Summary
Les cellules humaines myélome multiple (MM) nécessitent le micro-environnement favorable des cellules mésenchymateuses et des composants de la matrice extracellulaire pour la survie et la prolifération. Nous avons établi un modèle in vivo d'embryons de poulet avec des cellules de myélome et mésenchymateuses humaines greffées à étudier les effets des médicaments contre le cancer sur la croissance tumorale, l'invasion et l'angiogenèse.
Abstract
Le myélome multiple (MM), une maladie des cellules plasmatiques malignes, reste incurable et de nouveaux médicaments sont nécessaires pour améliorer le pronostic des patients. En raison de l'absence du microenvironnement osseux et des facteurs de croissance auto / paracrine des cellules MM humaines sont difficiles à cultiver. Par conséquent, il ya un besoin urgent d'établir une bonne in vitro et dans les systèmes de culture in vivo pour étudier l'action de nouveaux produits thérapeutiques sur les cellules de MM humaines. Ici, nous présentons un modèle à cultiver des cellules du myélome multiple humain dans un environnement 3D complexe in vitro et in vivo. Des lignées cellulaires MM OPM-2 et le milieu RPMI-8226 ont été transfectées pour exprimer le transgène GFP et ont été cultivées en présence de cellules mésenchymateuses humaines et de collagène de type I Matrice sphéroïdes tridimensionnels. En outre, les sphéroïdes ont été greffés sur la membrane chorio-allantoïde (CAM) d'embryons de poulet et la croissance tumorale a été contrôlée par microscopie à fluorescence stéréo. Les deux modèles permettent l'étude de roman dru thérapeutiquegs dans un environnement 3D complexe et la quantification de la masse des cellules tumorales après des greffes homogénéisation dans un transgène GFP spécifique au test ELISA. En outre, les réponses angiogéniques de l'hôte et l'invasion des cellules tumorales dans le tissu de l'hôte sous-jacent peuvent être surveillées quotidiennement par un microscope stéréoscopique et analysés par coloration immunohistochimique à l'encontre des cellules humaines tumorales (Ki-67, CD138, Vimentin) ou des cellules murales hôtes couvrant vaisseaux sanguins (desmine / ASMA).
En conclusion, le système onplant permet d'étudier la croissance des cellules MM et l'angiogenèse dans un environnement 3D complexe et permet le criblage de composés thérapeutiques ciblant la survie et la prolifération des cellules MM.
Protocol
Selon le droit autrichien, et le Bureau de la protection des animaux de laboratoire des embryons d'oiseaux de services de santé publique des États-Unis ne sont pas considérés comme des animaux vertébrés vivants jusqu'à ce hatching.The NIH Bureau de la protection des animaux de laboratoire a fourni des directives écrites dans ce domaine (http: // www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm et NIH Publication No .: 06-4515).
1. Culture cellulaire et transfection Lentiviral
- Lignes Culture de cellules MM OPM-2, le milieu RPMI-8226 et les cellules souches mésenchymateuses humaines de la moelle osseuse dans un milieu de RPMI 1640, complété avec 10% de sérum bovin de veau foetal et 100 UI / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine et 2 mM de glutamine en présence 5% de CO 2 à 37 ° C.
- Transfecter 5 x 10 6 cellules HEK 293FT avec mélange viral d'emballage (9 ug) et 3 ug d'ADN pLenti6 / V5 dest eGFP vecteur par l'utilisation de 30 pi de réactif de transfection liposomale et le milieu de transfection (10 ml). Retirer milieu de transfection après 12 h etajouter 10 ml de milieu DMEM avec 10% de sérum bovin de veau et 1% d'acides aminés non essentiels (NEAA).
- Après 5 jours, de recueillir les surnageants de cellules HEK293FT après centrifugation des cellules de natation (1000 xg, 5 min). Déterminer le titre viral par PCR en temps réel comme décrit ailleurs 28.
- Transfecter 1 x 10 6 cellules MM avec des particules lentivirales eGFP (1 x 10 5 particules) dans une plaque à 24 puits dans du milieu de croissance complet. Après 3 jours, commencer le processus de sélection par l'ajout de 2 ug / ml de blasticidine dans le milieu de culture. Pour la eGFP lentivirus disponible dans le commerce, utiliser 500 pg / ml de néomycine.
- Après 2 semaines de sélection, des grappes de cellules exprimant eGFP MM apparaîtront; recueillir des cellules par centrifugation (1000 xg, 5 min) et développez comme OPM-2 eGFP et RPMI-8226 lignées eGFP pour des expériences (article 2 et 3).
2. 3D-Multiple Myeloma Modèle Spheroid
- Solution-I de type Chill collagène et 10 x DMEM on glace.
- Mélanger 1/10 volume de 10 x milieu DMEM en matrice de collagène; ajouter du NaOH (0,2 N) pour neutraliser la solution acide de collagène à une valeur de pH de 7,4; magasin collagène / solution à moyen sur la glace.
- Mélanger les lignées cellulaires transgéniques de MM (OPM-2 eGFP ou RPMI-8226 eGFP; 250,000 par sphéroïde) avec des cellules mésenchymateuses humaines (50 000 cellules / sphéroïde, c.-à-goutte 30 ul).
- Mélange de cellules Centrifugeuse à tubes de 15 ml (1000 xg, 5 min), ajouter le mélange préparé à froid de collagène (1 ml) au culot cellulaire et bien mélanger (avec 1.000 pointe de pi).
- La pipette juste 30 pi du mélange collagène / cellule (avec 100 pointe pi) dans une plaque à 24 puits sur un film de paraffine stérile et laisser reposer le mélange cellules / collagène de polymériser pendant 30 min à 37 ° C (voir la figure 1A).
- Sphéroïdes de MM superposition avec un milieu de culture 1 ml contenant 1, 10 et 100 nM bortézomib (voir la figure 1B).
- Après 72 h d'incubation à 37 ° C, par le document sphéroïdesfluorescence stéréomicroscopie (voir figure 1C).
- Transférer chaque sphéroïde par l'utilisation de forceps avec de larges mâchoires plates dans un tube de réaction pour la mesure de la GFP (voir figure 1D).
3. 3D myélome multiple modèle de xénogreffe de la CAM
- Incuber des œufs de poule dans un incubateur spécial pour les œufs aviaires à 37 ° C et 70% d'humidité pendant trois jours.
- Par la suite, les œufs ouvertes et d'embryons de transfert à stérilisés avec des bateaux éthanol, carrée, de 10 cm en plastique pesant avec la culture cellulaire couvercle de la plaque et incuber "ex ovo" pour plus de six jours de sorte que le CAM est capable de développer (voir la figure 2A).
- Solution-I de type collagène et de refroidissement 10 x DMEM sur de la glace, mélanger 1/10 volume de 10 x dans du milieu DMEM matrice de collagène, Ajouter NaOH (0,2 N) pour neutraliser la solution acide de collagène à une valeur de pH de 7,4; magasin collagène / solution à moyen sur la glace.
- Mélanger les lignées cellulaires de MM transgénique (OPM-2 ou eGFPRPMI-8226 eGFP; 250.000 par sphéroïde) avec des cellules mésenchymateuses humaines (50.000 cellules / sphéroïde).
- Centrifuger les cellules à tubes de 15 ml (1 000 xg, 5 min; pour chaque composé de 1 flacon de test), ajouter 1 ml mélange de collagène préparé à froid avec la drogue (à une concentration de travail désirée) au culot cellulaire et bien mélanger (avec 1.000 pointe de pi).
- Placez collagène diminue (30 pi chacun) sur parafilm dans un 6 bien pate pendant 30 min pour permettre la polymérisation de la matrice extracellulaire à 37 ° C.
- Transfert "onplants" de l'étape 3.6 avec l'utilisation de forceps à la surface non traitée de la CAM (2 cm de distance de l'embryon) de 9 jours embryons de poulet (4 onplants pour chaque embryon de poulet, voir la figure 2B)
- Après 5 jours de croissance in vivo dans un incubateur à 37 ° C et 70% d'humidité, des xénogreffes de documents par fluorescence stéréomicroscopie (voir la figure 2C). Euthanasier des embryons de poulet par hypothermie à 4 ° C dans le réfrigérateur pendant 5h.
- Retirer xénogreffes avec tissu CAM sous-jacent par un ciseaux et des pinces ophtalmique avec de larges mâchoires plates. Utilisez-les pour la mesure de la GFP (article 4, voir figure 2D) ou pour l'analyse immunohistochimique des vaisseaux sanguins et / ou des cellules tumorales envahissantes (section 5).
4. Quantification de la protéine eGFP par ELISA
- Transférer chaque sphéroïde MM ou xénogreffe excisé dans 0,5 ml de tampon RIPA contenant 200 ug / ml des inhibiteurs de protéase.
- Homogénéiser sphéroïde / xénogreffe avec un homogénéiseur de tissu sur la glace.
- Effectuer trois congélation / décongélation-cycles dans l'azote liquide et 37 ° C bain d'eau.
- Centrifugeuse homogénat à 4 ° C pendant 20 min (12 000 g) et les surnageants de magasin.
- Diluer les échantillons 1:20 dans du tampon d'essai (200 ul) de la trousse ELISA. Mesurer GFP-niveaux par un ELISA Kit commercial GFP en utilisant des anticorps anti-GFP biotinylés, selon le protocole du fabricant.
5. Immunohistochemical Analyse des vaisseaux sanguins et des cellules tumorales envahissantes
- Fixer xénogreffes excisés avec zone de CAM dans 4% de paraformaldehyde O / N à 4 ° C.
- Passer xénogreffes fixes dans des cassettes d'enrobage et de les transférer dans une station d'enrobage de tissu avec un gradient croissant série d'alcool (50%, 70%, 80%, 95% d'éthanol, xylène et la paraffine; chaque étape 60 min).
- Section xénogreffes (5 um) par l'utilisation d'un microtome rotatif paillasse. Cuire sections de paraffine sur des lames de verre O / N à 56 ° C.
- Déparaffiner sections par une série décroissante de l'alcool graduée à l'eau bidistillée (xylène, 95%, 80%, 70%, 50% d'éthanol, de l'eau bidistillée; chaque étape 10 min).
- Effectuer la récupération de l'antigène dans un bain d'eau (95 ° C, 20 min) avec une solution d'extraction d'antigène (tampon citrate, pH 7,0, volume de 100 ul).
- Bloquer l'activité de la peroxydase endogène avec 100 ul de 3% de H 2 O 2 / méthanol pendant 30 minutes.
- sections de blocs dans PBS contenant10% de sérum de veau foetal pendant 45 minutes (volume 100 pi).
- Teinture pendant 1 heure avec 100 pi d'anticorps primaire (1 pg / ml) dilué dans du PBS contenant 1% de sérum de veau foetal à température ambiante.
- Après lavage trois fois dans du PBS, incuber pendant 1 h avec un anticorps secondaire biotinylé (0,1 pg / ml) dans du PBS contenant 1% de sérum de veau foetal à température ambiante.
- Après lavage trois fois dans du PBS effectuer réaction colorée par la solution d'avidine / (DAB) complexe biotine-substrat (ABC) et la diaminobenzidine selon les instructions du fabricant.
- 5.11. Arrêter la réaction en transférant les sections de l'eau bidistillée, contre-coloration à l'hématoxyline et à monter des sections avec un milieu de montage synthétique.
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Representative Results
L'analyse in vitro des composés cibles en 3D myélome multiple dosages de sphéroïdes
En raison de la limitation de la culture de cellules primaires de MM humaines in vitro, nous avons établi les nouveaux modèles de culture in vitro en 3D pour les lignées cellulaires MM humaines faisant usage d'une matrice de croissance extracellulaire et les cellules de soutien mésenchymateuses humaines primaires de la moelle osseuse (Figure 1A, B). EGFP lignes cellulaires de MM transgénique permettent la visualisation et la quantification de la masse tumorale après MM croissance des sphéroïdes en 3D. Les deux lignées cellulaires MM OPM-2 EGFP et le milieu RPMI-8226 eGFP ont été cultivées pendant 3 jours en présence de concentrations croissantes (1- 100 nM) du bortézomib et les tumeurs ont été visualisées par l'expression de la GFP sur un microscope à fluorescence stéréo (Figure 1C) . masse cellulaire tumorale a été quantifiée après homogénéisation de sphéroïdes et de mesure contenu eGFP par une GFP-ELISA (Figure 1D).
Dans une analyse in vivo de composés cibles multiples dans des xénogreffes de myélome dans des embryons de poulet
Trois jours embryons vieux de poulet ont été cultivées ex ovo pendant 6 jours et au jour 9 utilisée pour la greffe de cellules MM (figure 2A). EGFP cellules transgéniques de myélome (OPM-2 eGFP) avec des cellules mésenchymateuses de la moelle osseuse humaine ont été incorporés dans le collagène de type I en tant que composant de la matrice extracellulaire. Le bortézomib de substance cible a été appliqué par voie topique à 1 nmole (figure 2B). Pour chaque animal 4 "onplants" ont été greffés sur la membrane chorio (CAM) d'embryons de poulet. Après 5 jours, les tumeurs de xénogreffes MM formées qui peuvent être visualisés par l'expression de eGFP. Comparativement aux témoins, le bortézomib inhibe la croissance des cellules MM dans les xénogreffes. Les greffes affichés moins vert masse MM de cellules tumorales (figure 2C). Simples MM xénogreffes de eree différents animaux (n = 12) ont été excisés, homogénéisés et ensuite, mesurés par ELISA GFP. En comparaison directe à des contrôles xénogreffes bortézomib-traités avaient une masse de cellules de myélome significativement réduite (figure 2D).
Dans l'analyse in vivo des réponses angiogéniques et l'invasion de xénogreffes de myélome dans des embryons de poulet
Réponses angiogéniques autour onplants peuvent être observées par stéréomicroscopie. La vascularisation de xénogreffes a été significativement réduite dans des xénogreffes traités avec le médicament (1 nmole Plitidepsin, figure 3). Les réponses angiogéniques ont été quantifiés par comptage des vaisseaux sanguins poussent dans onplant comme décrit pour le dosage de l'éponge de gélatine par Ribatti et al. 21.
Pour l'analyse de l'invasion, les xénogreffes ont été excisés avec la zone de CAM adjacent. Xénogreffes ont été fixés, inclus dans la paraffine et des articles préparés (Figure 4 (figure 4).
Figure 1. 3D multiples Sphéroïdes myélome. (A) La génération d'OPM-2 eGFP et le milieu RPMI-8226 sphéroïdes eGFP avec des cellules primaires humaines de la moelle osseuse mésenchymateuses et de collagène de type I comme composant de la matrice extracellulaire. (B) sphéroïdes ont été incubées avec du milieu de culture et la concentration respective de bortézomib (1- sphéroïdes 100 nM). (C) mm ont été cultivées pendant 3 jours et on les photographie avec un microscope stéréo-fluorescence. Les barres indiquent 500 um. (D) SPH Simpleeroids ont été homogénéisés dans un tampon de lyse et par la suite, la GFP mesurée dans un test ELISA. Les concentrations de GFP de sphéroïdes individuels ont été calculées (n = 5, moyenne ± SEM). Les étoiles indiquent les valeurs de p <0,05; Co. = contrôle; Bzb = bortézomib. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. myélome multiple modèle de xénogreffe. (A) Le jour de développement neuf poulet embryons ex-ovo ont été utilisés pour greffer les expériences. (B) OPM-2 eGFP et le milieu RPMI-8226 eGFP ont été mélangés avec des cellules primaires mésenchymateuses de moelle osseuse humaine, le collagène de type I comme composant de la matrice extracellulaire et avec 1 nM de bortézomib. Après sphéroïdes de solidification (n = 4) ont été greffés sur la membrane chorio-allantoïde d'embryon de poulets. (C) Après cinq jours greffes mm dans la CAM peut être visualisée par l'expression de eGFP. Xénogreffes peuvent être photographiés quotidiennement par un microscope stéréo-fluorescence. Les barres indiquent 500 um. (D) simples MM xénogreffes ont été excisés avec le tissu de CAM sous-jacent, homogénéisés dans un tampon de lyse et la GFP est mesurée dans un test ELISA. Les concentrations de GFP de tumeurs individuelles ont été calculées (n = 12, moyenne ± SEM). Les étoiles indiquent les valeurs de p <0,05; Bzb = bortézomib. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Analyse de l'angiogenèse myélome. Les xénogreffes mm (OPM-2 eGFP) ont été documentés cinq jours après la transplantation sur la CAM d'embryons de poulet. En comparaison à contrôler greffes, traitement avec plitidepsin (1nmol, n = 10) ont donné lieu à la croissance des tumeurs qui étaient moins superficiellement vascularisé par le tissu CAM. Les vaisseaux sanguins de plus en plus aux onplants (rouge) ont été comptées comme cela est représenté dans le modèle graphique de types de vaisseaux sanguins. Les barres indiquent 1 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Analyse de l'invasion des cellules de myélome. Analyse immunohistochimique de xénogreffes MM (OPM-2 eGFP) avec le tissu CAM hôte sous-jacent (bortézomib-traitée par rapport aux témoins). La prolifération des cellules de MM humains colorent positif pour Ki-67, CD138 et Vimentin et envahissent comme des amas de cellules accueillent tissus. les vaisseaux sanguins de poulet sont colorées avec des marqueurs de cellules murale ASMA (grands navires et les artères) et la desmine (capillaires). Magnificatisur 200x, astérisques indiquent les vaisseaux sanguins de la CAM. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Le développement de nouveaux agents thérapeutiques pour MM réfractaire nécessite moins de temps et coûteux systèmes in vivo pour évaluer la sensibilité des cellules MM humains aux médicaments. Jusqu'à présent, seulement peu de systèmes in vivo sont disponibles pour l'évaluation préclinique de nouveaux traitements anti-myélome. Tous ont leurs limites pour le criblage à grande échelle de bibliothèques de composés 29.
Les meilleurs modèles actuels pour les cellules de MM humains sont très immunitaires des souris déficientes en 7,13,30 et 29 embryons de dinde. La souris SCID et des modèles de xénogreffes d'embryons aviaires peuvent être utilisées pour étudier la biologie de MM et pour tester de nouveaux composés thérapeutiques. Cependant, les systèmes murins ont plusieurs limites, notamment le génotype consanguine, procédures techniquement complexes, longues périodes d'observation et des coûts élevés.
Dans cette étude, un sphéroïde roman 3D et le modèle de xénogreffe aviaire est présenté pour l'étude de MM humaine biologie cellulaire qui implique la présence de mes droitsenchymal les cellules souches et la matrice extracellulaire en tant que composants de soutien. Les cellules MM dépendent fortement de leur micro-environnement respectif, à savoir la présence de facteurs de croissance dérivé de stroma, des cytokines et des composants de l'ECM pour survivre et proliférer 31-33. En outre, les médicaments pourraient être inefficaces ou afficher une activité modifiée lorsque les cellules de myélome sont protégés par leur microenvironnement local 31,34.
En comparaison avec les modèles murins, le 3D décrite in vitro et dans des systèmes modèles in vivo ne sont pas coûteux, rapide, et facile à manipuler. De plus, la transplantation de MM sphéroïdes 3D pour les embryons de poulet permet l'analyse de l'angiogenèse induite par le myélome. Une limitation du système est le peu de temps de la croissance des cellules MM et par conséquent, l'analyse de la métastase des os aviaire est impossible. Une autre limitation de nos modèles est que nous travaillons avec l'application topique de médicaments dans le CAM qui pourraient ne pas refléter applications systémiques et le chiffre d'affaires de drogue / modification par les enzymes du foie. ÀDe plus, un taux de survie d'environ 50% jusqu'à ce que la greffe a été observée en raison de conditions ex ovo d'embryons de poulet de croissance. En ce qui concerne marqueurs endothéliaux pour l'analyse IHC, la plupart des marqueurs utilisés dans la section humain et de souris pour colorer les cellules endothéliales ne sont pas spécifiques à des vaisseaux sanguins dans le poulet. Par conséquent, nous recommandons de coloration pour les marqueurs cellulaires murale desmine / ASMA ou l'injection de lectines dans des embryons de poulet 35. Pas toutes les lignées cellulaires de myélome humaines disponibles augmenteront invasive dans les tissus de l'hôte de poulet et afficher une croissance superficielle. Cela se traduira par la destruction du tissu après la coupe des sections sur le microtome. En outre, une attention particulière (antibiotiques de sélection) doit être pris que les cellules transfectées ne perdent pas l'expression du transgène GFP dans le temps, en raison de réarrangements génétiques permanents ou processus de méthylation d'ADN.
En conclusion, notre embryon de poulet modèle de xénogreffe de cellules de MM humaines avec le soutien du stroma fournit un modèle in vivo reproductible et prévisible pour Study croissance humaine sur les cellules MM et l'angiogenèse. Ce modèle décrit MM peut faciliter plus rapidement in vivo processus de dépistage de médicaments anti-MM, en aidant à réduire les temps et coûts de développement de nouveaux médicaments. Avec d'autres étapes de améliore, tels que le matériel osseux de remplacement, matrice ECM complexe et cytokines, le système pourrait être amélioré pour tester thérapeutiques aussi contre les échantillons des patients. Ceci est une condition préalable pour la médecine personnalisé du cancer et des tests de sensibilité aux médicaments dans les différents patients atteints de MM réfractaires.
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Disclosures
Les auteurs ont aucun intérêt financier concurrentes
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-8226 cells | DSMZ | ACC 9 | STR profiled |
| OPM-2 cells | DSMZ | ACC 50 | STR profiled |
| Human mesenchymal stem cells | PromoCell | PC-C-12974 | |
| HEK293FT cells | Invitrogen | R700-07 | |
| RPMI1640 Medium | Sigma Aldrich | R0883 | |
| Fetal Bovine Serum HyClone | ThermoScientific | SH30070.03 | |
| L-Glut- Pen- Strep solution | Sigma | G6784 | |
| DMEM Medium | Gibco | 31966 | |
| NEAA | Sigma Life Sciences | M7145 | |
| Transfection Medium/Opti-MEM | Gibco | 51985 | |
| eGFP lentiviral particles | GeneCopoeia | LPP-EGFP-LV105 | Ready to use viral particles |
| pLenti6/V5Dest6 eGFP vector | Invitrogen | PN 35-1271 | from authors |
| ViralpowerTM packaging mix | Invitrogen | P/N 35-1275 | |
| Transfection reagent/ Lipofectamin 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| Blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| Neomycin | Biochrom | A2912 | |
| Collagen-Type1 Rat Tail | BD Biosciences | 354236 | |
| DMEM powder | Life Technologies | Art.Nr. 10338582 | |
| plitidepsin | Pharmamar | ||
| bortezomib | LKT Lab., Inc. | B5871 | |
| SPF-white hen eggs | Charles River | Fertilized white Leghorn chicken eggs | |
| Plastic weighing boats | neoLab | Art.Nr. 1-1125 | for ex-ovo culture |
| Petridish square (Lids) | Simport | D210-16 | for ex-ovo culture |
| RIPA Buffer (10x) | Cell Signaling | #9806 | |
| Protease Inhibitor Tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
| Complete Mini EDTA-free | |||
| GFP ELISA | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
| Histocette II | Simport | M493-6 | |
| PFA 37% | Roth | 7398.1 | |
| DPBS | Lonza | BE17-512F | |
| Ethanol absolut | Normapur | 20,821,321 | |
| Roti-Histol | Roth | Art.Nr.6640.4 | |
| Paraplast | Sigma | A6330 | |
| SuperFrost Microscope Slides | R. Langenbrinck | Art.-Nr. | |
| Labor- u. Medizintechnik | 03-0060 | ||
| DakoCytomation Wash Buffer 10x | DakoCytomation | Code-Nr. | |
| S 3006 | |||
| Target Retrieval Solution (10x) pH 6,1 | DAKO | Code-Nr. | |
| S 1699 | |||
| H2O2 | Merck | ||
| m-a-hu ASMA clone 1A4 | DAKO | M0851 | |
| m-a-hu CD138 clone MI15 | DAKO | M7228 | |
| m-a-hu Vimentin clone V9 | DAKO | M0725 | |
| m-a-hu Desmin clone D33 | DAKO | M0760 | |
| m-a-hu Ki67 clone MIB-1 | DAKO | M7240 | |
| biotinylated goat- anti-mouse IgG | Vector Laboratories Inc. | BA-9200 | |
| Vectastain Elite ABC Kit | Vector Laboratories Inc. | # PK-6100 | |
| FAST DAB Tablet Set. | Sigma Biochemicals | # D4293 | |
| Mayer’s haemalaun solution | Merck | 1,092,490,500 | |
| Roti Histokitt | Roth | Art.Nr.6638.2 | |
| Bench top rotary microtome | Thermo Electron, Shandon Finesse ME+ | ||
| Tissue embedding station | Leica, TP1020 | ||
| Egg-Incubator | Grumbach | BSS160 | |
| Stereo fluorescence microscope equipped with an connected with a digital camera (Olympus E410) and flexible cold light | Olympus, SZX10 | ||
| Ultra Turrax | IKA T10 | Homogenizer |
References
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