti Histokitt | Roth | Art.Nr.6638.2 | |
| Bench top rotary microtome | Thermo Electron, Shandon Finesse ME+ | ||
| Tissue embedding station | Leica, TP1020 | ||
| Egg-Incubator | Grumbach | BSS160 | |
| Stereo fluorescence microscope equipped with an connected with a digital camera (Olympus E410) and flexible cold light | Olympus, SZX10 | ||
| Ultra Turrax | IKA T10 | Homogenizer |
References
- Kuehl, W. M., Bergsagel, P. L. Multiple myeloma: evolving genetic events and host interactions. Nat.Rev.Cancer. 2 (3), 175-187 (2002).
- Kumar, S. K., Gertz, M. A. Risk adapted therapy for multiple myeloma: back to basics. Leuk.Lymphoma. , (2014).
- Prideaux, S. M., Conway, O. E., Chevassut, T. J. The genetic architecture of multiple myeloma. Adv.Hematol. 2014, 864058 (2014).
- Chauhan, D., et al. A novel orally active proteasome inhibitor ONX 0912 triggers in vitro and in vivo cytotoxicity in multiple myeloma. Blood. 116 (23), 4906-4915 (2010).
- Kuehl, W. M. Mouse models can predict cancer therapy. Blood. 120 (2), 238-240 (2012).
- Nefedova, Y., Gabrilovich, D. Mechanisms and clinical prospects of Notch inhibitors in the therapy of hematological malignancies. Drug Resist.Updat. 11 (6), 210-218 (2008).
- Yaccoby, S., Barlogie, B., Epstein, J. Primary myeloma cells growing in SCID-hu mice: a model for studying the biology and treatment of myeloma and its manifestations. Blood. 92 (8), 2908-2913 (1998).
- Dazzi, F., et al. Normal and chronic phase CML hematopoietic cells repopulate NOD/SCID bone marrow with different kinetics and cell lineage representation. Hematol.J. 1 (5), 307-315 (2000).
- Lock, R. B., et al. The nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mouse model of childhood acute lymphoblastic leukemia reveals intrinsic differences in biologic characteristics at diagnosis and relapse. Blood. 99 (11), 4100-4108 (2002).
- Feuring-Buske, M., et al. Improved engraftment of human acute myeloid leukemia progenitor cells in beta 2-microglobulin-deficient NOD/SCID mice and in NOD/SCID mice transgenic for human growth factors. Leukemia. 17 (4), 760-763 (2003).
- Pearce, D. J., et al. AML engraftment in the NOD/SCID assay reflects the outcome of AML: implications for our understanding of the heterogeneity of AML. Blood. 107 (3), 1166-1173 (2006).
- Li, M., et al. Combined inhibition of Notch signaling and Bcl-2/Bcl-xL results in synergistic antimyeloma effect. Mol.Cancer Ther. 9 (12), 3200-3209 (2010).
- Tassone, P., et al. A clinically relevant SCID-hu in vivo model of human multiple myeloma. Blood. 106 (2), 713-716 (2005).
- Ranga, A., Gjorevski, N., Lutolf, M. P. Drug discovery through stem cell-based organoid models. Adv.Drug Deliv.Rev. 69-70, 19-28 (2014).
- Pereira, R. F., Barrias, C. C., Granja, P. L., Bartolo, P. J. Advanced biofabrication strategies for skin regeneration and repair. Nanomedicine.(Lond). 8 (4), 603-621 (2013).
- Fischbach, C., et al. Engineering tumors with 3D scaffolds). Nat.Methods. 4 (10), 855-860 (2007).
- Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken embryo. J.Vis.Exp. (41), (2010).
- Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chapter 2. Chick embryo chorioallantoic membrane models to quantify angiogenesis induced by inflammatory and tumor cells or purified effector molecules. Methods Enzymol. 444, 21-41 (2008).
- Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochem.Cell Biol. 130 (6), 1119-1130 (2008).
- Kern, J., et al. GRP-78 secreted by tumor cells blocks the antiangiogenic activity of bortezomib. Blood. 114 (18), 3960-3967 (2009).
- Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Presta, M. The gelatin sponge-chorioallantoic membrane assay. Nat.Protoc. 1 (1), 85-91 (2006).
- Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Exp.Cell Res. , (2014).
- Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J.Vis.Exp. (33), (2009).
- Kobayashi, T., et al. A chick embryo model for metastatic human prostate cancer. Eur.Urol. 34 (2), 154-160 (1998).
- Koop, S., et al. Fate of melanoma cells entering the microcirculation: over 80% survive and extravasate. Cancer Res. 55 (12), 2520-2523 (1995).
- Martowicz, A., Spizzo, G., Gastl, G., Untergasser, G. Phenotype-dependent effects of EpCAM expression on growth and invasion of human breast cancer cell lines. BMC.Cancer. 12, 501 (2012).
- Martowicz, A., et al. EpCAM overexpression prolongs proliferative capacity of primary human breast epithelial cells and supports hyperplastic growth. Mol.Cancer. 12, 56 (2013).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. 6, 34 (2006).
- Farnoushi, Y., et al. Rapid in vivo testing of drug response in multiple myeloma made possible by xenograft to turkey embryos. Br.J.Cancer. 105 (11), 1708-1718 (2011).
- Wunderlich, M., Krejci, O., Wei, J., Mulloy, J. C. Human CD34+ cells expressing the inv(16) fusion protein exhibit a myelomonocytic phenotype with greatly enhanced proliferative ability. Blood. 108 (5), 1690-1697 (2006).
- Hideshima, T., Mitsiades, C., Tonon, G., Richardson, P. G., Anderson, K. C. Understanding multiple myeloma pathogenesis in the bone marrow to identify new therapeutic targets. Nat.Rev.Cancer. 7 (8), 585-598 (2007).
- Parikh, M. R., Belch, A. R., Pilarski, L. M., Kirshner, J. A three-dimensional tissue culture model to study primary human bone marrow and its malignancies. J.Vis.Exp. (85), (2014).
- Schuler, J., Ewerth, D., Waldschmidt, J., Wasch, R., Engelhardt, M. Preclinical models of multiple myeloma: a critical appraisal. Expert.Opin.Biol.Ther. 13, Suppl 1. S111-S123 (2013).
- Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112 (7), 2935-2945 (2008).
- Jilani, S. M., et al. Selective binding of lectins to embryonic chicken vasculature. J.Histochem.Cytochem. 51 (5), 597-604 (2003).
