Summary
ヒト多発性骨髄腫（MM）細胞は、間葉系細胞と生存および増殖のための細胞外マトリックス成分の支援微小環境が必要です。我々は、腫瘍の増殖、浸潤および血管形成に対する抗がん剤の効果を研究するために移植されたヒト骨髄腫および間葉細胞とin vivoでニワトリ胚モデルを確立しました。
Abstract
多発性骨髄腫（MM）、悪性形質細胞疾患は、不治のままであり、新規の薬剤は、患者の予後を改善するために必要とされます。これにより、骨の微小環境と自動/パラクリン成長因子の欠如により、ヒトMM細胞を育成することは困難です。したがって、ヒトMM細胞に対する新規治療薬の作用を研究するために、in vitroおよびin vivo培養系において適切な確立が急務となっています。ここでは、in vitroおよびin vivoで 、複雑な3D環境内でヒト多発性骨髄腫細胞を増殖するためのモデルを提示します。 MM細胞株OPM-2及びRPMI-8226は、GFP導入遺伝子を発現するようにトランスフェクトされた三次元スフェロイド、ヒト間葉系細胞とコラーゲンI型基質の存在下で培養しました。加えて、スフェロイドは、ニワトリ胚の漿尿膜（CAM）に移植した腫瘍の成長は、ステレオ蛍光顕微鏡法によってモニターしました。どちらのモデルも、新たな治療DRUの研究を可能にします複雑な3D環境と導入遺伝子に特異的なGFP-ELISAにおける移植片の均質化後の腫瘍細胞塊の定量化でGS。また、下にある宿主組織へのホストおよび腫瘍細胞の浸潤の血管新生応答は、実体顕微鏡により毎日モニターし、ヒト腫瘍細胞（KI-67、CD138、ビメンチン）、または宿主壁細胞被覆血管に対する免疫組織化学染色によって分析することができます（デスミン/ ASMA）。
結論として、onplantシステムは、複雑な3D環境でのMM細胞の増殖と血管新生を研究することができますし、MM細胞の生存および増殖を標的とする新規治療化合物のスクリーニングを可能にします。
Protocol
//：実験動物福祉のhatching.The NIH Officeは、この領域（HTTPで書かれたガイダンスを提供するまでオーストリアの法律、および米国公衆衛生サービスの実験動物福祉の事務所によると、鳥類の胚は生きた脊椎動物とは見なされませんwww.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htmおよびNIH公開番号：06から4515）。
1.細胞培養およびレンチウイルストランスフェクション
- 培養MM細胞株OPM-2、RPMI-8226およびRPMI1640培地中の骨髄からヒト間葉系幹細胞、存在下で、10％ウシ胎児ウシ血清及び100 IU / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシンおよび2mMグルタミン37℃、5％CO 2。
- トランスフェクション5×10 30μlのリポソームトランスフェクション試薬とトランスフェクション培地（10ml）を利用してウイルスパッケージングミックス（9μgの）DNAおよび3μgのをpLenti6 / V5 DESTのeGFPベクターと6 HEK 293FT細胞。 12時間後にトランスフェクション培地を除去し、10％ウシ胎仔血清および1％非必須アミノ酸（NEAA）で10ml DMEM培地を加えます。
- 5日後、水泳細胞（千XG、5分）の遠心分離後HEK293FT細胞の上清を収集します。他の場所28記載されているように、リアルタイムPCRによりウイルス力価を決定します。
- 完全増殖培地中で24ウェルプレート中のeGFPレンチウイルス粒子（1×10 5粒子）で1×10 6 MM細胞をトランスフェクション。 3日後、培地を2 / mlのブラストサイジンを添加することにより、選択プロセスを開始します。市販のeGFPレンチウイルスの場合は、500 / mlのネオマイシンを使用しています。
- 選択の2週間後、MM細胞をeGFP発現のクラスターが表示されます。遠心分離（千XG、5分）によって細胞を収集し、実験のためにOPM-2 EGFPおよびRPMI-8226 のeGFPサブラインとしてそれらを展開する（セクション2および3）。
2. 3D-多発性骨髄腫スフェロイドモデル
- チルI型コラーゲン溶液および10×DMEM On個の氷。
- コラーゲンマトリックスに10×DMEM培地の1/10量を混ぜます。 7.4のpH値に酸性コラーゲン溶液を中和するために水酸化ナトリウム（0.2 N）を加えます。氷上ストアコラーゲン/媒体液。
- ヒト間葉系細胞（50,000細胞/スフェロイド、 すなわち、30μlの低下）と、トランスジェニックMM細胞株（スフェロイド250,000、OPM-2 のeGFPまたはRPMI-8226 のeGFP）を混ぜます。
- 15ミリリットルチューブ（1,000×gで、5分間）で遠心細胞混合物は、細胞ペレットにコールド用意コラーゲン混合物（1mLの）を追加し、（千μlの先端で）よく混ぜます。
- 直ちに滅菌パラフィンフィルム上に24ウェルプレート中で（100μLチップで）コラーゲン/細胞混合物を30μlのピペットと細胞/コラーゲン混合物は、37℃（ 図1Aを参照）で30分間重合を可能にします。
- 1,10および100nMのボルテゾミブを含む1mLの培養培地でオーバーレイMMスフェロイド（ 図1B参照 ）。
- 37℃でのインキュベーションの72時間後、文書スフェロイドによって蛍光実体顕微鏡（ 図1C参照 ）。
- GFPを測定するための反応管に広い平坦なジョーを有する鉗子を使用して、各スフェロイドを転送（ 図1Dを参照）。
CAM 3. 3D多発性骨髄腫異種移植モデル
- 3日間37°Cおよび70％の湿度で、鳥類の卵のための特別なインキュベーター中で鶏の卵をインキュベートします。
- その後、オープン卵と移植胚は、細胞培養プレートの蓋をエタノール、正方形、10 cmのプラスチック製計量ボートで滅菌し、CAMが（ 図2A参照 ）を開発することができるように、さらに6日間「EX OVO」をインキュベートします。
- 氷の上にI型コラーゲン溶液および10×DMEMを冷やし、コラーゲンマトリックスに10×DMEM培地の1/10量を混ぜて、7.4のpH値に酸性コラーゲン溶液を中和するために水酸化ナトリウム（0.2 N）を追加します。氷上ストアコラーゲン/媒体液。
- トランスジェニックMM細胞株（OPM-2 のeGFPまたはミックスRPMI-8226 のeGFP;ヒト間葉系細胞とスフェロイド）250,000（50,000細胞/スフェロイド）。
- 15ミリリットルチューブ（千XG、5分、各試験化合物1バイアル用）で遠心細胞は、細胞ペレットに（望ましい稼動濃度で）薬物と1mLの冷たい準備コラーゲン混合物を追加し、（千μLチップで）よく混ぜます。
- 37℃での細胞外マトリックスの重合を可能にするために30分間よくパテ6にコラーゲンが低下パラフィルム上（30μlの各）を配置します。
- （2センチメートル離れた胚）から9日齢のニワトリ胚のCAMの未処理面に鉗子を用いて、ステップ3.6からの転送「オンプラント」（各ニワトリ胚のための4オンプラント、 図2Bを参照してください）
- 蛍光実体顕微鏡によるインビボでの 37℃での卵のインキュベーター中で成長し、70％湿度、文書異種移植の5日後（ 図2Cを参照）。 5時間冷蔵庫で4℃での低体温によってニワトリ胚を安楽死させます。
- 広い平坦な顎を持つ眼科はさみや鉗子による直下のCAM組織との異種移植片を取り除きます。 GFPの測定のためにそれらを使用します（セクション4、 図2Dを参照）または血管および/ または侵入腫瘍細胞（第5節）の免疫組織化学的分析のため。
4. ELISAによるEGFPタンパク質の定量
- 200 / mlのプロテアーゼ阻害剤を含有する0.5ミリリットルのRIPAバッファーに各MMスフェロイドまたは切除された異種移植片を転送します。
- 氷上の組織ホモジナイザーでスフェロイド/異種移植片を均質化。
- 液体窒素および37℃の水浴三の凍結/解凍サイクルを実行します。
- 20分（12000グラム）とストア上清4℃で遠心分離ホモジネート。
- サンプルをELISAキットのアッセイ緩衝液（200μL）で1:20に希釈します。製造業者のプロトコルに従って、ビオチン化抗GFP抗体を用いた商用GFP ELISAキットによりGFP-レベルを測定します。
5. Immunohi血管や侵入腫瘍細胞のstochemical分析
- 4℃で4％パラホルムアルデヒドO / NでCAM領域で切り出し異種移植片を修正しました。
- 包埋カセットに固定された異種移植片を配置し、段階的な増加アルコールシリーズ（50％、70％、80％、95％エタノール、キシロール、パラフィン、各ステップ60分間）を用いて組織の埋め込みステーションに移します。
- 卓上型ロータリーミクロトームを使用することにより、セクションの異種移植片（5ミクロン）。 O / N 56°Cでのガラススライド上のパラフィン切片焼きます。
- 二重蒸留水に減少段階的アルコール系によって脱パラフィン切片（キシロール、95％、80％、70％、50％エタノール、再蒸留水;各ステップ10分）。
- 抗原回復溶液（; pHは7.0、体積100μlのクエン酸塩緩衝液）との水浴（95℃、20分）で抗原回復を実行します。
- 30分間、100μlの3％H 2 O 2 /メタノールを用いて内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックします。
- を含むPBSでブロックセクション45分（体積100μl）を、10％ウシ胎児血清。
- 一次抗体の100μlで1時間染色を（1μgの/ ml）を、室温で、1％ウシ胎児血清を含むPBSで希釈しました。
- PBSで3回洗浄した後、室温で1％ウシ胎児血清を含むPBS中のビオチン化二次抗体（0.1μgの/ ml）で1時間インキュベートします。
- PBSで3回洗浄した後、製造業者の説明書に従って、アビジン/ビオチン複合体（ABC）とジアミノベンジジン（DAB）基質溶液によって呈色反応を行います。
- 5.11。ヘマトキシリンで二重蒸留水、対比にセクションを転送することによって反応を停止し、合成封入剤とのセクションをマウントします。
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Representative Results
3D多発性骨髄腫スフェロイドアッセイにおける標的化合物のインビトロでの分析で
これにより、in vitroで初代ヒトMM細胞を培養する制限に、我々は、細胞外成長マトリックスおよび骨髄（ 図1A、B）から支持初代ヒト間葉系細胞を利用したヒトMM細胞株のためのインビトロ培養モデルにおける新しい3Dを確立しました。 EGFPトランスジェニックMM細胞株は、スフェロイド内の3D成長後に視覚化し、MM腫瘍塊の定量化を可能にします。両方のMM細胞株OPM-2 EGFPおよびRPMI-8226 のeGFPステレオ蛍光顕微鏡でGFPの発現によって可視化したボルテゾミブ腫瘍の漸増濃度（1〜100nMの）の存在下で3日間培養した（ 図1C） 。腫瘍細胞塊は、スフェロイドの均質化後に定量化し、GFP-ELISA（ 図1でのeGFPの内容を測定しました。D）。
ニワトリ胚における多発性骨髄腫異種移植片における標的化合物の生体内分析で
三日目のニワトリ胚は6日間とMM細胞（ 図2A）のグラフトに使用9日目の元OVO培養しました。 EGFPトランスジェニック骨髄腫細胞（OPM-2 EGFP）、ヒト骨髄間葉系細胞は、細胞外マトリックス成 分としてコラーゲンI型に包埋した一緒。標的物質ボルテゾミブは、1ナノモル（ 図2B）で局所的に適用しました。各動物4「オンプラント」のニワトリ胚の漿尿膜（CAM）に移植しました。 5日後、MM異種移植片は、eGFPの発現によって可視化することができた腫瘍を形成しました。対照と比較して、ボルテゾミブは、異種移植片において、MM細胞の増殖を阻害しました。移植片は、よりグリーンMM腫瘍細胞塊（ 図2C）を示しました。目からの単一のMM異種移植片REE異なる動物（N = 12）は、均質化を切除し、その後、GFP ELISAによって測定しました。対照と直接比較はボルテゾミブで処理した異種移植片は、有意に減少し、骨髄腫細胞塊（ 図2D）を有していました。
ニワトリ胚における血管新生応答および骨髄腫異種移植片の浸潤の生体内分析で
オンプラントの周りの血管新生応答は、実体顕微鏡により観察することができます。異種移植片の血管新生が大幅に薬物処置異種移植片（1ナノモルPlitidepsin、 図3）に低下しました。血管新生応答は、Ribatti ら 21によってゼラチンスポンジアッセイについて記載したようにonplant出芽血管をカウントすることによって定量しました。
侵略の分析のために、異種移植片は、隣接するCAM領域で切り出しました。異種移植片は、固定され、パラフィンに包埋し、切片を作製した（ 図4 図4）を検出するために、ヒトのKi-67、ビメンチンおよびCD138に対する抗体で染色しました。
図1. 3D多発性骨髄腫スフェロイド。細胞外マトリックス成 分として（A）OPM-2 のeGFPの生成および一次ヒト骨髄間葉系細胞とコラーゲンI型を含むRPMI-8226 のeGFPスフェロイド。（B）スフェロイドを培地とボルテゾミブのそれぞれの濃度とインキュベートしました（1- 100 nM）を、（C）MMスフェロイドを3日間増殖させ、ステレオ蛍光顕微鏡で撮影しました。バーが500μmを示す。（D）シングルSPHeroidsは、溶解緩衝液中でホモジナイズし、その後、GFP ELISAで測定しました。単一のスフェロイドのGFP濃度は、（N = 5、平均±SEM）を算出しました。星は、P <0.05の値を示しています。 （株）=対照; BZB =ボルテゾミブ。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
2.多発性骨髄腫異種移植モデル図。 （A）発生の日に9 元卵ニワトリ胚を実験グラフトのために使用した。（B）、OPM-2 EGFPおよびRPMI-8226 eGFPの細胞外マトリックス成 分としてコラーゲンタイプI、一次ヒト骨髄間葉系細胞と混合し、そしてボルテゾミブの1 nMのです。凝固スフェロイド（N = 4）をニワトリ胚の漿尿膜上に移植した後にS。（C）5日後CAMにおけるMM移植片のeGFPの発現を可視化することができます。異種移植片は、ステレオ蛍光顕微鏡で毎日撮影することができます。バーは500μmで示す。（D）シングルMM異種移植片は、下にあるCAM組織と切除溶解緩衝液中で均質化し、GFP ELISAで測定しました。単一の腫瘍のGFP濃度は、（N = 12、平均±SEM）を算出しました。星は、P <0.05の値を示しています。 BZB =ボルテゾミブ。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
骨髄腫血管新生の図3.分析。MM異種移植片（OPM-2 のeGFP）は 5日、ニワトリ胚のCAMに移植した後に記録しました。移植片を対照と比較して、treatmplitidepsin（1nMol、N = 10）との耳鼻咽喉科は、CAM組織による小さい血管が新生した表面的に増殖する腫瘍をもたらしました。血管タイプのグラフィカルモデルに示すようにオンプラント（赤）に成長する血管を計数しました。バーは、1ミリメートルを示す。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
骨髄腫細胞浸潤の図4.分析。下にあるCAMホスト組織とMM異種移植片（OPM-2 EGFP）の免疫組織化学的分析（対照に対してボルテゾミブ処理されました）。増殖したヒトMM細胞は、キ= 67、CD138およびビメンチンについて陽性に染色し、細胞クラスターが組織をホストとして侵入します。鶏の血管が壁画細胞マーカーASMA（大きな血管と動脈）とデスミン（毛細血管）で染色します。 Magnificati200Xに、アスタリスクは、CAMの血管を示している。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
難治性MMのための新たな治療薬の開発は、薬物に対するヒトMM細胞の感受性を評価するために少ない時間がかかり、高価な生体内のシステムを必要とします。これまで、わずか数の生体内のシステムは、新しい抗骨髄腫治療の前臨床評価のために利用可能です。それらのすべては、化合物ライブラリー29の大規模スクリーニングのためにそれらの限界があります。
ヒトMM細胞のための最高の現行モデルは、高度免疫不全マウス7,13,30と七面 鳥の胚29です。 SCIDマウスおよび鳥類胚異種移植モデルの両方は、MMの生物学を研究し、新規の治療化合物を試験するために使用することができます。しかし、マウス系は、近交系の遺伝子型を含む、技術的に要求の厳しい手順、長い観察期間と高いコストを、いくつかの制限があります。
本研究では、新規な3Dスフェロイドおよびトリ異種移植モデルは、ヒトのMESの存在を伴うヒトMM細胞の生物学を研究するために提示されています支持部品としてenchymal幹細胞及び細胞外マトリックス。 MM細胞が強く、それぞれの微小環境に依存して生存すると31-33を増殖する間質由来増殖因子、サイトカインおよびECM成分の存在、すなわち。また、薬物は非効率的であるか、または骨髄腫細胞は、それらの局所微小環境31,34により保護されていたときに、変化した活性を示すことがあります。
マウスモデルと比較して、in vitro及びin vivoモデル系で記述さ3Dは、高価で迅速、かつ取り扱いが容易ではありません。また、ニワトリ胚の3D MMスフェロイドの移植は骨髄腫誘導血管形成の分析を可能にします。我々のシステムの限界は、MM細胞増殖の短時間であり、したがって、鳥の骨への転移の分析は不可能です。我々のモデルのさらなる制限は、我々は肝臓の酵素によって全身適用および薬物代謝回転/変更が反映されない場合がありますCAMにおける薬物の局所適用では動作していることです。でさらには、移植するまで約50％の生存率が原因ニワトリ胚の成長条件卵元に観察されました。 IHC分析のための内皮マーカーに関しては、内皮細胞を染色するために、ヒトおよびマウスのセクションで使用されているほとんどのマーカーは、ニワトリの血管に固有のものではありません。したがって、我々は、ニワトリ胚に壁画細胞マーカーデスミン/ ASMAまたはレクチンの注射のために35を染色することをお勧めします。いない使用可能なすべてのヒト骨髄腫細胞株は、ニワトリ宿主組織に侵襲的に成長し、表面的な成長が表示されます。これは、ミクロトームのセクションを切断した後に破壊された組織になります。また、特別なケア（選択抗生物質）は、トランスフェクトされた細胞は、永久遺伝子再配列またはDNAメチル化プロセスに起因する時間内のGFP導入遺伝子の発現を、失わないように注意しなければなりません。
結論として、間質支持体と、ヒトMM細胞の我々のニワトリ胚移植モデルは、STUに再現可能かつ予測可能な生体内モデルを提供しますDYヒトMM細胞の増殖と血管新生。これは、MMモデルは開発時間および新規薬物のコスト削減に貢献し、より速い生体内の抗MM剤のスクリーニングを容易にすることができる処理します。このような骨置換材料としての更なる改善のステップ、と、複雑なECMマトリックスおよびシステムは、患者のサンプルに対しても治療法を試験するために改善されるかもしれないサイトカイン。これは、パーソナライズされたがん医療、個々の耐火MM患者における薬剤感受性の試験のための前提条件です。
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Disclosures
著者らは、全く競合する金融利害関係はありません
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-8226 cells | DSMZ | ACC 9 | STR profiled |
| OPM-2 cells | DSMZ | ACC 50 | STR profiled |
| Human mesenchymal stem cells | PromoCell | PC-C-12974 | |
| HEK293FT cells | Invitrogen | R700-07 | |
| RPMI1640 Medium | Sigma Aldrich | R0883 | |
| Fetal Bovine Serum HyClone | ThermoScientific | SH30070.03 | |
| L-Glut- Pen- Strep solution | Sigma | G6784 | |
| DMEM Medium | Gibco | 31966 | |
| NEAA | Sigma Life Sciences | M7145 | |
| Transfection Medium/Opti-MEM | Gibco | 51985 | |
| eGFP lentiviral particles | GeneCopoeia | LPP-EGFP-LV105 | Ready to use viral particles |
| pLenti6/V5Dest6 eGFP vector | Invitrogen | PN 35-1271 | from authors |
| ViralpowerTM packaging mix | Invitrogen | P/N 35-1275 | |
| Transfection reagent/ Lipofectamin 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| Blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| Neomycin | Biochrom | A2912 | |
| Collagen-Type1 Rat Tail | BD Biosciences | 354236 | |
| DMEM powder | Life Technologies | Art.Nr. 10338582 | |
| plitidepsin | Pharmamar | ||
| bortezomib | LKT Lab., Inc. | B5871 | |
| SPF-white hen eggs | Charles River | Fertilized white Leghorn chicken eggs | |
| Plastic weighing boats | neoLab | Art.Nr. 1-1125 | for ex-ovo culture |
| Petridish square (Lids) | Simport | D210-16 | for ex-ovo culture |
| RIPA Buffer (10x) | Cell Signaling | #9806 | |
| Protease Inhibitor Tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
| Complete Mini EDTA-free | |||
| GFP ELISA | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
| Histocette II | Simport | M493-6 | |
| PFA 37% | Roth | 7398.1 | |
| DPBS | Lonza | BE17-512F | |
| Ethanol absolut | Normapur | 20,821,321 | |
| Roti-Histol | Roth | Art.Nr.6640.4 | |
| Paraplast | Sigma | A6330 | |
| SuperFrost Microscope Slides | R. Langenbrinck | Art.-Nr. | |
| Labor- u. Medizintechnik | 03-0060 | ||
| DakoCytomation Wash Buffer 10x | DakoCytomation | Code-Nr. | |
| S 3006 | |||
| Target Retrieval Solution (10x) pH 6,1 | DAKO | Code-Nr. | |
| S 1699 | |||
| H2O2 | Merck | ||
| m-a-hu ASMA clone 1A4 | DAKO | M0851 | |
| m-a-hu CD138 clone MI15 | DAKO | M7228 | |
| m-a-hu Vimentin clone V9 | DAKO | M0725 | |
| m-a-hu Desmin clone D33 | DAKO | M0760 | |
| m-a-hu Ki67 clone MIB-1 | DAKO | M7240 | |
| biotinylated goat- anti-mouse IgG | Vector Laboratories Inc. | BA-9200 | |
| Vectastain Elite ABC Kit | Vector Laboratories Inc. | # PK-6100 | |
| FAST DAB Tablet Set. | Sigma Biochemicals | # D4293 | |
| Mayer’s haemalaun solution | Merck | 1,092,490,500 | |
| Roti Histokitt | Roth | Art.Nr.6638.2 | |
| Bench top rotary microtome | Thermo Electron, Shandon Finesse ME+ | ||
| Tissue embedding station | Leica, TP1020 | ||
| Egg-Incubator | Grumbach | BSS160 | |
| Stereo fluorescence microscope equipped with an connected with a digital camera (Olympus E410) and flexible cold light | Olympus, SZX10 | ||
| Ultra Turrax | IKA T10 | Homogenizer |
References
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