Summary
Mänskliga multipelt myelom (MM) celler kräver stödjande mikromiljö av mesenkymala celler och extracellulära matriskomponenter för överlevnad och proliferation. Vi etablerade en in vivo kycklingembryo modell med engrafted humana myelom och mesenkymala celler för att studera effekterna av cancerläkemedel på tumörtillväxt, invasion och angiogenes.
Abstract
Multipelt myelom (MM), en malign plasmacellsjukdom, förblir obotlig och nya läkemedel krävs för att förbättra prognosen för patienter. På grund av bristen på benet mikro och auto / parakrint tillväxtfaktorer mänskliga MM celler är svåra att odla. Därför finns det ett akut behov av att fastställa korrekt in vitro och in vivo odlingssystem för att studera effekten av nya läkemedel på humana MM celler. Här presenterar vi en modell för att odla humana multipla myelomceller i en komplex 3D-miljö in vitro och in vivo. MM cellinjer OPM-2 och RPMI-8226 transfekterades för att uttrycka transgenen GFP och odlades i närvaro av humana mesenchymala celler och kollagen typ-I-matris som tredimensionella sfäroider. Därutöver har sfäroider ympas på korioallantoinmembranet (CAM) hos kycklingembryon och tumörtillväxt övervakades genom stereo fluorescensmikroskopi. Båda modellerna tillåter studier av nya terapeutiska drugs i en komplex 3D-miljö och kvantifiering av tumörcellmassan efter homogenisering av transplantat i en transgen-specifik GFP-ELISA. Dessutom kan angiogena svar i värd och invasion av tumörceller i den underliggande värdvävnaden övervakas dagligen av en stereolupp och analyserades genom immunohistokemisk färgning mot humana tumörceller (Ki-67, CD138, Vimentin) eller värdväggceller som täcker blodkärl (desmin / ASMA).
Sammanfattningsvis tillåter onplantelement systemet studerar MM celltillväxt och angiogenes i en komplex 3D-miljö och möjliggör screening för nya terapeutiska substanser som verkar överlevnad och spridning av MM-celler.
Protocol
Enligt den österrikiska lagstiftningen, och Office of Laboratory Animal Welfare av den amerikanska Public Health Service fågelembryons betraktas inte som levande ryggradsdjur tills hatching.The NIH Office of Laboratory Animal Welfare har gett skriftlig vägledning på detta område (http: // www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm och NIH publikation nr .: 06-4515).
1. Cell Culture och Lentiviral transfektion
- Kultur MM cellinjer OPM-2, RPMI-8226 och humana mesenkymala stamceller från benmärg i RPMI1640-medium, kompletterat med 10% bovint fetalt kalvserum och 100 lU / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin och 2 mM glutamin i närvaro av 5% CO2 vid 37 ° C.
- Transfektera 5 x 10 6 HEK 293FT celler med viralt förpackningsblandning (9 ^ g) DNA och 3 pg pLenti6 / V5 dest eGFP vektor genom användning av 30 | j, l liposomalt transfektionsreagens och transfektion medium (10 ml). Ta transfektion medium efter 12 timmar ochtillsätt 10 ml DMEM-medium med 10% bovint kalvserum och 1% icke-essentiella aminosyror (NEAA).
- Efter fem dagar, samla supernatanter av HEK293FT celler efter centrifugering av simning celler (1.000 XG, 5min). Bestäm virustiter genom realtids-PCR som beskrivs på annat håll 28.
- Transfektera en x 10 6 MM celler med EGFP lentivirala partiklar (1 x 10 5 partiklar) i en 24-brunnsplatta i fullständigt tillväxtmedium. Efter tre dagar, börja urvalsprocess genom att lägga 2 | ig / ml blasticidin till odlingsmediet. För kommersiellt tillgängliga EGFP lentivirus, använder 500 mikrogram / ml neomycin.
- Efter 2 veckor av val, kommer kluster av EGFP uttrycker MM celler visas; samla cellerna genom centrifugering (1000 xg, 5 min) och utvidga dem som OPM-2 EGFP och RPMI-8226 EGFP sublinjer för experiment (punkt 2 och 3).
2. 3D-myelom Spheroid Modell
- Chill kollagen typ-I-lösning och 10 x DMEM on is.
- Blanda 1/10 volym 10 x DMEM-medium i kollagenmatrisen; lägg NaOH (0,2 N) för att neutralisera sura kollagenlösningen till ett pH-värde av 7,4; lagra kollagen / medel lösningen på is.
- Blanda transgena MM cellinjer (OPM-2 EGFP eller RPMI-8226 EGFP, 250.000 per sfäroid,) med humana mesenkymala celler (50.000 celler / sfäroid, det vill säga, 30 pl droppe).
- Centrifugera cellblandningen i 15 ml rör (1000 xg, 5 min), tillsätt kallt framställd kollagenblandning (1 ml) till cellpelleten och blanda väl (med 1000 ul tips).
- Omedelbart pipett 30 ul av kollagen / cellblandningen (med 100 | j, l spets) i en 24-brunnsplatta på steril paraffinfilm och tillåta cellen / kollagenblandningen polymerisera under 30 minuter vid 37 ° C (se figur 1A).
- Overlay MM sfäroider med 1 ml odlingsmedium innehållande 1, 10 och 100 nM bortezomib (se figur 1B).
- Efter 72 timmar av inkubation vid 37 ° C, dokument sfäroider avfluorescens stereomikroskopi (se figur 1C).
- Överför varje sfäroid genom användning av pincett med breda platta käftar i ett reaktionsrör för mätning av GFP (se figur 1D).
3. 3D Multipelt myelom xenograftmodell i CAM
- Inkubera kyckling ägg i en särskild inkubator för fågelägg vid 37 ° C och 70% fuktighet under tre dagar.
- Därefter att öppna ägg och embryon överförings steriliserades med etanol, fyrkant, 10 cm plast väger båtar med cellodlingsplatta lock och inkubera "ex ovo" för ytterligare sex dagar, så att CAM kan utveckla (se figur 2A).
- Chill kollagen typ-I-lösning och 10 X DMEM på is, blanda 1/10 volym av 10 x DMEM-medium i kollagenmatrisen, Lägg NaOH (0,2 N) för att neutralisera sura kollagenlösningen till ett pH-värde av 7,4; lagra kollagen / medel lösningen på is.
- Blanda transgen MM cellinjer (OPM-2 EGFP ellerRPMI-8226 EGFP; 250.000 per sfäroid,) med humana mesenkymala celler (50.000 celler / sfäroid).
- Centrifugera cellerna i 15 ml rör (1000 xg, 5 min; för varje testförening 1 ampull), tillsätt 1 ml kall beredd kollagenblandningen med läkemedel (vid önskad arbetskoncentration) till cellpelleten och blanda väl (med 1000 ul tips).
- Placera kollagen droppar (30 | il vardera) på parafilm i en 6 väl pate för 30 min för att medge polymerisation av den extracellulära matrisen vid 37 ° C.
- Överföring "onplants" från steg 3,6 med användning av en pincett för att den obehandlade ytan av CAM (2 cm från embryot) av 9 dagar gamla kycklingembryon (4 onplants för varje kycklingembryo, se figur 2B)
- Efter 5 dagar av in vivo-tillväxt i en ägg-inkubator vid 37 ° C och 70% luftfuktighet, dokument xenografter genom fluorescens stereomikroskopi (se figur 2C). Euthanize kycklingembryon av hypotermi vid 4 ° C i kylen under 5 timmar.
- Ta xenografter med underliggande CAM-vävnad från en ögon sax och pincett med breda platta käftar. Använd dem för mätning av GFP (avsnitt 4, se figur 2D) eller för immunohistokemisk analys av blodkärl och / eller invaderande tumörceller (avsnitt 5).
4. Kvantifiering av EGFP protein genom ELISA
- Överför varje MM sfäroid eller utskurna xenograft i 0,5 ml RIPA buffert innehållande 200 pg / ml proteashämmare.
- Homogenisera sfäroid / xenograft med en vävnadshomogenisator på is.
- Utför tre frysning / tining-cykler i flytande kväve och 37 ° C vattenbad.
- Centrifugera homogenatet vid 4 ° C i 20 min (12000 g) och lagra supernatanter.
- Späd prover 1:20 i analysbuffert (200 | j, l) av ELISA-kit. Mät GFP-nivåer genom en kommersiell GFP ELISA Kit med hjälp av biotinylerade anti-GFP antikroppar, enligt tillverkarens protokoll.
5. Immunohistochemical Analys av blodkärl och invaderande tumörceller
- Fix exciderade xenografter med CAM-område i 4% paraformaldehyd O / N vid 4 ° C.
- Placera fasta xenografter i inbäddande kassetter och överföra dem till en vävnad inbäddning station med en ökande graderad alkoholserie (50%, 70%, 80%, 95% etanol, xylol och paraffin; varje steg 60 minuter).
- Avsnitt xenotransplantat (5 pm) genom användning av en bords roterande mikrotom. Grädda paraffinsnitt på glasskivor O / N vid 56 ° C.
- Avparaffinera sektioner av en minskande graderad alkoholserie till dubbeldestillerat vatten (xylol, 95%, 80%, 70%, 50% etanol, dubbel destillerat vatten, varje steg 10 min).
- Utför antigenåtervinning i ett vattenbad (95 ° C, 20 min) med en antigenåtervinning lösning (citrate- buffert; pH 7,0; volym 100 pl).
- Blockera endogen peroxidasaktivitet med 100 | il 3% H2O 2 / metanol under 30 minuter.
- Blockdelar i PBS innehållande10% fetalt kalvserum under 45 min (volym 100 pl).
- Fläcken för ett h med 100 | il av primär antikropp (1 | ig / ml) späddes i PBS innehållande 1% fetalt kalvserum vid RT.
- Efter tvättning tre gånger i PBS, inkubera under 1 h med biotinylerad sekundär antikropp (0,1 | ig / ml) i PBS innehållande 1% fetalt kalvserum vid RT.
- Efter tvättning tre gånger i PBS utföra färgreaktion genom avidin / biotin-komplex (ABC) och diaminobensidin substrat (DAB) lösning enligt tillverkarens instruktioner.
- 5.11. Stoppa reaktionen genom att överföra delar av dubbeldestillerat vatten, kontrast med hematoxylin och montera delar med ett syntetiskt monteringsmedium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vitro-analys av målföreningar i 3D multipelt myelom sfäroida analyser
På grund av den begränsning av odling primära humana MM celler in vitro vi etablerat nya 3D in vitro odlingsmodeller för mänskliga MM cellinjer som utnyttjar en extracellulärt tillväxtmatris och stödjande primära humana mesenkymala celler från benmärg (Figur 1A, B). EGFP transgena MM cellinjer tillåter visualisering och kvantifiering av MM tumörmassa efter 3D tillväxt i sfäroider. Båda MM cellinjerna OPM-2 EGFP och RPMI-8226 EGFP odlades under tre dagar i närvaro av ökande koncentrationer (1- 100 nM) för bortezomib och tumörer visualiserades genom expressionen av GFP på en stereofluorescensmikroskop (Figur 1C) . Tumörcellmassa kvantifierades efter homogenisering av sfäroider och mäta EGFP innehållet genom en GFP-ELISA (Figur 1D).
In vivo analys av målföreningar i multipelt myelom xenotransplantat i kycklingembryon
Tre dagar gamla kycklingembryon odlades ex ovo för 6 dagar och på dag 9 används för ympning av MM-celler (Figur 2A). EGFP transgena myelomceller (OPM-2 EGFP) tillsammans med humana benmärgs mesenkymala celler inbäddade i kollagen typ I som extracellulära matriskomponent. Målsubstansen bortezomib applicerades topiskt på en nMol (figur 2b). För varje djur 4 "onplants" transplanterades på korioallantoinmembranet (CAM) av kycklingembryon. Efter fem dagar, MM xenografter bildade tumörer som kan visualiseras genom uttryck av EGFP. Jämfört med kontroller, bortezomib hämmade tillväxten av MM celler i xenotransplantat. Transplantat visade mindre grön MM tumörcellmassa (Figur 2C). Singel MM xenotransplantat från thREE olika djur (n = 12) skars ut, homogeniserades och därefter, mätt med GFP-ELISA. I direkt jämförelse med kontrollerna hade bortezomib behandlade xenotransplantat en signifikant minskad myelom cellmassa (figur 2D).
In vivo analys av angiogena svar och invasion av myelom xenotransplantat i kycklingembryon
Angiogena svar kring onplants kan observeras av stereomikroskopi. Vaskularisering av xenotransplantat reducerades signifikant i läkemedelsbehandlade xenotransplantat (1 nMol Plitidepsin, Figur 3). Angiogena svar kvantifierades genom räkning blodkärl groning in onplantelement såsom beskrivits för gelatinsvamp analysen genom Ribatti et al., 21.
För analys av invasion, var xenotransplantat ut med den intilliggande CAM området. Xenografter fixerades, inbäddad i paraffin och sektioner preparerade (Figur 4 (Figur 4).
Figur 1. 3D Multipelt myelom Sfäroider. (A) Framställning av OPM-2 EGFP och RPMI-8226 EGFP sfäroider med primära humana benmärgs mesenkymala celler och kollagen typ I som extracellulära matriskomponent. (B) Sfäroider inkuberades med odlingsmedium och respektive koncentration av bortezomib (1- 100 nm). (C) MM sfäroiderna odlades under 3 dagar och fotograferades genom ett stereofluorescensmikroskop. Barer indikerar 500 pm. (D) Single spheroids homogeniserades i lysbuffert och därefter, mätt i en GFP-ELISA. GFP koncentrationer av enstaka spheroids beräknades (n = 5, medelvärde ± SEM). Stjärnor indikerar p-värden <0,05; Co = kontroll; BZB = bortezomib. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Multipelt myelom xenograftmodell. (A) På utvecklings dag 9 ex-ovo kycklingembryon användes för ympning experiment. (B) OPM-2 EGFP och RPMI-8226 EGFP blandades med primära humana benmärgs mesenkymala celler, kollagen typ I som extracellulära matriskomponent och med 1 nM av bortezomib. Efter stel sfäroider (n = 4) transplanterades på korioallantoismembranet i kycklingembryos. (C) Efter 5 dagar MM transplantat i CAM kan visualiseras genom uttrycket av EGFP. Xenografter kan fotograferas dagligen av en stereofluorescensmikroskop. Barer indikerar 500 um. (D) Enkelt MM xenotransplantat skars med underliggande CAM-vävnad, homogeniseras i lysbuffert och mäts i en GFP ELISA. GFP koncentrationer av enskilda tumörer beräknades (n = 12, medelvärde ± SEM). Stjärnor indikerar p-värden <0,05; BZB = bortezomib. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Analys av myelom angiogenes. MM xenotransplantat (OPM-2 EGFP) dokumenterades fem dagar efter transplantationen på CAM av kycklingembryon. I jämförelse med kontrolltransplantat, behandlient med plitidepsin (1 nmol, n = 10) resulterade i ytligt växande tumörer som var mindre vaskulariserad genom CAM-vävnad. Blodkärl växer till onplants (röd) räknades som avbildas i den grafiska modellen av blodkärlstyper. Barer visar 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Analys av myelomcellinvasion. Immunhistokemisk analys av MM xenotransplantat (OPM-2 EGFP) med underliggande CAM värdvävnad (bortezomib behandlade kontra kontroller). Prolifererande humana MM cellerna färgas positivt för Ki-67, CD138 och Vimentin och invadera som cellkluster värd vävnad. Kärlen kyckling blod färgas med väggmålning cellmarkörer Asma (större fartyg och artärer) och desmin (kapillärer). Magnificatipå 200x, asterisker visar blodkärlen i CAM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utvecklingen av nya terapeutiska medel för eldfasta MM kräver mindre tidskrävande och kostsamma in vivo system för att utvärdera känsligheten hos humana MM celler till droger. Hittills endast ett fåtal in vivo system finns tillgängliga för preklinisk utvärdering av nya anti-myelom terapier. Alla av dem har sina begränsningar för storskalig screening av substansbibliotek 29.
De bästa nuvarande modeller för mänskliga MM celler är starkt immundefekta möss 7,13,30 och kalkon embryon 29. Både SCID-mus och fågelembryo xenograft-modeller kan användas för att studera biologi MM- och för att testa nya terapeutiska föreningar. Men murina system har flera begränsningar, inklusive inavlade genotyp, tekniskt krävande procedurer, långa observationsperioder och höga kostnader.
I denna studie är ett nytt 3D sfäroid och fågel xenotransplantatmodell presenteras för att studera människors MM cellbiologi som innebär närvaro av humana mesenchymal stamceller och extracellulära matrix som stödjande komponenter. MM-celler är starkt beroende av deras respektive mikro, dvs närvaro av stroma-härledda tillväxtfaktorer, cytokiner och ECM-komponenter för att överleva och föröka sig 31-33. Dessutom kan läkemedel vara ineffektivt eller visa förändrad aktivitet när myelomcellerna skyddas av sin lokala mikro 31,34.
I jämförelse med musmodeller, det beskrivna 3D in vitro och in vivo modellsystem är inte dyra, snabb och lätt att hantera. Dessutom transplantationen av 3D MM sfäroiderna till kycklingembryon kan analys av myelom-inducerad angiogenes. En begränsning med vårt system är den korta tiden för MM celltillväxt och således, är det inte möjligt analys av metastas till avian ben. En ytterligare begränsning av våra modeller är att vi arbetar med lokal applicering av läkemedel i CAM som kanske inte speglar systemtillämpningar och narkotika omsättning / modifiering av leverenzymer. IDessutom har en överlevnad ca 50% fram till ympning observer på grund av ex ovo tillväxtförhållanden kycklingembryon. När det gäller endotelceller markörer för IHC analys, de flesta markörer som används inom human- och mus avsnitt att färga endotelceller är inte specifika för blodkärlen i kyckling. Därför rekommenderar vi färgning för väggmålning cellmarkörer desmin / Asma eller injektion av lektiner i kycklingembryon 35. Inte alla tillgängliga myelomcellinjer mänskliga kommer att växa invasivt i kyckling värdvävnad och visa ytlig tillväxt. Detta kommer att resultera i förstörd vävnad efter styckning sektioner på mikrotomen. Dessutom bör särskild omsorg (antibiotika urval) tas att transfekterade celler inte förlora GFP transgenexpression inom tid, på grund av permanenta genetiska omarrangemang eller DNA-metylering processer.
Sammanfattningsvis ger vår kycklingembryo xenotransplantatmodell av humana MM celler med stromal stöd ett reproducerbart och förutsägbar in-vivo-modell för att Study human MM celltillväxt och angiogenes. Detta beskrivs MM modell kan underlätta snabbare in-vivo screening processer av anti-MM läkemedel, bidrar till att minska utvecklingstiden och kostnader för nya läkemedel. Med ytterligare förbättra steg, såsom ben-ersättningsmaterial, komplexa ECM matris och cytokiner systemet kan förbättras för att testa läkemedel även mot patientprover. Detta är en förutsättning för personlig cancermedicin och testning av läkemedelskänslighet i enskilda eldfasta MM patienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-8226 cells | DSMZ | ACC 9 | STR profiled |
| OPM-2 cells | DSMZ | ACC 50 | STR profiled |
| Human mesenchymal stem cells | PromoCell | PC-C-12974 | |
| HEK293FT cells | Invitrogen | R700-07 | |
| RPMI1640 Medium | Sigma Aldrich | R0883 | |
| Fetal Bovine Serum HyClone | ThermoScientific | SH30070.03 | |
| L-Glut- Pen- Strep solution | Sigma | G6784 | |
| DMEM Medium | Gibco | 31966 | |
| NEAA | Sigma Life Sciences | M7145 | |
| Transfection Medium/Opti-MEM | Gibco | 51985 | |
| eGFP lentiviral particles | GeneCopoeia | LPP-EGFP-LV105 | Ready to use viral particles |
| pLenti6/V5Dest6 eGFP vector | Invitrogen | PN 35-1271 | from authors |
| ViralpowerTM packaging mix | Invitrogen | P/N 35-1275 | |
| Transfection reagent/ Lipofectamin 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| Blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| Neomycin | Biochrom | A2912 | |
| Collagen-Type1 Rat Tail | BD Biosciences | 354236 | |
| DMEM powder | Life Technologies | Art.Nr. 10338582 | |
| plitidepsin | Pharmamar | ||
| bortezomib | LKT Lab., Inc. | B5871 | |
| SPF-white hen eggs | Charles River | Fertilized white Leghorn chicken eggs | |
| Plastic weighing boats | neoLab | Art.Nr. 1-1125 | for ex-ovo culture |
| Petridish square (Lids) | Simport | D210-16 | for ex-ovo culture |
| RIPA Buffer (10x) | Cell Signaling | #9806 | |
| Protease Inhibitor Tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
| Complete Mini EDTA-free | |||
| GFP ELISA | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
| Histocette II | Simport | M493-6 | |
| PFA 37% | Roth | 7398.1 | |
| DPBS | Lonza | BE17-512F | |
| Ethanol absolut | Normapur | 20,821,321 | |
| Roti-Histol | Roth | Art.Nr.6640.4 | |
| Paraplast | Sigma | A6330 | |
| SuperFrost Microscope Slides | R. Langenbrinck | Art.-Nr. | |
| Labor- u. Medizintechnik | 03-0060 | ||
| DakoCytomation Wash Buffer 10x | DakoCytomation | Code-Nr. | |
| S 3006 | |||
| Target Retrieval Solution (10x) pH 6,1 | DAKO | Code-Nr. | |
| S 1699 | |||
| H2O2 | Merck | ||
| m-a-hu ASMA clone 1A4 | DAKO | M0851 | |
| m-a-hu CD138 clone MI15 | DAKO | M7228 | |
| m-a-hu Vimentin clone V9 | DAKO | M0725 | |
| m-a-hu Desmin clone D33 | DAKO | M0760 | |
| m-a-hu Ki67 clone MIB-1 | DAKO | M7240 | |
| biotinylated goat- anti-mouse IgG | Vector Laboratories Inc. | BA-9200 | |
| Vectastain Elite ABC Kit | Vector Laboratories Inc. | # PK-6100 | |
| FAST DAB Tablet Set. | Sigma Biochemicals | # D4293 | |
| Mayer’s haemalaun solution | Merck | 1,092,490,500 | |
| Roti Histokitt | Roth | Art.Nr.6638.2 | |
| Bench top rotary microtome | Thermo Electron, Shandon Finesse ME+ | ||
| Tissue embedding station | Leica, TP1020 | ||
| Egg-Incubator | Grumbach | BSS160 | |
| Stereo fluorescence microscope equipped with an connected with a digital camera (Olympus E410) and flexible cold light | Olympus, SZX10 | ||
| Ultra Turrax | IKA T10 | Homogenizer |
References
- Kuehl, W. M., Bergsagel, P. L. Multiple myeloma: evolving genetic events and host interactions. Nat.Rev.Cancer. 2 (3), 175-187 (2002).
- Kumar, S. K., Gertz, M. A. Risk adapted therapy for multiple myeloma: back to basics. Leuk.Lymphoma. , (2014).
- Prideaux, S. M., Conway, O. E., Chevassut, T. J. The genetic architecture of multiple myeloma. Adv.Hematol. 2014, 864058 (2014).
- Chauhan, D., et al. A novel orally active proteasome inhibitor ONX 0912 triggers in vitro and in vivo cytotoxicity in multiple myeloma. Blood. 116 (23), 4906-4915 (2010).
- Kuehl, W. M. Mouse models can predict cancer therapy. Blood. 120 (2), 238-240 (2012).
- Nefedova, Y., Gabrilovich, D. Mechanisms and clinical prospects of Notch inhibitors in the therapy of hematological malignancies. Drug Resist.Updat. 11 (6), 210-218 (2008).
- Yaccoby, S., Barlogie, B., Epstein, J. Primary myeloma cells growing in SCID-hu mice: a model for studying the biology and treatment of myeloma and its manifestations. Blood. 92 (8), 2908-2913 (1998).
- Dazzi, F., et al. Normal and chronic phase CML hematopoietic cells repopulate NOD/SCID bone marrow with different kinetics and cell lineage representation. Hematol.J. 1 (5), 307-315 (2000).
- Lock, R. B., et al. The nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mouse model of childhood acute lymphoblastic leukemia reveals intrinsic differences in biologic characteristics at diagnosis and relapse. Blood. 99 (11), 4100-4108 (2002).
- Feuring-Buske, M., et al. Improved engraftment of human acute myeloid leukemia progenitor cells in beta 2-microglobulin-deficient NOD/SCID mice and in NOD/SCID mice transgenic for human growth factors. Leukemia. 17 (4), 760-763 (2003).
- Pearce, D. J., et al. AML engraftment in the NOD/SCID assay reflects the outcome of AML: implications for our understanding of the heterogeneity of AML. Blood. 107 (3), 1166-1173 (2006).
- Li, M., et al. Combined inhibition of Notch signaling and Bcl-2/Bcl-xL results in synergistic antimyeloma effect. Mol.Cancer Ther. 9 (12), 3200-3209 (2010).
- Tassone, P., et al. A clinically relevant SCID-hu in vivo model of human multiple myeloma. Blood. 106 (2), 713-716 (2005).
- Ranga, A., Gjorevski, N., Lutolf, M. P. Drug discovery through stem cell-based organoid models. Adv.Drug Deliv.Rev. 69-70, 19-28 (2014).
- Pereira, R. F., Barrias, C. C., Granja, P. L., Bartolo, P. J. Advanced biofabrication strategies for skin regeneration and repair. Nanomedicine.(Lond). 8 (4), 603-621 (2013).
- Fischbach, C., et al. Engineering tumors with 3D scaffolds). Nat.Methods. 4 (10), 855-860 (2007).
- Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken embryo. J.Vis.Exp. (41), (2010).
- Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chapter 2. Chick embryo chorioallantoic membrane models to quantify angiogenesis induced by inflammatory and tumor cells or purified effector molecules. Methods Enzymol. 444, 21-41 (2008).
- Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochem.Cell Biol. 130 (6), 1119-1130 (2008).
- Kern, J., et al. GRP-78 secreted by tumor cells blocks the antiangiogenic activity of bortezomib. Blood. 114 (18), 3960-3967 (2009).
- Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Presta, M. The gelatin sponge-chorioallantoic membrane assay. Nat.Protoc. 1 (1), 85-91 (2006).
- Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Exp.Cell Res. , (2014).
- Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J.Vis.Exp. (33), (2009).
- Kobayashi, T., et al. A chick embryo model for metastatic human prostate cancer. Eur.Urol. 34 (2), 154-160 (1998).
- Koop, S., et al. Fate of melanoma cells entering the microcirculation: over 80% survive and extravasate. Cancer Res. 55 (12), 2520-2523 (1995).
- Martowicz, A., Spizzo, G., Gastl, G., Untergasser, G. Phenotype-dependent effects of EpCAM expression on growth and invasion of human breast cancer cell lines. BMC.Cancer. 12, 501 (2012).
- Martowicz, A., et al. EpCAM overexpression prolongs proliferative capacity of primary human breast epithelial cells and supports hyperplastic growth. Mol.Cancer. 12, 56 (2013).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. 6, 34 (2006).
- Farnoushi, Y., et al. Rapid in vivo testing of drug response in multiple myeloma made possible by xenograft to turkey embryos. Br.J.Cancer. 105 (11), 1708-1718 (2011).
- Wunderlich, M., Krejci, O., Wei, J., Mulloy, J. C. Human CD34+ cells expressing the inv(16) fusion protein exhibit a myelomonocytic phenotype with greatly enhanced proliferative ability. Blood. 108 (5), 1690-1697 (2006).
- Hideshima, T., Mitsiades, C., Tonon, G., Richardson, P. G., Anderson, K. C. Understanding multiple myeloma pathogenesis in the bone marrow to identify new therapeutic targets. Nat.Rev.Cancer. 7 (8), 585-598 (2007).
- Parikh, M. R., Belch, A. R., Pilarski, L. M., Kirshner, J. A three-dimensional tissue culture model to study primary human bone marrow and its malignancies. J.Vis.Exp. (85), (2014).
- Schuler, J., Ewerth, D., Waldschmidt, J., Wasch, R., Engelhardt, M. Preclinical models of multiple myeloma: a critical appraisal. Expert.Opin.Biol.Ther. 13, Suppl 1. S111-S123 (2013).
- Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112 (7), 2935-2945 (2008).
- Jilani, S. M., et al. Selective binding of lectins to embryonic chicken vasculature. J.Histochem.Cytochem. 51 (5), 597-604 (2003).
