Summary
Las células humanas de mieloma múltiple (MM) requieren el microambiente de apoyo de células mesenquimales y componentes de la matriz extracelular para la supervivencia y proliferación. Hemos establecido un modelo in vivo de embriones en pollo con células de mieloma y mesenquimales humanas injertadas para estudiar los efectos de fármacos contra el cáncer en el crecimiento tumoral, la invasión y la angiogénesis.
Abstract
El mieloma múltiple (MM), una enfermedad de las células plasmáticas malignas, sigue siendo incurable y nuevos fármacos son necesarios para mejorar el pronóstico de los pacientes. Debido a la falta del microambiente óseo y factores de crecimiento de auto / paracrina células MM humanos son difíciles de cultivar. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de establecer adecuado in vitro y en sistemas de cultivo in vivo para estudiar la acción de nuevas terapias en las células MM humanos. Aquí se presenta un modelo para crecer células de mieloma múltiple humanos en un entorno 3D complejo in vitro e in vivo. Líneas celulares de MM OPM-2 y RPMI-8226 fueron transfectadas para expresar el transgén GFP y se cultivaron en la presencia de células mesenquimales humanos y de colágeno de tipo I matriz como esferoides tridimensionales. Además, esferoides fueron injertados en la membrana corioalantoidea (CAM) de embriones de pollo y el crecimiento tumoral se controló por microscopía de fluorescencia estéreo. Ambos modelos permiten el estudio de la novela dru terapéuticags en un entorno 3D complejo y la cuantificación de la masa celular del tumor después de la homogeneización de los injertos en un GFP-ELISA-transgén específico. Por otra parte, las respuestas angiogénicas de la acogida y la invasión de células tumorales en el tejido huésped subyacente pueden ser monitoreados diariamente por un microscopio estéreo y se analizaron por tinción inmunohistoquímica frente a células tumorales humanas (Ki-67, CD138, vimentina) o células anfitrionas murales que cubren los vasos sanguíneos (desmina / ASMA).
En conclusión, el sistema onplant permite estudiar el crecimiento de células MM y la angiogénesis en un entorno 3D complejo y permite la detección de nuevos compuestos terapéuticos dirigidos a la supervivencia y proliferación de las células MM.
Protocol
De acuerdo con la ley austriaca, y la Oficina de Bienestar de los Animales de Laboratorio de los embriones de aves de servicios de salud pública de Estados Unidos no son considerados como animales vertebrados vivos hasta hatching.The Oficina de NIH de Laboratorio Bienestar Animal ha proporcionado orientación escrita en esta área (http: // www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm y NIH Publication No .: 06-4515).
1. Cultivo de células y transfección Lentiviral
- Líneas de cultivo de células MM OPM-2, RPMI-8226 y las células madre mesenquimatosas humanas de la médula ósea en medio RPMI 1640, suplementado con 10% de suero bovino fetal de ternera y 100 IU / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y glutamina 2 mM en presencia de 5% de CO 2 a 37 ° C.
- Transfectar 5 x 10 6 células HEK 293FT con la mezcla viral empaquetamiento del ADN (9 g) y 3 g pLenti6 / V5 dest eGFP vector por el uso de 30 l de reactivo de transfección liposomal y medio de transfección (10 ml). Retire medio de transfección después de 12 h, yañadir 10 ml de medio DMEM con 10% de suero bovino de ternera y 1% de aminoácidos no esenciales (NEAA).
- Después de 5 días, recoger los sobrenadantes de células HEK293FT después de la centrifugación de las células de natación (1.000 xg, 5min). Determinar el título viral por PCR en tiempo real como se describe en otra parte 28.
- Transfectar 1 x 10 6 células MM con partículas lentivirales eGFP (1 x 10 5 partículas) en una placa de 24 pocillos en medio de crecimiento completo. Después de 3 días, iniciar el proceso de selección mediante la adición de 2 mg / ml blasticidina al medio de cultivo. Para el eGFP lentivirus comercialmente disponible, utilizar 500 mg / ml de neomicina.
- Después de 2 semanas de selección, aparecerá racimos de células que expresan eGFP MM; recoger las células por centrifugación (1.000 xg, 5 min) y expandirlos como OPM-2 eGFP y RPMI-8226 sublíneas eGFP para experimentos (sección 2 y 3).
2. 3D-múltiple Modelo mieloma esferoide
- Solución de colágeno tipo I y Chill 10 x DMEM on hielo.
- Mezclar 1/10 de volumen de 10 x medio DMEM en matriz de colágeno; añadir NaOH (0,2 N) para neutralizar la solución ácida de colágeno a un valor de pH de 7,4; colágeno tienda / solución del medio en el hielo.
- Mezclar líneas celulares MM transgénicos (OPM-2 eGFP o RPMI-8226 eGFP; 250,000 por esferoide,) con las células humanas mesenquimales (50.000 células / esferoide, es decir, 30 l de caída).
- Mezcla de células centrífuga en tubos de 15 ml (1.000 xg, 5min), agregar la mezcla de colágeno preparada fría (1 ml) al sedimento celular y mezclar bien (con 1.000 l punta).
- Inmediatamente pipetear 30 l de la mezcla de colágeno / célula (con 100 l punta) en una placa de 24 pocillos en la película de parafina estéril y permitir que la mezcla de célula / colágeno para polimerizar durante 30 min a 37 ° C (véase la Figura 1A).
- Esferoides MM de superposición con 1 ml de medio de cultivo que contiene 1, 10 y 100 nM bortezomib (ver Figura 1B).
- Después de 72 h de incubación a 37 ° C, documento esferoides porestereomicroscopía de fluorescencia (véase la Figura 1C).
- Transferir cada esferoide por el uso de fórceps con mordazas planas anchas en un tubo de reacción para la medición de GFP (véase la Figura 1D).
3. 3D mieloma múltiple modelo de xenoinjerto en la CAM
- Incubar huevos de gallina en una incubadora especial para huevos de aves a 37 ° C y 70% de humedad durante tres días.
- A partir de entonces, los huevos abiertos y embriones de transferencia para esterilizar con barcos de etanol, cuadrada, de 10 cm de plástico con un peso con placa de cultivo celular de tapa e incubar "ex ovo" para los otros seis días, por lo que la CAM es capaz de desarrollar (ver Figura 2 A).
- Solución I-colágeno tipo Chill y 10 x DMEM en hielo, se mezclan un décimo de volumen de 10 x medio DMEM en matriz de colágeno, Añadir NaOH (0,2 N) para neutralizar la solución ácida de colágeno a un valor de pH de 7,4; colágeno tienda / solución del medio en el hielo.
- Mezclar líneas celulares MM transgénico (OPM-2 eGFP oRPMI-8226 eGFP; 250.000 por esferoide,) con células mesenquimales humanas (50.000 células / esferoide).
- Centrifugar las células en tubos de 15 ml (1.000 xg, 5 minutos; para cada compuesto de ensayo 1 vial), añadir 1 ml de mezcla de colágeno preparada frío con el fármaco (a una concentración de trabajo deseada) al sedimento celular y mezclar bien (con 1.000 l punta).
- Coloque colágeno gotas (30 l cada uno) sobre Parafilm en un 6 así paté durante 30 min para permitir la polimerización de la matriz extracelular a 37 ° C.
- Transferencia "onplants" desde el paso 3.6 con el uso de fórceps a la superficie sin tratar de la CAM (2 cm del embrión) de embriones de pollo de 9 días de edad (4 onplants para cada embrión de pollo, vea la Figura 2B)
- Después de 5 días de crecimiento in vivo en una incubadora de huevos a 37 ° C y 70% de humedad, documento xenoinjertos por estereomicroscopía de fluorescencia (véase la Figura 2C). La eutanasia a los embriones de pollo por hipotermia a 4 ° C en la nevera durante 5 h.
- Retire xenoinjertos con tejido CAM subyacente por una tijera oftálmica y pinzas con mandíbulas planas anchas. Úsalos para la medición de las buenas prácticas agrarias (artículo 4, ver Figura 2D) o para el análisis inmunohistoquímico de los vasos sanguíneos y / o las células tumorales invasoras (sección 5).
4. Cuantificación de eGFP de proteínas por ELISA
- Transferir cada esferoide MM o xenoinjerto extirpado en 0,5 ml RIPA tampón que contenía inhibidores de la proteasa / ml 200 g.
- Homogeneizar esferoide / xenoinjerto con un homogeneizador de tejidos en el hielo.
- Haz tres de congelación / descongelación ciclos en nitrógeno líquido y 37 ° C baño de agua.
- Centrifugar homogeneizado a 4 ° C durante 20 min (12000 g) y almacenar sobrenadantes.
- Diluir las muestras 1:20 en tampón de ensayo (200 l) del kit de ELISA. Mida GFP-niveles por una GFP comercial ELISA Kit utilizando anticuerpos anti-GFP biotinilados, de acuerdo con el protocolo del fabricante.
5. ImmunohiAnálisis stochemical de los vasos sanguíneos y las células tumorales invasoras
- Fijar xenoinjertos extirpados con área CAM en el 4% paraformaldehido O / N a 4 ° C.
- Coloque xenoinjertos fijos en cassettes de inclusión y transferirlos a una estación de incrustación de tejido con una serie graduada de alcohol creciente (50%, 70%, 80%, 95% de etanol, xilol y parafina; cada paso 60 min).
- Sección xenoinjertos (5 M) por el uso de un micrótomo rotatorio banco de trabajo. Hornee secciones de parafina sobre portaobjetos de vidrio O / N a 56 ° C.
- Desparafinar secciones por una serie graduada de alcohol bajando a agua bidestilada (xilol, 95%, 80%, 70%, etanol al 50%, agua bidestilada; cada paso 10 min).
- Realizar la recuperación de antígenos en un baño de agua (95 ° C, 20 min) con una solución de recuperación de antígeno (tampón citrate-; pH 7,0; volumen de 100 l).
- Bloquear la actividad peroxidasa endógena con 100 l 3% H 2 O 2 / metanol durante 30 min.
- Secciones de bloque en PBS que contenía10% de suero de ternero fetal durante 45 min (volumen 100 l).
- La mancha durante 1 hora con 100 l de anticuerpo primario (1μg / ml) diluido en PBS que contenía 1% de suero de ternera fetal a TA.
- Después de lavar 3 veces en PBS, se incuban durante 1 hora con el anticuerpo secundario biotinilado (0,1 mg / ml) en PBS que contenía 1% de suero de ternera fetal a TA.
- Después de lavar 3 veces en PBS realizar la reacción de color por la solución de avidina / (DAB) de sustrato-biotina (ABC) y la diaminobencidina de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- 5.11. Detener la reacción mediante la transferencia de secciones al agua bidestilada, contratinción con hematoxilina y montaje de las secciones con un medio de montaje sintético.
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Representative Results
El análisis in vitro de los compuestos de interés en los ensayos de esferoide mieloma múltiple 3D
Debido a la limitación de cultivo de células MM humanas primarias in vitro establecimos nuevos modelos de cultivo in vitro en 3D para líneas celulares de MM humanos que hacen uso de una matriz de crecimiento extracelular y células mesenquimales humanas primarias de apoyo de la médula ósea (Figura 1A, B). Líneas celulares de MM transgénicos EGFP permiten la visualización y cuantificación de la masa tumoral MM después de un crecimiento 3D en esferoides. Ambas líneas celulares de MM OPM-2 eGFP y RPMI-8226 eGFP se cultivaron durante 3 días en presencia de concentraciones crecientes (1- 100 nm) del bortezomib y los tumores se visualizaron por la expresión de GFP en un microscopio de fluorescencia estéreo (Figura 1C) . Masa celular del tumor se cuantificó después de la homogeneización de esferoides y de medición contenidos eGFP por un GFP-ELISA (Figura 1D).
En el análisis in vivo de compuestos diana en múltiples xenoinjertos de mieloma en embriones de pollo
Tres días de edad embriones de pollo fueron cultivadas ex ovo durante 6 días y el día 9 utilizado para el injerto de las células MM (Figura 2). Células EGFP transgénicos de mieloma (OPM-2 EGFP) junto con las células mesenquimales de médula ósea humanos fueron incorporados en colágeno de tipo I como componente de la matriz extracelular. El bortezomib sustancia diana se aplicó tópicamente a 1 nmol (Figura 2B). Para cada animal "4" onplants sido injertado en la membrana corioalantoidea (CAM) de embriones de pollo. Después de 5 días, xenoinjertos MM formaron tumores que podrían ser visualizadas por la expresión de eGFP. En comparación con los controles, bortezomib inhibe el crecimiento de las células MM en xenoinjertos. Los injertos muestran menos MM verde masa de células tumorales (Figura 2C). Xenoinjertos MM individuales desde ºree animales diferentes (n = 12) fueron extirpados, se homogeneizó y después de eso, medidos por ELISA GFP. En comparación directa con los controles xenoinjertos tratados con bortezomib tenían una masa de células de mieloma reducido significativamente (Figura 2D).
En el análisis in vivo de respuestas angiogénicas y la invasión de xenoinjertos de mieloma en embriones de pollo
Respuestas angiogénicas alrededor de onplants pueden ser observados por microscopía estereoscópica. Vascularización de xenoinjertos se redujo significativamente en los xenoinjertos tratados con fármaco (1 nmol plitidepsin, Figura 3). Respuestas angiogénicas se cuantificaron contando los vasos sanguíneos que brotan en onplant como se describe para el ensayo de esponja de gelatina por Ribatti et al. 21.
Para el análisis de la invasión, xenoinjertos fueron extirpados con el área de CAM adyacente. Xenoinjertos fueron fijadas, incluidos en parafina y las secciones preparadas (Figura 4 (Figura 4).
Figura 1. Múltiples 3D esferoides de mieloma. (A) Generación de OPM-2 eGFP y RPMI-8226 esferoides eGFP con células primarias humanas mesenquimales de médula ósea y el colágeno de tipo I como componente de la matriz extracelular. (B) Los esferoides se incubaron con medio de cultivo y respectiva concentración de bortezomib (1- 100 esferoides nM). (C) MM se cultivaron durante 3 días y se fotografiaron con un microscopio de fluorescencia estéreo. Las barras indican 500 micras. (D) sph Individualeroids se homogeneizaron en tampón de lisis y después de eso, miden en un GFP ELISA. Se calcularon las concentraciones de las buenas prácticas agrarias de esferoides individuales (n = 5, Media ± SEM). Las estrellas indican los valores de p <0,05; Co = control; Bzb = bortezomib. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Mieloma múltiple modelo de xenoinjerto. (A) En el día 9 de desarrollo de embriones de pollo ex ovo se utilizaron para experimentos de injerto. (B) OPM-2 eGFP y RPMI-8226 eGFP se mezclaron con células mesenquimales de médula ósea humanas primarias, el colágeno de tipo I como componente de la matriz extracelular y con 1 nM de bortezomib. Después de esferoides de solidificación (n = 4) fueron injertados en la membrana corioalantoidea de embrión de pollos. (C) Después de 5 días injertos MM en la CAM puede ser visualizado por la expresión de eGFP. Xenoinjertos pueden ser fotografiados a diario por un microscopio de fluorescencia estéreo. Las barras indican 500 micras. (D) xenoinjertos individuales MM se escindieron con el tejido CAM subyacente, se homogeneizaron en tampón de lisis y se mide en un ELISA GFP. Se calcularon las concentraciones de las buenas prácticas agrarias de tumores únicos (n = 12, media ± SEM). Las estrellas indican los valores de p <0,05; Bzb = bortezomib. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Análisis de la angiogénesis mieloma. Xenoinjertos MM (OPM-2 eGFP) se documentaron cinco días después del trasplante en la CAM de embriones de pollo. En comparación con el control injertos, tratament con plitidepsin (1 nmol, n = 10) resultaron en superficialmente tumores de crecimiento que eran menos vascularizado por el tejido CAM. Los vasos sanguíneos que crecen a las onplants (rojo) se contaron como se muestra en el modelo gráfico de tipos de vasos sanguíneos. Las barras indican 1 mm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Análisis de la invasión de células de mieloma. El análisis inmunohistoquímico de xenoinjertos MM (OPM-2 EGFP) con tejido del huésped CAM subyacente (tratados con bortezomib frente a los controles). La proliferación de las células MM humanos tiñen positivo para Ki-67, CD138 y vimentina e invaden como racimos célula huésped tejido. Los vasos sanguíneos de pollo se tiñen con marcadores de células mural ASMA (buques de mayor tamaño y las arterias) y desmina (capilares). Magnificatien 200x, asteriscos indican los vasos sanguíneos de la CAM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El desarrollo de nuevos agentes terapéuticos para refractario MM requiere menos tiempo y caros sistemas in vivo para evaluar la sensibilidad de las células MM humanos a las drogas. Hasta ahora, solamente pocos sistemas in vivo están disponibles para la evaluación preclínica de nuevas terapias anti-mieloma. Todos ellos tienen sus limitaciones para el cribado a gran escala de bibliotecas de compuestos 29.
Los mejores modelos actuales de las células MM humanos son altamente ratones inmunodeficientes 7,13,30 y embriones de pavo 29. Tanto el embrión aviar modelos de xenoinjerto de ratón SCID y se pueden utilizar para estudiar la biología de MM y para probar nuevos compuestos terapéuticos. Sin embargo, los sistemas murinos tienen varias limitaciones, incluyendo genotipo endogámica, procedimientos técnicamente exigentes, periodos de observación largos y altos costos.
En este estudio, un esferoide novela 3D y modelo de xenoinjerto aviar se presenta para el estudio de la biología celular MM humano que implica la presencia de MES humanosenchymal las células madre y de la matriz extracelular como componentes de apoyo. Células MM dependen en gran medida de su respectiva microambiente, es decir, la presencia de factores de crecimiento derivados de estroma, citoquinas y componentes de ECM para sobrevivir y proliferar 31-33. Además, los medicamentos pueden ser ineficiente o mostrar actividad alterada cuando las células de mieloma están protegidos por su microambiente local de 31,34.
En comparación con los modelos murinos, el 3D se describe en vitro y en sistemas modelo in vivo no son caros, rápida y fácil de manejar. Además, el trasplante de 3D MM esferoides a embriones de pollo permite el análisis de la angiogénesis inducida por el mieloma. Una limitación de nuestro sistema es el corto tiempo de crecimiento de las células MM y, por tanto, el análisis de metástasis a los huesos de aves no es posible. Otra limitación de nuestros modelos es que trabajamos con la aplicación tópica de medicamentos en la CAM que podría no reflejar las aplicaciones sistémicas y la rotación de la droga / modificación de las enzimas hepáticas. EnAdemás, una tasa de supervivencia de aproximadamente 50% hasta que el injerto se observó debido a ex ovo condiciones de crecimiento de embriones de pollo. En cuanto a los marcadores endoteliales para el análisis IHC, la mayoría de los marcadores usados en la sección de humanos y de ratón para teñir las células endoteliales no son específicos de vasos sanguíneos en el pollo. Por lo tanto, se recomienda la tinción de los marcadores de células mural desmina / ASMA o la inyección de lectinas en embriones de pollo 35. No todas las líneas celulares de mieloma humano disponibles crecerán invasiva en tejido huésped pollo y mostrar un crecimiento superficial. Esto resultará en tejido destruido después de cortar secciones en el micrótomo. Por otra parte, la atención especial (antibióticos de selección) se debe tomar que las células transfectadas no pierden la expresión del transgén GFP en el tiempo, debido a los reordenamientos genéticos permanentes o procesos de metilación del ADN.
En conclusión, nuestro modelo de xenoinjerto de embriones de pollo de las células MM humanos con el apoyo del estroma proporciona un modelo in vivo reproducible y predecible a Study crecimiento de las células MM humano y la angiogénesis. Este modelo describe MM puede facilitar más rápido in vivo los procesos de selección de los fármacos anti-MM, ayudando a reducir el tiempo y los costes para el desarrollo de nuevos fármacos. Con medidas adicionales mejorando, tales como material óseo de sustitución, matriz ECM complejo y citoquinas el sistema podría mejorarse para probar la terapéutica también contra las muestras de pacientes. Este es un requisito previo para la medicina personalizada del cáncer y pruebas de sensibilidad a los fármacos en pacientes con MM refractarios individuales.
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Disclosures
Los autores no tienen intereses financieros en competencia
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-8226 cells | DSMZ | ACC 9 | STR profiled |
| OPM-2 cells | DSMZ | ACC 50 | STR profiled |
| Human mesenchymal stem cells | PromoCell | PC-C-12974 | |
| HEK293FT cells | Invitrogen | R700-07 | |
| RPMI1640 Medium | Sigma Aldrich | R0883 | |
| Fetal Bovine Serum HyClone | ThermoScientific | SH30070.03 | |
| L-Glut- Pen- Strep solution | Sigma | G6784 | |
| DMEM Medium | Gibco | 31966 | |
| NEAA | Sigma Life Sciences | M7145 | |
| Transfection Medium/Opti-MEM | Gibco | 51985 | |
| eGFP lentiviral particles | GeneCopoeia | LPP-EGFP-LV105 | Ready to use viral particles |
| pLenti6/V5Dest6 eGFP vector | Invitrogen | PN 35-1271 | from authors |
| ViralpowerTM packaging mix | Invitrogen | P/N 35-1275 | |
| Transfection reagent/ Lipofectamin 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| Blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| Neomycin | Biochrom | A2912 | |
| Collagen-Type1 Rat Tail | BD Biosciences | 354236 | |
| DMEM powder | Life Technologies | Art.Nr. 10338582 | |
| plitidepsin | Pharmamar | ||
| bortezomib | LKT Lab., Inc. | B5871 | |
| SPF-white hen eggs | Charles River | Fertilized white Leghorn chicken eggs | |
| Plastic weighing boats | neoLab | Art.Nr. 1-1125 | for ex-ovo culture |
| Petridish square (Lids) | Simport | D210-16 | for ex-ovo culture |
| RIPA Buffer (10x) | Cell Signaling | #9806 | |
| Protease Inhibitor Tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
| Complete Mini EDTA-free | |||
| GFP ELISA | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
| Histocette II | Simport | M493-6 | |
| PFA 37% | Roth | 7398.1 | |
| DPBS | Lonza | BE17-512F | |
| Ethanol absolut | Normapur | 20,821,321 | |
| Roti-Histol | Roth | Art.Nr.6640.4 | |
| Paraplast | Sigma | A6330 | |
| SuperFrost Microscope Slides | R. Langenbrinck | Art.-Nr. | |
| Labor- u. Medizintechnik | 03-0060 | ||
| DakoCytomation Wash Buffer 10x | DakoCytomation | Code-Nr. | |
| S 3006 | |||
| Target Retrieval Solution (10x) pH 6,1 | DAKO | Code-Nr. | |
| S 1699 | |||
| H2O2 | Merck | ||
| m-a-hu ASMA clone 1A4 | DAKO | M0851 | |
| m-a-hu CD138 clone MI15 | DAKO | M7228 | |
| m-a-hu Vimentin clone V9 | DAKO | M0725 | |
| m-a-hu Desmin clone D33 | DAKO | M0760 | |
| m-a-hu Ki67 clone MIB-1 | DAKO | M7240 | |
| biotinylated goat- anti-mouse IgG | Vector Laboratories Inc. | BA-9200 | |
| Vectastain Elite ABC Kit | Vector Laboratories Inc. | # PK-6100 | |
| FAST DAB Tablet Set. | Sigma Biochemicals | # D4293 | |
| Mayer’s haemalaun solution | Merck | 1,092,490,500 | |
| Roti Histokitt | Roth | Art.Nr.6638.2 | |
| Bench top rotary microtome | Thermo Electron, Shandon Finesse ME+ | ||
| Tissue embedding station | Leica, TP1020 | ||
| Egg-Incubator | Grumbach | BSS160 | |
| Stereo fluorescence microscope equipped with an connected with a digital camera (Olympus E410) and flexible cold light | Olympus, SZX10 | ||
| Ultra Turrax | IKA T10 | Homogenizer |
References
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