Summary
Human multiple myeloma (MM) cellen vereisen ondersteunende micromilieu van mesenchymale cellen en extracellulaire matrix componenten voor overleving en proliferatie. Wij vestigden een in vivo model van kippenembryo engrafted humane myeloma en mesenchymale cellen effecten van kanker geneesmiddelen op tumorgroei, invasie en angiogenese.
Abstract
Multipel myeloom (MM), een kwaadaardige plasmacel ziekte ongeneeslijk blijft en nieuwe medicijnen moeten de prognose voor patiënten te verbeteren. Door het ontbreken van het bot en micro auto / paracriene groeifactoren humane MM cellen zijn moeilijk te kweken. Daarom is er dringend behoefte aan vaststelling adequate in vitro en in vivo kweeksystemen de werking van nieuwe therapieën voor humane MM cellen te bestuderen. Hier presenteren we een model voor humane multiple myeloma cellen groeien in een complexe 3D omgeving in vitro en in vivo. MM cellijnen OPM-2 en RPMI-8226 werden getransfecteerd met het GFP-transgen tot expressie en werden in de aanwezigheid van menselijke mesenchymale cellen en collageen gekweekt type I matrix driedimensionale sferoïden. Daarnaast werden Steroiden geënt op het chorioallantoïsmembraan (CAM) van kippenembryo's en tumorgroei werd gevolgd met stereo fluorescentiemicroscopie. Beide modellen maken de studie van nieuwe therapeutische drugs in een complexe 3D-omgeving en de kwantificering van de tumorcel massa na homogenisering van grafts in een transgen-specifiek GFP-ELISA. Bovendien kan angiogene responsen van de gastheer en invasie van tumorcellen in de onderliggende gastheerweefsel dagelijks gemonitord door een stereomicroscoop en immunohistochemische kleuring tegen humane tumorcellen (Ki-67, CD138, Vimentin) of host mural cellen die bloedvaten geanalyseerd (desmine / ASMA).
Concluderend, het onplant systeem kunnen bestuderen MM celgroei en angiogenese in een complexe 3D-omgeving en maakt screening op nieuwe therapeutische verbindingen gericht overleving en proliferatie van MM cellen.
Protocol
Volgens de Oostenrijkse wet, en het Bureau van Laboratory Animal Welfare van de Amerikaanse publieke gezondheidszorg aviaire embryo's worden niet beschouwd als levende gewervelde dieren tot hatching.The NIH Bureau van Laboratory Animal Welfare schriftelijke begeleiding is in dit gebied (http: // www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm en NIH publicatie nr .: 06-4515).
1. Cel Cultuur en Lentivirale transfectie
- Culture MM cellijnen OPM-2, RPMI-8226 en menselijke mesenchymale stamcellen uit beenmerg in RPMI 1640 medium, gesupplementeerd met 10% foetaal kalfsserum en 100 IU / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 2 mM glutamine in aanwezigheid van 5% CO2 bij 37 ° C.
- Transfecteren 5 x 10 6 293FT HEK cellen met virale verpakkingsmix (9 ug) DNA en 3 ug pLenti6 / V5 dest eGFP vector met behulp van 30 pl liposomaal transfectiereagens en transfectie medium (10 ml). Verwijder transfectie medium na 12 uur enVoeg 10 ml DMEM-medium met 10% bovien kalfsserum en 1% niet-essentiële aminozuren (NEAA).
- Na 5 dagen, verzamel supernatanten van HEK293FT cellen na centrifugeren van het zwemmen cellen (1.000 x g, 5 min). Bepaal virale titer door real time PCR zoals elders 28 beschreven.
- Transfecteren 1 x 10 6 MM cellen met eGFP lentivirale deeltjes (1 x 10 5 deeltjes) in een plaat met 24 putjes in compleet groeimedium. Na 3 dagen, te beginnen selectieproces door toevoeging van 2 ug / ml blasticidine aan het kweekmedium. Voor de commercieel verkrijgbare eGFP lentivirus, gebruikt 500 ug / ml neomycine.
- Na 2 weken van de selectie, zal clusters van eGFP uiten MM cellen blijken; cellen te verzamelen door centrifugeren (1000 x g, 5 min) en uit te breiden hen als OPM-2 eGFP en RPMI-8226 eGFP sublijnen voor experimenten (hoofdstuk 2 en 3).
2. 3D-Multiple Myeloma Spheroid Model
- Type I Chill collageen-oplossing en 10 x DMEM on ijs.
- Meng 1/10 volume van 10 x DMEM medium in collageen matrix; voeg NaOH (0,2 N) met zure collageenoplossing een pH waarde van 7,4 te neutraliseren; store collageen / medium oplossing op het ijs.
- Meng transgene MM cellijnen (OPM-2 eGFP of RPMI-8226 eGFP; 250.000 per sferoïde,) met menselijke mesenchymale cellen (50.000 cellen / sferoïde, dat wil zeggen 30 ul druppel).
- Centrifuge celmengsel in 15 ml buizen (1000 x g, 5 min), voeg koud bereide collageen mengsel (1 ml) naar de cel pellet en meng goed (met 1000 ul tip).
- Onmiddellijk Pipetteer 30 ul van de collageen / celmengsel (met 100 ul tip) in een 24 wells plaat op steriele paraffine film en laat cellen / collageen mengsel polymeriseren gedurende 30 minuten bij 37 ° C (zie figuur 1A).
- Overlay MM sferoïden met 1 ml kweekmedium dat 1, 10 en 100 nM bortezomib (zie figuur 1B).
- Na 72 uur incubatie bij 37 ° C, document sferoïden doorfluorescentie stereomicroscopie (zie figuur 1C).
- Breng elke sferoïde met behulp van forceps met brede platte bekken in een reageerbuis voor het meten van GFP (zie figuur 1D).
3. 3D Multiple Myeloma Xenograft Model in de CAM
- Incubeer kippeneieren in een bijzondere incubator vogeleieren bij 37 ° C en 70% luchtvochtigheid gedurende drie dagen.
- Daarna geopend eieren en overdracht embryo gesteriliseerd met ethanol, vierkant, 10 cm plastic weegschuitjes met celkweekplaat deksel en incubeer "ex ovo" gedurende zes dagen, waardoor de CAM kan ontwikkelen (zie figuur 2A).
- Type-I Chill collageenoplossing en 10 x DMEM op ijs, meng 1/10 volume van 10 x DMEM medium in collageen matrix, Opslaan NaOH (0,2 N) met zure collageenoplossing een pH waarde van 7,4 te neutraliseren; store collageen / medium oplossing op het ijs.
- Meng transgene MM cellijnen (OPM-2 eGFP ofRPMI-8226 eGFP; 250.000 per sferoïde,) met menselijke mesenchymale cellen (50.000 cellen / sferoïde).
- Centrifuge cellen in 15 ml buizen (1000 xg, 5min, want elke test verbinding 1 flacon), voeg 1 ml koud bereid collageen mengsel met geneesmiddel (op de gewenste werken concentratie) naar de cel pellet en meng goed (met 1000 ul tip).
- Plaats collageen druppels (30 pi elk) op parafilm in een 6 goed pate gedurende 30 minuten om polymerisatie van de extracellulaire matrix toe bij 37 ° C.
- Transfer "onplants" uit stap 3.6 met behulp van een tang om het onbehandelde oppervlak van de CAM (2 cm van embryo) van 9 dagen oude kippenembryo's (4 onplants per kippenembryo, zie figuur 2B)
- Na 5 dagen in vivo in een ei-incubator bij 37 ° C en 70% vochtigheid, document xenotransplantaten door fluorescentie stereomicroscopie (zie figuur 2C). Euthanaseren kippenembryo's van hypothermie bij 4 ° C in de koelkast gedurende 5 uur.
- Verwijder xenotransplantaten met onderliggende CAM weefsel door een oogheelkundige schaar en tang met brede platte kaken. Gebruik ze voor het meten van GFP (hoofdstuk 4, zie figuur 2D) of voor immunohistochemische analyse van de bloedvaten en / of binnendringende tumorcellen (hoofdstuk 5).
4. Kwantificering van eGFP eiwit met ELISA
- Breng elke MM bolvormige of uitgeschakelde xenograft in 0,5 ml RIPA buffer bevattende 200 ug / ml proteaseremmers.
- Homogeniseren sferoïde / xenograft met een tissue homogenisator op ijs.
- Voer drie invriezen / ontdooien cycli in vloeibare stikstof en 37 ° C waterbad.
- Centrifugeer homogenaat bij 4 ° C gedurende 20 min (12.000 g) en opslaan supernatanten.
- Verdun monsters 1:20 in assaybuffer (200 ul) van de ELISA-kit. Meet GFP-niveaus door een commerciële ELISA kit GFP via gebiotinyleerd anti-GFP antilichamen volgens het protocol van de fabrikant.
5. Immunohistochemical Analyse van de bloedvaten en het binnenvallen van tumorcellen
- Bevestig uitgesneden xenotransplantaten met CAM gebied 4% paraformaldehyde O / N bij 4 ° C.
- Vastgezet xenotransplantaten in inbedden cassettes en overbrengen in een weefsel inbedding station bij toenemende gegradeerde alcohol series (50%, 70%, 80%, 95% ethanol, xyleen en paraffine; iedere stap 60 min).
- Sectie xenotransplantaten (5 urn) door middel van een benchtop rotatiemicrotoom. Bak paraffinecoupes op glasplaatjes O / N bij 56 ° C.
- Deparaffinize secties door een afnemende gegradeerde alcohol serie dubbel gedestilleerd water (xylol, 95%, 80%, 70%, 50% ethanol, tweemaal gedestilleerd water; iedere stap 10 min).
- Voer antigen retrieval in een waterbad (95 ° C, 20 min) met een antigen retrieval oplossing (citrate- buffer, pH 7,0, volume 100 ui).
- Blokkeer endogene peroxidase-activiteit met 100 ui 3% H 2 O 2 / methanol gedurende 30 minuten.
- Blokdelen in PBS bevattende10% foetaal kalfserum voor 45 min (volume 100 ui).
- Stain gedurende 1 uur met 100 pi primair antilichaam (1 pg / ml) verdund in PBS dat 1% foetaal kalfsserum bij KT.
- Na 3 maal wassen in PBS, geïncubeerd gedurende 1 uur met gebiotinyleerd secundair antilichaam (0,1 ug / ml) in PBS met 1% foetaal kalfsserum bij KT.
- Na 3 maal wassen in PBS uitgevoerd kleurreactie door avidine / biotine-complex (ABC) en diaminobenzidine (DAB) substraatoplossing volgens de instructies van de fabrikant.
- 5.11. Stop de reactie door de overdracht van secties dubbel gedestilleerd water, tegenkleuring met hematoxyline en monteer secties met een synthetisch montage medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vitro analyse van doelverbindingen in 3D multiple myeloma spheroïde assays
Door de beperking van het kweken van primaire humane MM cellen in vitro we werden nieuwe 3D cultuur in vitro modellen voor humane MM cellijnen gebruikmakend van een extracellulaire matrix groei en ondersteunende primaire humane mesenchymale cellen uit beenmerg (Figuur 1A, B). EGFP transgene MM cellijnen toelaten visualisatie en kwantificatie van MM tumor massa na 3D-groei in de bolletjes. Beide MM cellijnen OPM-2 eGFP en RPMI-8226 eGFP werden gekweekt gedurende 3 dagen in de aanwezigheid van toenemende concentraties (1- 100 nM) van bortezomib en tumoren werden zichtbaar gemaakt door de expressie van GFP op een stereo fluorescentiemicroscoop (figuur 1C) . Tumorcel massa werd gekwantificeerd na homogenisering van bolletjes en het meten eGFP inhoud door een GFP-ELISA (figuur 1D).
In vivo analyse van doelverbindingen in multiple myeloom xenografts in kippenembryo's
Drie dagen oude kippenembryo's werden gekweekt ex ovo voor 6 dagen en op dag 9 gebruikt voor het enten van de MM-cellen (Figuur 2A). EGFP transgene myeloma cellen (OPM-2 eGFP) samen met de menselijke beenmerg mesenchymale cellen werden ingebed in collageen type-I als extracellulaire matrix component. De doelsubstantie bortezomib werd plaatselijk aangebracht op 1 nMol (Figuur 2B). Voor elk dier 4 "onplants" werden geënt op het chorioallantoïsmembraan (CAM) van kippenembryo's. Na 5 dagen, MM xenotransplantaten vormden tumoren die kunnen worden gevisualiseerd door de expressie van eGFP. Vergeleken met controles, bortezomib groeivermindering van MM cellen in xenotransplantaten. Enten weergegeven minder groen MM tumorcel massa (Figuur 2C). Single MM xenotransplantaten van three verschillende dieren (n = 12) werden uitgesneden, gehomogeniseerd en daarna gemeten met ELISA GFP. In directe vergelijking met controles had bortezomib-behandelde xenotransplantaten een aanzienlijk verminderd myelomacel massa (Figuur 2D).
In vivo analyse van angiogene reacties en invasie van myeloom xenografts in kippenembryo's
Angiogene reacties rond onplants kan worden waargenomen door stereomicroscopie. Vascularisatie van xenotransplantaten werd in met geneesmiddel behandelde xenotransplantaten (1 nmol Plitidepsin figuur 3) aanzienlijk verminderd. Angiogene responsen werden gekwantificeerd door bloedvaten kiemen in onplant geldende als beschreven voor de gelatinespons assay door Ribatti et al. 21.
Voor analyse van invasie xenotransplantaten werden uitgesneden met de aangrenzende CAM omgeving. Xenotransplantaten werden gefixeerd, ingebed in paraffine en secties bereid (Figuur 4 (figuur 4) te detecteren.
Figuur 1. 3D Multiple Myeloma Sferoïden. (A) Generatie van OPM-2 eGFP en RPMI-8226 eGFP bolletjes met primaire menselijke beenmerg mesenchymale cellen en collageen type-I als extracellulaire matrix component. (B) Sferoïden werden met kweekmedium en de respectieve concentratie van bortezomib (1- 100 nM). (C) MM sferoïden werden gedurende 3 dagen en gefotografeerd door een stereo-fluorescentiemicroscoop. Balken geven 500 pm. (D) Single spheroids werden gehomogeniseerd in lysisbuffer en vervolgens gemeten in een ELISA GFP. GFP concentraties één sferoïden werden berekend (n = 5, gemiddelde ± SEM). Sterren geven p-waarden <0,05; Co = controle; BZB = bortezomib. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Multiple Myeloma Xenograft Model. (A) Op dag 9 ontwikkeling ex-ovo kippenembryo's werden gebruikt voor het enten experimenten. (B) OPM-2 eGFP en RPMI-8226 eGFP gemengd met primair humaan beenmerg mesenchymale cellen, collageen type-I extracellulaire matrixcomponent en met 1 nM van bortezomib. Na stolling sferoïden (n = 4) werden geënt op het chorioallantoïsmembraan van het kippenembryos. (C) na 5 dagen MM grafts in het CAM kan worden gevisualiseerd door de expressie van eGFP. Xenotransplantaten kan dagelijks worden gefotografeerd door een stereo-fluorescentie microscoop. Balken geven 500 urn. (D) Single MM xenotransplantaten werden uitgesneden met onderliggende CAM weefsel gehomogeniseerd in lysisbuffer en gemeten in een ELISA GFP. GFP concentraties van enkele tumoren werden berekend (n = 12, gemiddelde ± SEM). Sterren geven p-waarden <0,05; BZB = bortezomib. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Analyse van myeloom angiogenese. MM xenotransplantaten (OPM-2 eGFP) waren opgenomen vijf dagen na de transplantatie op de CAM van kippenembryo's. In vergelijking met controle grafts, treatment met plitidepsin (1nMol, n = 10) leidde tot oppervlakkig groeiende tumoren die minder gevasculariseerd door CAM weefsel waren. Bloedvaten groeien naar de onplants (rood) werden geteld zoals weergegeven in het grafische model van types bloedvat. Balken geven 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Analyse van myeloomcellijn invasie. Immunohistochemische analyse van MM xenotransplantaten (OPM-2 eGFP) met onderliggende CAM gastheerweefsel (bortezomib behandeld versus controles). Prolifererende humane MM cellen vlek positief voor Ki-67, CD138 en Vimentin en binnen te vallen als celgroepen gastheer weefsel. Chicken bloedvaten worden gekleurd met muurschildering cel markers ASMA (grotere schepen en slagaders) en desmine (haarvaten). Magnificatiop 200x, sterretjes geven bloedvaten van de CAM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ontwikkeling van nieuwe therapeutische middelen voor vuurvaste MM vereist minder tijdrovend en duur in vivo systemen om gevoeligheid van humane cellen naar drugs evalueren. Tot nu toe slechts weinig in vivo systemen zijn beschikbaar voor de preklinische evaluatie van nieuwe anti-myeloma therapieën. Allemaal hebben ze hun beperkingen voor grootschalige screening van compound libraries 29.
De beste huidige modellen voor menselijke MM cellen zijn zeer immuun-deficiënte muizen 7,13,30 en kalkoen embryo 29. Zowel de SCID muis aviaire embryo xenograft modellen worden gebruikt om de biologie van MM te bestuderen en om nieuwe therapeutische verbindingen te testen. Echter, muizen systemen hebben een aantal beperkingen, met inbegrip van inteelt genotype, technisch veeleisende procedures, lange periodes observatie en hoge kosten.
In deze studie wordt een nieuw 3D sferoïdaal en aviaire xenograft model voorgesteld voor het bestuderen van humane MM celbiologie dat de aanwezigheid van menselijke mes omvatenchymal stamcellen en extracellulaire matrix als ondersteunende componenten. MM cellen sterk afhankelijk van hun respectieve micro, namelijk de aanwezigheid van stroma afgeleide groeifactoren, cytokinen en ECM componenten te overleven en prolifereren 31-33. Bovendien kan drugs onwerkbaar of weergeven veranderde activiteit wanneer myelomacellen worden beschermd door de lokale micro 31,34.
In vergelijking met muismodellen de beschreven 3D in vitro en in vivo modelsystemen zijn niet duur, snel en gemakkelijk te hanteren. Bovendien, de transplantatie van 3D MM sferoïden om kippenembryo's maakt de analyse-myeloom-geïnduceerde angiogenese. Een beperking van ons systeem de korte tijd van MM celgroei en dus analyse van metastase aviaire botten niet mogelijk. Een verdere beperking van onze modellen is dat we werken met lokale toepassing van geneesmiddelen in de CAM die geen systemische toepassingen en drugs omzet / wijziging van leverenzymen kunnen weerspiegelen. InDaarnaast is een ongeveer 50% overlevingskans tot enting werd waargenomen als gevolg van ex ovo groeiomstandigheden van kippenembryo's. Met betrekking endothelial markers voor IHC analyse, het meest gebruikte markers bij mens en muis sectie endotheelcellen vlek niet specifiek bloedvaten in kippen. Daarom raden wij kleuring voor de muurschildering cel markers desmine / ASMA of de injectie van lectines in kippenembryo's 35. Niet alle beschikbare menselijke myeloma cellijnen zal invasief groeien tot kip gastheer weefsel en weer oppervlakkige groei. Dit resulteert in vernietigde weefsel na zaagsneden op de microtoom. Bovendien moet speciale zorg (selectie antibiotica) worden gehouden dat getransfecteerde cellen niet de GFP transgenexpressie binnen de tijd doen verliezen, te wijten aan permanente genetische herschikkingen of DNA-methylatie processen.
Tot slot, onze kippenembryo xenograft model van menselijke MM cellen met stromale ondersteuning biedt een reproduceerbare en voorspelbare in-vivo model om study menselijke groei MM cellen en angiogenese. Dit beschreven MM model kan sneller vivo screeningprocessen anti-MM geneesmiddelen vergemakkelijken, waardoor ontwikkelingstijd en kosten van nieuwe geneesmiddelen verlagen. Met verdere verbetering stappen, zoals bot-vervangend materiaal, complexe ECM matrix en cytokines het systeem kan worden verbeterd voor het testen van therapieën ook tegen monsters van patiënten. Dit is een voorwaarde voor gepersonaliseerde kanker behandelingen en screening van gevoeligheid voor geneesmiddelen in afzonderlijke refractaire MM patiënten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-8226 cells | DSMZ | ACC 9 | STR profiled |
| OPM-2 cells | DSMZ | ACC 50 | STR profiled |
| Human mesenchymal stem cells | PromoCell | PC-C-12974 | |
| HEK293FT cells | Invitrogen | R700-07 | |
| RPMI1640 Medium | Sigma Aldrich | R0883 | |
| Fetal Bovine Serum HyClone | ThermoScientific | SH30070.03 | |
| L-Glut- Pen- Strep solution | Sigma | G6784 | |
| DMEM Medium | Gibco | 31966 | |
| NEAA | Sigma Life Sciences | M7145 | |
| Transfection Medium/Opti-MEM | Gibco | 51985 | |
| eGFP lentiviral particles | GeneCopoeia | LPP-EGFP-LV105 | Ready to use viral particles |
| pLenti6/V5Dest6 eGFP vector | Invitrogen | PN 35-1271 | from authors |
| ViralpowerTM packaging mix | Invitrogen | P/N 35-1275 | |
| Transfection reagent/ Lipofectamin 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| Blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| Neomycin | Biochrom | A2912 | |
| Collagen-Type1 Rat Tail | BD Biosciences | 354236 | |
| DMEM powder | Life Technologies | Art.Nr. 10338582 | |
| plitidepsin | Pharmamar | ||
| bortezomib | LKT Lab., Inc. | B5871 | |
| SPF-white hen eggs | Charles River | Fertilized white Leghorn chicken eggs | |
| Plastic weighing boats | neoLab | Art.Nr. 1-1125 | for ex-ovo culture |
| Petridish square (Lids) | Simport | D210-16 | for ex-ovo culture |
| RIPA Buffer (10x) | Cell Signaling | #9806 | |
| Protease Inhibitor Tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
| Complete Mini EDTA-free | |||
| GFP ELISA | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
| Histocette II | Simport | M493-6 | |
| PFA 37% | Roth | 7398.1 | |
| DPBS | Lonza | BE17-512F | |
| Ethanol absolut | Normapur | 20,821,321 | |
| Roti-Histol | Roth | Art.Nr.6640.4 | |
| Paraplast | Sigma | A6330 | |
| SuperFrost Microscope Slides | R. Langenbrinck | Art.-Nr. | |
| Labor- u. Medizintechnik | 03-0060 | ||
| DakoCytomation Wash Buffer 10x | DakoCytomation | Code-Nr. | |
| S 3006 | |||
| Target Retrieval Solution (10x) pH 6,1 | DAKO | Code-Nr. | |
| S 1699 | |||
| H2O2 | Merck | ||
| m-a-hu ASMA clone 1A4 | DAKO | M0851 | |
| m-a-hu CD138 clone MI15 | DAKO | M7228 | |
| m-a-hu Vimentin clone V9 | DAKO | M0725 | |
| m-a-hu Desmin clone D33 | DAKO | M0760 | |
| m-a-hu Ki67 clone MIB-1 | DAKO | M7240 | |
| biotinylated goat- anti-mouse IgG | Vector Laboratories Inc. | BA-9200 | |
| Vectastain Elite ABC Kit | Vector Laboratories Inc. | # PK-6100 | |
| FAST DAB Tablet Set. | Sigma Biochemicals | # D4293 | |
| Mayer’s haemalaun solution | Merck | 1,092,490,500 | |
| Roti Histokitt | Roth | Art.Nr.6638.2 | |
| Bench top rotary microtome | Thermo Electron, Shandon Finesse ME+ | ||
| Tissue embedding station | Leica, TP1020 | ||
| Egg-Incubator | Grumbach | BSS160 | |
| Stereo fluorescence microscope equipped with an connected with a digital camera (Olympus E410) and flexible cold light | Olympus, SZX10 | ||
| Ultra Turrax | IKA T10 | Homogenizer |
References
- Kuehl, W. M., Bergsagel, P. L. Multiple myeloma: evolving genetic events and host interactions. Nat.Rev.Cancer. 2 (3), 175-187 (2002).
- Kumar, S. K., Gertz, M. A. Risk adapted therapy for multiple myeloma: back to basics. Leuk.Lymphoma. , (2014).
- Prideaux, S. M., Conway, O. E., Chevassut, T. J. The genetic architecture of multiple myeloma. Adv.Hematol. 2014, 864058 (2014).
- Chauhan, D., et al. A novel orally active proteasome inhibitor ONX 0912 triggers in vitro and in vivo cytotoxicity in multiple myeloma. Blood. 116 (23), 4906-4915 (2010).
- Kuehl, W. M. Mouse models can predict cancer therapy. Blood. 120 (2), 238-240 (2012).
- Nefedova, Y., Gabrilovich, D. Mechanisms and clinical prospects of Notch inhibitors in the therapy of hematological malignancies. Drug Resist.Updat. 11 (6), 210-218 (2008).
- Yaccoby, S., Barlogie, B., Epstein, J. Primary myeloma cells growing in SCID-hu mice: a model for studying the biology and treatment of myeloma and its manifestations. Blood. 92 (8), 2908-2913 (1998).
- Dazzi, F., et al. Normal and chronic phase CML hematopoietic cells repopulate NOD/SCID bone marrow with different kinetics and cell lineage representation. Hematol.J. 1 (5), 307-315 (2000).
- Lock, R. B., et al. The nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mouse model of childhood acute lymphoblastic leukemia reveals intrinsic differences in biologic characteristics at diagnosis and relapse. Blood. 99 (11), 4100-4108 (2002).
- Feuring-Buske, M., et al. Improved engraftment of human acute myeloid leukemia progenitor cells in beta 2-microglobulin-deficient NOD/SCID mice and in NOD/SCID mice transgenic for human growth factors. Leukemia. 17 (4), 760-763 (2003).
- Pearce, D. J., et al. AML engraftment in the NOD/SCID assay reflects the outcome of AML: implications for our understanding of the heterogeneity of AML. Blood. 107 (3), 1166-1173 (2006).
- Li, M., et al. Combined inhibition of Notch signaling and Bcl-2/Bcl-xL results in synergistic antimyeloma effect. Mol.Cancer Ther. 9 (12), 3200-3209 (2010).
- Tassone, P., et al. A clinically relevant SCID-hu in vivo model of human multiple myeloma. Blood. 106 (2), 713-716 (2005).
- Ranga, A., Gjorevski, N., Lutolf, M. P. Drug discovery through stem cell-based organoid models. Adv.Drug Deliv.Rev. 69-70, 19-28 (2014).
- Pereira, R. F., Barrias, C. C., Granja, P. L., Bartolo, P. J. Advanced biofabrication strategies for skin regeneration and repair. Nanomedicine.(Lond). 8 (4), 603-621 (2013).
- Fischbach, C., et al. Engineering tumors with 3D scaffolds). Nat.Methods. 4 (10), 855-860 (2007).
- Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken embryo. J.Vis.Exp. (41), (2010).
- Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chapter 2. Chick embryo chorioallantoic membrane models to quantify angiogenesis induced by inflammatory and tumor cells or purified effector molecules. Methods Enzymol. 444, 21-41 (2008).
- Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochem.Cell Biol. 130 (6), 1119-1130 (2008).
- Kern, J., et al. GRP-78 secreted by tumor cells blocks the antiangiogenic activity of bortezomib. Blood. 114 (18), 3960-3967 (2009).
- Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Presta, M. The gelatin sponge-chorioallantoic membrane assay. Nat.Protoc. 1 (1), 85-91 (2006).
- Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Exp.Cell Res. , (2014).
- Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J.Vis.Exp. (33), (2009).
- Kobayashi, T., et al. A chick embryo model for metastatic human prostate cancer. Eur.Urol. 34 (2), 154-160 (1998).
- Koop, S., et al. Fate of melanoma cells entering the microcirculation: over 80% survive and extravasate. Cancer Res. 55 (12), 2520-2523 (1995).
- Martowicz, A., Spizzo, G., Gastl, G., Untergasser, G. Phenotype-dependent effects of EpCAM expression on growth and invasion of human breast cancer cell lines. BMC.Cancer. 12, 501 (2012).
- Martowicz, A., et al. EpCAM overexpression prolongs proliferative capacity of primary human breast epithelial cells and supports hyperplastic growth. Mol.Cancer. 12, 56 (2013).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. 6, 34 (2006).
- Farnoushi, Y., et al. Rapid in vivo testing of drug response in multiple myeloma made possible by xenograft to turkey embryos. Br.J.Cancer. 105 (11), 1708-1718 (2011).
- Wunderlich, M., Krejci, O., Wei, J., Mulloy, J. C. Human CD34+ cells expressing the inv(16) fusion protein exhibit a myelomonocytic phenotype with greatly enhanced proliferative ability. Blood. 108 (5), 1690-1697 (2006).
- Hideshima, T., Mitsiades, C., Tonon, G., Richardson, P. G., Anderson, K. C. Understanding multiple myeloma pathogenesis in the bone marrow to identify new therapeutic targets. Nat.Rev.Cancer. 7 (8), 585-598 (2007).
- Parikh, M. R., Belch, A. R., Pilarski, L. M., Kirshner, J. A three-dimensional tissue culture model to study primary human bone marrow and its malignancies. J.Vis.Exp. (85), (2014).
- Schuler, J., Ewerth, D., Waldschmidt, J., Wasch, R., Engelhardt, M. Preclinical models of multiple myeloma: a critical appraisal. Expert.Opin.Biol.Ther. 13, Suppl 1. S111-S123 (2013).
- Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112 (7), 2935-2945 (2008).
- Jilani, S. M., et al. Selective binding of lectins to embryonic chicken vasculature. J.Histochem.Cytochem. 51 (5), 597-604 (2003).
