Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

הקמת מודל xenograft מיאלומה נפוצה אדם בעוף לחקר צמיחת גידול, פלישה ואנגיוגנזה

Published: May 1, 2015 doi: 10.3791/52665
* These authors contributed equally

Summary

תאים אנושיים מסוג מיאלומה נפוצה (MM) דורשים מייקרו-הסביבה התומכת של תאי mesenchymal ורכיבי מטריצה ​​תאיים להישרדות ושגשוג. הקמנו in vivo מודל עובר עוף עם תאי מיאלומה וmesenchymal אדם engrafted ללמוד השפעות של תרופות לסרטן על צמיחת גידול, פלישה ואנגיוגנזה.

Abstract

מיאלומה נפוצה (MM), מחלה ממארת של תאי פלזמה, נותרת חשוכות מרפא ותרופות חדשניות נדרשות כדי לשפר את הפרוגנוזה של חולים. בשל חוסר microenvironment העצם וגורמי גדילה אוטומטי / אוטוקריני תאי MM אנושיים קשים לטפח. לכן, יש צורך דחוף בהקמה נכונה במבחנה ובמערכות תרבות vivo ללמוד את הפעולה של תרופות חדשניות בתאי MM אנושיים. כאן אנו מציגים מודל לגדל תאי מיאלומה נפוצים אנושיים בסביבת 3D מורכבת במבחנת in vivo. שורות תאי MM OPM-2 וRPMI-8226 היו transfected להביע GFP transgene ועובדו בנוכחות של תאי mesenchymal אנושיים וקולגן סוג אני מטריקס כspheroids תלת-ממדי. בנוסף, spheroids היה מורכב על קרום chorioallantoic (רמ"א) של עוברי עופות וגידול היה פיקוח על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו. שני הדגמים מאפשרים המחקר של DRU הטיפולי החדשניGS בסביבת 3D מורכבת והכימות של מסת התאים הסרטניים לאחר הומוגניזציה של שתלים בGFP-ELISA transgene הספציפי. יתר על כן, תגובות angiogenic של המארח והפלישה של תאי גידול לרקמות מארח subjacent יכולות להיות במעקב יומי על ידי מיקרוסקופ סטריאו ונותחו על ידי מכתים immunohistochemical נגד תאי גידולים בבני אדם (קי-67, CD138, vimentin) או תאי ציור קיר מארח מכסים כלי דם (Desmin / ASMA).

לסיכום, מערכת onplant מאפשרת לימוד צמיחת תאי MM ואנגיוגנזה בסביבת 3D מורכבת ומאפשרת הקרנה לתרכובות טיפוליות חדשניות מיקוד הישרדות והתרבות של תאי MM.

Protocol

על פי החוק האוסטרי, והמשרד של בעלי חיים במעבדת רווחה של עוברי עופות שירות בריאות הציבור האמריקאים אינם נחשבים כבעלי חיים בעלי חוליות חיים עד משרד NIH hatching.The של בעלי חיים במעבדת רווחה סיפק הדרכה נכתבה בתחום זה (http: // www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm ופרסום NIH לא .: 06-4515).

1. תא התרבות וlentiviral Transfection

  1. שורות תאי MM תרבות OPM-2, RPMI-8226 ותאי גזע mesenchymal אדם ממח עצם במדיום RPMI1640, בתוספת 10% בסרום שור עוברי עגל ו -100 IU / פניצילין מיליליטר, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין וגלוטמין 2 מ"מ בנוכחות 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס.
  2. Transfect 5 x 10 6 תאי HEK 293FT עם תערובת נגיפית אריזת DNA (9 מיקרוגרם) ו -3 מיקרוגרם pLenti6 / V5 dest eGFP וקטור על ידי השימוש של מגיב transfection liposomal 30 μl ובינוני transfection (10 מיליליטר). הסר בינוני transfection לאחר 12 שעות ולהוסיף 10 מיליליטר DMEM בינוני עם 10% בסרום שור עגל וחומצות אמינו לא חיוני 1% (NEAA).
  3. לאחר 5 ימים, לאסוף supernatants של תאי HEK293FT לאחר צנטריפוגה של תאי שחייה (1000 XG, 5min). לקבוע כייל נגיף על ידי PCR בזמן אמת כפי שתואר במקום אחר 28.
  4. Transfect 1 x 10 6 תאי MM עם חלקיקי eGFP lentiviral (1 x 10 5 חלקיקים) בצלחת גם 24 במדיום גידול שלם. לאחר 3 ימים, להתחיל תהליך בחירה על ידי הוספת 2 מיקרוגרם / מיליליטר blasticidin עד בינוני התרבות. לlentivirus eGFP הזמינים המסחרית, השתמש 500 מיקרוגרם / מיליליטר נאומיצין.
  5. לאחר 2 שבועות של בחירה, אשכולות של eGFP להביע תאי MM יופיעו; לאסוף תאים על ידי צנטריפוגה (1000 XG, 5 דק ') ולהרחיב אותם כOPM-2 eGFP וRPMI-8226 sublines eGFP לניסויים (סעיף 2 ו -3).

דגם מיאלומה ספרואיד 2. 3D-מרובה

  1. סוג אני קולגן צ'יל פתרון ו -10 x o DMEMקרח n.
  2. מערבבים 1/10 נפח של 10 DMEM בינוני x למטריצת קולגן; להוסיף NaOH (0.2 N) לנטרל פתרון קולגן חומצי לערך ה- pH של 7.4; קולגן חנות / פתרון בינוני על קרח.
  3. מערבבים שורות תאים מהונדסים MM (OPM-2 eGFP או RPMI-8226 eGFP; 250,000 לאליפטית,) עם תאים אנושיים mesenchymal (50,000 תאים / אליפטית, כלומר, ירידה של 30 μl).
  4. תערובת תא צנטריפוגה ב 15 מיליליטר צינורות (1000 XG, 5min), להוסיף תערובת קרה מוכן קולגן (1mL) לתא גלולה ומערבבים היטב (עם 1,000 קצה μl).
  5. מייד פיפטה 30 μl של תערובת קולגן / תא (עם 100 טיפ μl) בצלחת גם 24 על סרט פרפין סטרילי ולאפשר תערובת התא / קולגן לפלמר במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (ראה איור 1 א).
  6. spheroids MM שכבה עם מדיום תרבות 1mL המכיל 1, 10 ו 100 ננומטר בורטזומיב (ראה איור 1).
  7. לאחר 72 שעות של דגירה על 37 מעלות צלזיוס, spheroids מסמך על ידיstereomicroscopy הקרינה (ראה איור 1 ג ').
  8. העבר כל אליפטית על ידי השימוש במלקחיים עם לסתות שטוחות רחבות בצינור תגובה למדידה של ה- GFP (ראה איור 1D).

3. 3D מודל xenograft מיאלומה נפוצה ברפואה המשלימה והאלטרנטיבית

  1. דגירה ביצי עוף בחממה מיוחדת לביצים עופות על 37 מעלות צלזיוס ולחות 70% לשלושה ימים.
  2. לאחר מכן, ביצים פתוחות ועוברי העברה לעיקור עם סירות במשקל פלסטיק אתנול,, 10 סנטימטרים מרובעים עם מכסה צלחת תרבית תאי דגירה "לשעבר אובו" לעוד שישה ימים, כך שCAM הוא מסוגל לפתח (ראה איור 2 א).
  3. סוג אני קולגן צ'יל פתרון ו -10 DMEM x על קרח, לערבב 1/10 נפח של 10 x DMEM בינוני למטריצת קולגן, להוסיף NaOH (0.2 N) לנטרל פתרון קולגן חומצי לערך ה- pH של 7.4; קולגן חנות / פתרון בינוני על קרח.
  4. מערבבים קווי MM המהונדס תא (OPM-2 eGFP אוRPMI-8226 eGFP; 250,000 לאליפטית,) עם תאי mesenchymal אנושיים (50,000 תאים / אליפטית).
  5. תאי צנטריפוגה ב 15 מיליליטר צינורות (1000 XG, 5min; לכל מתחם בדיקת בקבוקון 1), להוסיף 1mL תערובת קולגן מוכן קרה עם תרופה (בריכוז רצוי עבודה) לתא גלולה ומערבבים היטב (עם 1,000 קצה μl).
  6. הנח טיפות קולגן (30 μl כל אחד) על parafilm ב6 גם פטה למשך 30 דקות כדי לאפשר פילמור של מטריקס על 37 מעלות צלזיוס.
  7. העברה "onplants" מצעד 3.6 עם השימוש במלקחיים על פני השטח לא מטופל של CAM (2 סנטימטרים מהעובר) של עוברי תרנגולת 9 יום בן (4 onplants לכל עובר עוף, ראה איור 2)
  8. לאחר 5 ימים של צמיחה בvivo בחממת ביצה על 37 מעלות צלזיוס ולחות 70%, xenografts מסמך על ידי stereomicroscopy הקרינה (ראה איור 2 ג). להרדים עוברי עוף בהיפותרמיה על 4 מעלות צלזיוס במקרר 5 שעות.
  9. הסר xenografts עם רקמת CAM subjacent ידי מספריים עיניים ומלקחיים עם לסתות שטוחות רחבות. השתמש בם למדידה של ה- GFP (סעיף 4, ראו איור 2 ד) או לצורך ניתוח immunohistochemical של כלי דם ו / או תאים פולשים גידול (סעיף 5).

4. כימות חלבון eGFP ידי ELISA

  1. העבר כל אליפטית MM או xenograft נכרת ל0.5 מיליליטר Ripa מאגר המכיל 200 מיקרוגרם / מיליליטר מעכבי פרוטאז.
  2. Homogenize אליפטית / xenograft עם homogenizer רקמות על קרח.
  3. בצע שלוש הקפאה / הפשרה מחזורים בחנקן נוזלי ו -37 ° C אמבט מים.
  4. homogenate צנטריפוגה על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות (12,000 ז) וsupernatants חנות.
  5. לדלל דגימות 01:20 במאגר assay (200 μl) של ערכת ELISA. למדוד GFP-ידי רמות ה- GFP מסחרי ELISA ערכה באמצעות נוגדנים אנטי-GFP biotinylated, על פי הפרוטוקול של היצרן.

5. Immunohiניתוח stochemical של כלי דם ותאי גידול פולשים

  1. תקן xenografts נכרת בשטח CAM ב -4% O paraformaldehyde / N ב 4 ° C.
  2. הנח xenografts הקבוע לקלטות הטבעה ולהעביר אותם לתחנת הטבעת רקמות עם סדרת הגדלת מדורגת אלכוהול (50%, 70%, 80%, 95% אתנול, xylol ופרפין; כל דקות שלב 60).
  3. xenografts סעיף (5 מיקרומטר) על ידי השימוש בmicrotome הסיבובי benchtop. אופה חלקי פרפין על O שקופיות זכוכית / N ב 56 מעלות צלזיוס.
  4. סעיפי Deparaffinize על ידי סדרת אלכוהול מדורגת יורדת למים מזוקקים כפולים (xylol, 95%, 80%, 70%, 50% אתנול, מים מזוקקים כפולים; כל שלב 10 דקות).
  5. לבצע אחזור אנטיגן באמבט מים (95 מעלות צלזיוס, 20 דקות) עם פתרון אחזור אנטיגן (חיץ citrate-; pH 7.0; נפח 100 μl).
  6. לחסום פעילות peroxidase אנדוגני עם H 100 μl 3% 2 O 2 / מתנול למשך 30 דקות.
  7. חלקי בלוק בPBS המכיל10% עוברי עגל בסרום במשך 45 דקות (נפח 100 μl).
  8. כתם במשך שעה 1 עם של נוגדן ראשוני (1μg / מיליליטר) מדולל PBS המכיל 1% בסרום עגל עוברי ב RT 100 μl.
  9. לאחר שטיפת 3 פעמים-ב PBS, דגירה של 1h עם נוגדן biotinylated המשני (0.1 מיקרוגרם / מיליליטר) בPBS המכיל 1% בסרום עגל עוברי ב RT.
  10. לאחר שטיפת 3 פעמים-בPBS לבצע תגובת צבע על ידי פתרון avidin מצע / יוטין-מורכב (ABC) וdiaminobenzidine (DAB) על פי הוראות יצרן.
  11. 5.11. עצור תגובה על ידי העברת חלקים למים מזוקקים כפולים, counterstain עם hematoxylin והר חלקים עם הרכבה בינונית סינטטי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בניתוח מבחנה של תרכובות יעד במבחני אליפטית מיאלומה נפוצה 3D

בשל המגבלה של תאי culturing MM אנושיים ראשוניים במבחנה הקמנו מודלים תרבות במבחנה חדשים 3D עבור שורות תאים אנושיות MM עושים שימוש במטריקס צמיחה ותאי mesenchymal תומכים עיקריים אנושיים ממח עצם (איור 1 א ', ב'). שורות תאים המהונדס MM EGFP לאפשר הדמיה וכימות של מסת גידול MM לאחר צמיחת 3D בspheroids. שתי שורות תאי MM OPM-2 eGFP וRPMI-8226 eGFP עובדו במשך 3 ימים בנוכחות ריכוזים גוברים (1 100 ננומטר) של בורטזומיב וגידולים היו דמיינו ידי הביטוי של ה- GFP במיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו (איור 1 ג) . מסת תאים הסרטניים הייתה לכמת לאחר הומוגניזציה של spheroids ותוכן eGFP מדידה על ידי ה- GFP-ELISA (איור 1D).

בניתוח vivo של תרכובות היעד בxenografts מיאלומה נפוצה בעוברי עופות

עוברי עוף ישן שלושה ימים עובדו אוב לשעבר במשך 6 ימים וביום 9 משמש להשתלה של תאי MM (איור 2 א). תאים מהונדסים EGFP מיאלומה (OPM-2 eGFP) יחד עם תאי mesenchymal מח עצם אנושיים מוטבעים לתוך קולגן סוג אני כמרכיב מטריקס. בורטזומיב חומר היעד למריחה על עור ב1 nmol (איור 2). עבור כל 4 "onplants" בעלי החיים מורכבים על קרום chorioallantoic (רמ"א) של עוברי תרנגולת. לאחר 5 ימים, xenografts MM יצר גידולים שיכולים להיות דמיינו ידי הביטוי של eGFP. בהשוואה לקבוצת ביקורת, בורטזומיב צמיחת עכבות של תאי MM בxenografts. שתלי מוצג מסת תאים סרטניים MM הירוק פחות (איור 2 ג). xenografts MM אחת מהבעלי חיים שונים רי (n = 12) היו נכרת, הומוגני ולאחר מכן, שנמדדו על ידי ה- GFP ELISA. בהשוואה ישירה לבקרות היה xenografts בורטזומיב טופל מסת תאי מיאלומה מופחתת באופן משמעותי (איור 2 ד).

בניתוח vivo של תגובות ופלישה של xenografts מיאלומה בעוברי תרנגולת angiogenic

תגובות angiogenic סביב onplants ניתן לצפות על ידי stereomicroscopy. כלי דם של xenografts צומצמו משמעותי בxenografts טיפול התרופתי (1 nmol Plitidepsin, איור 3). תגובות angiogenic היו לכמת ידי ספירת כלי דם הנבטה לonplant כמתואר עבור assay ספוג ג'לטין על ידי et al Ribatti. 21.

לניתוח של פלישה, xenografts היה נכרת עם אזור CAM הסמוך. Xenografts היו קבוע, משובץ בפרפין וחתכים מוכנים (איור 4 (איור 4).

איור 1
איור 1. Spheroids מיאלומה נפוצה 3D. דור () של OPM-2 eGFP וRPMI-8226 spheroids eGFP עם תאים ראשוניים אדם מח עצם mesenchymal וקולגן סוג אני כמרכיב מטריקס. (ב) Spheroids הודגרו עם מדיום התרבות וריכוז בהתאמה של בורטזומיב (1 100 spheroids ננומטר). (ג) MM גדל במשך 3 ימים וצולם על ידי מיקרוסקופ סטריאו-הקרינה. ברים מצביעים 500 מיקרומטר. SPH רווק (D)eroids היו הומוגני במאגר תמוגה ולאחר מכן, נמדד בELISA GFP. ריכוזי ה- GFP של spheroids היחיד חושבו (n = 5, ממוצע ± SEM). כוכבים מצביעים על ערכי p <0.05; ושות '= שליטה; Bzb = בורטזומיב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. מרובה מיאלומה xenograft דגם. (א) ביום התפתחותית 9 עוברי עוף לשעבר אובו שמשו להשתלת ניסויים. (ב) OPM-2 eGFP וRPMI-8226 eGFP היו מעורב עם תאי mesenchymal מח עצם אנושיים ראשוניים, קולגן מסוג שאני כמרכיב מטריקס ו עם 1 ננומטר של בורטזומיב. לאחר spheroids המיצוק (n = 4) היו מורכב על הקרומי של עובר עוףים. (ג) לאחר 5 ימים שתלי MM בCAM ניתן דמיין ידי הביטוי של eGFP. יכול להצטלם xenografts יומי על ידי מיקרוסקופ סטריאו-הקרינה. ברים מצביעים 500 מיקרומטר. Xenografts MM (ד) יחיד שנכרת עם רקמת CAM subjacent, הומוגני במאגר תמוגה ונמדד בELISA GFP. ריכוזי ה- GFP של גידולים בודדים חושבו (n = 12, ממוצע ± SEM). כוכבים מצביעים על ערכי p <0.05; Bzb = בורטזומיב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. ניתוח של אנגיוגנזה מיאלומה. Xenografts MM (OPM-2 eGFP) תועדו חמישה ימים לאחר השתלה על CAM של עוברי תרנגולת. בהשוואה לשליטה שתלים, treatmאף אוזן גרון עם plitidepsin (1nMol, n = 10) הביאה לגידולים גדלו באופן שטחי שהיו פחות כלי דם ברקמת CAM. כלי דם גדלו לonplants (אדום) נספרים כמתוארים במודל הגרפי של סוגי כלי דם. ברים מצביעים 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. ניתוח של פלישת תא מיאלומה. ניתוח immunohistochemical של xenografts MM (OPM-2 eGFP) עם רקמת מארח CAM subjacent (שטופל בבורטזומיב לעומת קבוצת ביקורת). תאי MM אנושיים מתרבים להכתים חיוביים לקי-67, CD138 וvimentin ולפלוש כצבירי תאים לארח רקמה. כלי דם עוף מגואלות סמני תא ציור קיר ASMA (כלי גדול יותר ועורקים) וdesmin (נימים). Magnificatiעל 200x, כוכביות מצביעות כלי דם CAM. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפיתוח של תרופות חדשות לMM עקשן דורש פחות זמן רב ומערכות ב- vivo יקרים להעריך רגישות של תאי MM אנושיים לתרופות. עד כה, רק מעטים מערכות ב- vivo זמינות להערכה פרה-קלינית של טיפולים אנטי-מיאלומה חדשות. לכולם יש את המגבלות שלהם להקרנה בקנה מידה גדולה של ספריות מתחם 29.

הדגמים הנוכחיים הטובים ביותר עבור תאי MM אנושיים הם עכברי חיסון הלקוי ביותר 7,13,30 ועוברי טורקיה 29. שני העכבר SCID ומודלי xenograft עובר עופות יכולים לשמש כדי לחקור את הביולוגיה של MM ולבחון תרכובות טיפוליות חדשניות. עם זאת, יש לי מערכות עכברי מספר מגבלות, כוללים גנוטיפ טהור, נהלים תובעניים מבחינה טכנית, תקופות תצפית ארוכות ועלויות גבוהות.

במחקר זה, אליפטית 3D רומן ומודל xenograft עופות מוצגות ללימוד ביולוגיה של תא MM אדם שכרוך הנוכחות של MES אדםenchymal תאי גזע ורכיבים תומכים כמו מטריקס. תאי MM מאוד תלויים מייקרו-הסביבה שלהם, כלומר הנוכחות של גורמים הנגזר סטרומה צמיחה, ציטוקינים ורכיבי ECM לשרוד ולהתרבות 31-33. בנוסף, תרופות עשויות להיות לא יעילות או להציג פעילות משתנית כאשר תאי מיאלומה מוגנים על ידי מייקרו-הסביבה המקומית שלהם 31,34.

בהשוואה למודלים עכברי, 3D תאר במבחנה ובמערכות מודל vivo הם לא יקר, מהירים, וקלים לטפל. בנוסף, ההשתלה של 3D MM spheroids לעוברי עוף מאפשרת הניתוח של אנגיוגנזה המושרית מיאלומה. מגבלה של המערכת שלנו היא הזמן הקצר של צמיחת תאי MM וכך, הניתוח של גרורות לעצמות עופות אינו אפשרי. מגבלה נוספת של המודלים שלנו היא שאנו עובדים עם יישום מקומי של תרופות ברפואה המשלימה והאלטרנטיבית שעשויים שלא לשקף יישומים מערכתיים ומחזור סמים / שינוי על ידי אנזימי כבד. בבנוסף, שיעור הישרדות כ -50% עד ההשתלה נצפה בשל לשעבר אובו תנאי גידול של עוברי תרנגולת. לגבי סמנים האנדותל לניתוח IHC, רוב הסמנים המשמשים בסעיף אנושי ועכבר כדי להכתים תאי האנדותל אינם ספציפיים לכלי דם בעוף. לכן, אנו ממליצים צביעה לתא סמני ציור קיר desmin / ASMA או ההזרקה של קטינים לעוברי עוף 35. לא כל שורות התאים האנושיות הזמינות מיאלומה תגדל פולשני לתוך רקמת מארח עוף ולהציג צמיחה שטחית. זה יגרום רקמה נהרסה לאחר חיתוך חלקים בmicrotome. יתר על כן, טיפול מיוחד (אנטיביוטיקה בחירה) יש לנקוט שתאי transfected לא לאבד את ביטוי transgene GFP בתוך זמן, בשל ארגון מחדש גנטי קבוע או תהליכי מתילציה DNA.

לסיכום, המודל שלנו עוף עובר xenograft של תאי MM אדם עם תמיכת סטרומה מספק מודל ב- vivo לשחזור וצפוי לסטצמיחת dy אנושית תא MM ואנגיוגנזה. זה מתואר מודל MM עשוי להקל מהר יותר ב- vivo תהליכי מיון של תרופות אנטי-MM, עוזר להפחית את זמן פיתוח ועלויות לתרופות חדשניות. בצעדים לשיפור נוספים, כגון חומר עצם החלפה, מטריצת ECM מורכבת וציטוקינים המערכת ניתן לשפר לבדיקה גם תרופות נגד דגימות מטופל. זה הוא תנאי הכרחי לרפואת סרטן אישית ובדיקה של רגישות תרופה בחולי MM עקשן בודדים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש הסופרים לא אינטרסים כלכליים מתחרים

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI-8226 cells DSMZ ACC 9 STR profiled
OPM-2 cells DSMZ ACC 50 STR profiled
Human mesenchymal stem cells  PromoCell PC-C-12974
HEK293FT cells  Invitrogen R700-07
RPMI1640 Medium Sigma Aldrich R0883
Fetal Bovine Serum  HyClone ThermoScientific SH30070.03
L-Glut- Pen- Strep solution Sigma G6784
DMEM Medium Gibco 31966
NEAA Sigma Life Sciences M7145
Transfection Medium/Opti-MEM  Gibco 51985
eGFP lentiviral particles GeneCopoeia LPP-EGFP-LV105 Ready to use viral particles
pLenti6/V5Dest6 eGFP vector Invitrogen PN 35-1271 from authors
ViralpowerTM packaging mix  Invitrogen P/N 35-1275
Transfection reagent/ Lipofectamin 2000 Invitrogen 11668-027
Blasticidin Invitrogen R210-01
Neomycin Biochrom A2912
Collagen-Type1  Rat Tail BD Biosciences 354236
DMEM powder Life Technologies Art.Nr. 10338582
plitidepsin Pharmamar
bortezomib LKT Lab., Inc. B5871
SPF-white hen eggs Charles River Fertilized  white Leghorn  chicken eggs
Plastic weighing boats neoLab Art.Nr. 1-1125 for ex-ovo culture
Petridish square (Lids) Simport D210-16 for ex-ovo culture
RIPA Buffer (10x) Cell Signaling #9806
Protease Inhibitor Tablets Roche 11 836 170 001
Complete Mini EDTA-free
GFP ELISA Cell Biolabs, Inc. AKR-121
Histocette II Simport M493-6
PFA  37% Roth 7398.1
DPBS Lonza BE17-512F
Ethanol absolut Normapur 20,821,321
Roti-Histol Roth Art.Nr.6640.4
Paraplast Sigma A6330
SuperFrost Microscope Slides R. Langenbrinck  Art.-Nr.
Labor- u. Medizintechnik 03-0060
DakoCytomation Wash Buffer 10x DakoCytomation Code-Nr.
S 3006
Target Retrieval Solution (10x)  pH 6,1 DAKO Code-Nr.
S 1699
H2O2 Merck
m-a-hu ASMA clone 1A4 DAKO M0851
m-a-hu CD138 clone MI15 DAKO M7228
m-a-hu Vimentin clone V9 DAKO M0725
m-a-hu Desmin clone D33 DAKO  M0760
m-a-hu Ki67  clone MIB-1   DAKO  M7240
biotinylated goat- anti-mouse IgG Vector Laboratories Inc. BA-9200
Vectastain Elite ABC Kit Vector Laboratories Inc. # PK-6100
FAST DAB Tablet Set. Sigma Biochemicals # D4293
Mayer’s haemalaun solution Merck 1,092,490,500
Roti Histokitt Roth Art.Nr.6638.2
Bench top rotary microtome Thermo Electron, Shandon Finesse ME+
Tissue embedding station Leica, TP1020
Egg-Incubator Grumbach  BSS160
Stereo fluorescence microscope equipped with an connected with a digital camera (Olympus E410) and flexible cold light  Olympus, SZX10
Ultra Turrax  IKA T10 Homogenizer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kuehl, W. M., Bergsagel, P. L. Multiple myeloma: evolving genetic events and host interactions. Nat.Rev.Cancer. 2 (3), 175-187 (2002).
  2. Kumar, S. K., Gertz, M. A. Risk adapted therapy for multiple myeloma: back to basics. Leuk.Lymphoma. , (2014).
  3. Prideaux, S. M., Conway, O. E., Chevassut, T. J. The genetic architecture of multiple myeloma. Adv.Hematol. 2014, 864058 (2014).
  4. Chauhan, D., et al. A novel orally active proteasome inhibitor ONX 0912 triggers in vitro and in vivo cytotoxicity in multiple myeloma. Blood. 116 (23), 4906-4915 (2010).
  5. Kuehl, W. M. Mouse models can predict cancer therapy. Blood. 120 (2), 238-240 (2012).
  6. Nefedova, Y., Gabrilovich, D. Mechanisms and clinical prospects of Notch inhibitors in the therapy of hematological malignancies. Drug Resist.Updat. 11 (6), 210-218 (2008).
  7. Yaccoby, S., Barlogie, B., Epstein, J. Primary myeloma cells growing in SCID-hu mice: a model for studying the biology and treatment of myeloma and its manifestations. Blood. 92 (8), 2908-2913 (1998).
  8. Dazzi, F., et al. Normal and chronic phase CML hematopoietic cells repopulate NOD/SCID bone marrow with different kinetics and cell lineage representation. Hematol.J. 1 (5), 307-315 (2000).
  9. Lock, R. B., et al. The nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mouse model of childhood acute lymphoblastic leukemia reveals intrinsic differences in biologic characteristics at diagnosis and relapse. Blood. 99 (11), 4100-4108 (2002).
  10. Feuring-Buske, M., et al. Improved engraftment of human acute myeloid leukemia progenitor cells in beta 2-microglobulin-deficient NOD/SCID mice and in NOD/SCID mice transgenic for human growth factors. Leukemia. 17 (4), 760-763 (2003).
  11. Pearce, D. J., et al. AML engraftment in the NOD/SCID assay reflects the outcome of AML: implications for our understanding of the heterogeneity of AML. Blood. 107 (3), 1166-1173 (2006).
  12. Li, M., et al. Combined inhibition of Notch signaling and Bcl-2/Bcl-xL results in synergistic antimyeloma effect. Mol.Cancer Ther. 9 (12), 3200-3209 (2010).
  13. Tassone, P., et al. A clinically relevant SCID-hu in vivo model of human multiple myeloma. Blood. 106 (2), 713-716 (2005).
  14. Ranga, A., Gjorevski, N., Lutolf, M. P. Drug discovery through stem cell-based organoid models. Adv.Drug Deliv.Rev. 69-70, 19-28 (2014).
  15. Pereira, R. F., Barrias, C. C., Granja, P. L., Bartolo, P. J. Advanced biofabrication strategies for skin regeneration and repair. Nanomedicine.(Lond). 8 (4), 603-621 (2013).
  16. Fischbach, C., et al. Engineering tumors with 3D scaffolds). Nat.Methods. 4 (10), 855-860 (2007).
  17. Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken embryo. J.Vis.Exp. (41), (2010).
  18. Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chapter 2. Chick embryo chorioallantoic membrane models to quantify angiogenesis induced by inflammatory and tumor cells or purified effector molecules. Methods Enzymol. 444, 21-41 (2008).
  19. Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochem.Cell Biol. 130 (6), 1119-1130 (2008).
  20. Kern, J., et al. GRP-78 secreted by tumor cells blocks the antiangiogenic activity of bortezomib. Blood. 114 (18), 3960-3967 (2009).
  21. Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Presta, M. The gelatin sponge-chorioallantoic membrane assay. Nat.Protoc. 1 (1), 85-91 (2006).
  22. Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Exp.Cell Res. , (2014).
  23. Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J.Vis.Exp. (33), (2009).
  24. Kobayashi, T., et al. A chick embryo model for metastatic human prostate cancer. Eur.Urol. 34 (2), 154-160 (1998).
  25. Koop, S., et al. Fate of melanoma cells entering the microcirculation: over 80% survive and extravasate. Cancer Res. 55 (12), 2520-2523 (1995).
  26. Martowicz, A., Spizzo, G., Gastl, G., Untergasser, G. Phenotype-dependent effects of EpCAM expression on growth and invasion of human breast cancer cell lines. BMC.Cancer. 12, 501 (2012).
  27. Martowicz, A., et al. EpCAM overexpression prolongs proliferative capacity of primary human breast epithelial cells and supports hyperplastic growth. Mol.Cancer. 12, 56 (2013).
  28. Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. 6, 34 (2006).
  29. Farnoushi, Y., et al. Rapid in vivo testing of drug response in multiple myeloma made possible by xenograft to turkey embryos. Br.J.Cancer. 105 (11), 1708-1718 (2011).
  30. Wunderlich, M., Krejci, O., Wei, J., Mulloy, J. C. Human CD34+ cells expressing the inv(16) fusion protein exhibit a myelomonocytic phenotype with greatly enhanced proliferative ability. Blood. 108 (5), 1690-1697 (2006).
  31. Hideshima, T., Mitsiades, C., Tonon, G., Richardson, P. G., Anderson, K. C. Understanding multiple myeloma pathogenesis in the bone marrow to identify new therapeutic targets. Nat.Rev.Cancer. 7 (8), 585-598 (2007).
  32. Parikh, M. R., Belch, A. R., Pilarski, L. M., Kirshner, J. A three-dimensional tissue culture model to study primary human bone marrow and its malignancies. J.Vis.Exp. (85), (2014).
  33. Schuler, J., Ewerth, D., Waldschmidt, J., Wasch, R., Engelhardt, M. Preclinical models of multiple myeloma: a critical appraisal. Expert.Opin.Biol.Ther. 13, Suppl 1. S111-S123 (2013).
  34. Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112 (7), 2935-2945 (2008).
  35. Jilani, S. M., et al. Selective binding of lectins to embryonic chicken vasculature. J.Histochem.Cytochem. 51 (5), 597-604 (2003).

Tags

רפואה גיליון 99 CAM אנגיוגנזה תאי mesenchymal מיאלומה נפוצה GFP 3 תרבית רקמה ממדית xenografts גידול
הקמת מודל xenograft מיאלומה נפוצה אדם בעוף לחקר צמיחת גידול, פלישה ואנגיוגנזה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martowicz, A., Kern, J., Gunsilius,More

Martowicz, A., Kern, J., Gunsilius, E., Untergasser, G. Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis. J. Vis. Exp. (99), e52665, doi:10.3791/52665 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter