Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Biolistisk transformation af en fluorescerende Tagged gen i den opportunistiske svampepatogenet Published: March 19, 2015 doi: 10.3791/52666

Summary

Biolistisk transformation er en metode, der anvendes til at generere en stabil integration af DNA i genomet af de opportunistiske patogen Cryptococcus neoformans gennem homolog rekombination. Vi vil demonstrere biolistisk transformation af en konstruktion, som har genet, der koder acetat kinase fusioneret til fluorescerende tag mCherry i C. neoformans.

Abstract

Den basidiomycete Cryptococcus neoformans, en invasiv opportunistisk patogen af centralnervesystemet, er den hyppigste årsag til svampe meningitis verdensplan resulterer i mere end 625.000 dødsfald om året på verdensplan. Selv elektroporering er blevet udviklet til transformation af plasmiderne i Cryptococcus kun biolistisk levering tilvejebringer et effektivt middel til at omdanne lineær DNA, som kan integreres i genomet ved homolog rekombination.

Acetate har vist sig at være en stor fermenteringsprodukt under cryptococcal infektion, men betydningen af ​​dette er endnu ikke kendt. En bakteriel pathway bestående af enzymerne xylulose-5-phosphat / fructose-6-phosphat phosphoketolase (Xfp) og acetat kinase (ACK) er en af tre mulige veje for acetat produktion i C. neoformans. Her viser vi den biolistiske transformation af en konstruktion,som har genet, der koder Ack fusioneret til fluorescerende tag mCherry, i C. neoformans. Vi bekræfter derefter integration af ACK -mCherry fusion i ACK locus.

Protocol

BEMÆRK: Den samlede ordning af denne protokol er skitseret i figur 1.

1. C. neoformans Forberedelse

  1. For hver transformation reaktion, vokser en 2-3 ml O / N-kulturen af C. neoformans i YPD-medium ved 30 ° C under omrystning ved 250 rpm.
  2. Centrifugeres O / N-kulturen i 5 minutter ved 900 xg ved 10 ° C og supernatanten fjernes.
  3. Resuspender hver cellepellet i 300 pi Yeast Peptone Dextrose (YPD) medium.
  4. Anvendelse af glasperler spredt forsigtigt 300 pi af den vaskede cellesuspension på YPD-agar indeholdende 1 M sorbitol.
  5. Lad plader tørre ved omgivelsernes temperatur i 3-4 timer.

2. Guld mikrobæreren Forberedelse

  1. Resuspender 0,25 g 0,6 um guldperler i 1 ml ddH 2 O til centrifuge i 1 minut ved 900 xg pelletere kuglerne, og supernatanten fjernes.
  2. Resuspender guld perler i 1 ml 100% ethanol. </ Li>
  3. Fordel perlerne i 4 rør, 250 pi hver, og der tilsættes 750 pi 100% ethanol.
  4. Store guld perle portioner ved 4 ° C.

3. DNA-forberedelse

  1. Forbered appelsin Makrobæreren biolistiske diske ved at nedsænke dem i 100% ethanol ved hjælp af pincet. Placer diske i en stor petriskål indeholdende Drierite tørre (sørg for Drierite ikke rører skiverne).
  2. Når tør, skal du trykke Makrobæreren diske i sølv disc indehavere (tidligere tørres af med 100% ethanol).
  3. Vortex guldperler (fremstillet som i trin 2) og alikvote 12 pi i et 1,5 ml mikrocentrifugerør, ét rør pr transformation.
  4. Til hvert rør i rækkefølge: 2 ug DNA (fortrinsvis 2 pi af 1 pg / pl DNA), 10 pi 2,5 M CaCl2, og 2 pi 1 M spermidin fri base.
  5. Oprette en negativ kontrol som i trin 3.4, men med nogen DNA.
  6. Vortex hvert rør og inkuberes ved stuetemperatur i5 min. Forsigtigt svirp hvert rør lejlighedsvis at resuspendere afviklede perlerne i løbet af denne inkubation.
  7. Spin rør ved 225 x g i 30 sek for at pelletere de DNA-coatede guld perler. Fjern forsigtigt supernatanten (ved pipettering eller aspiration) og kasseres.
  8. Resuspendere perlerne helt i 600 pi 100% ethanol ved langsomt at pipettere op og ned.
  9. Spin rør ved 225 xg i 30 sek for at pelletere kuglerne uden pakning. Fjern forsigtigt og kassér supernatanten.
  10. Resuspender DNA-overtrukne guldperler i 8 pi 100% ethanol ved langsomt at pipettere op og ned.
  11. Pipette de DNA-coatede guld perler på midten af ​​den biolistiske disken i en diameter 1 cm og lad det tørre.
    BEMÆRK: En tørret guld cirkel synlig på midten af ​​biolistisk skive indikerer, at en tilstrækkelig koncentration af guldperler er til stede.
    BEMÆRK: Makrobæreren diske fyldt med DNA-overtrukne guldperler er nu klar til brug med genet gun.

4. OKørselstype genkanonen

  1. Tænd vakuumpumpen.
  2. Tænd for helium gas ved at dreje knappen mod uret, indtil et tryk på ca. 2.200 psi er nået på manometeret.
  3. Tænd genkanon ved at vippe den røde kontakten til venstre.
  4. Sørg for, at strømningshastighederne for vakuum og afgangsåbningen justeres så det tomrum vil nå 28 inches Hg inden for 15 sek.
  5. Sørg afstanden mellem brudskiven og Makrobæreren er ca. 3/8 inch.
  6. Rengør hele kammeret ved at tørre ned med ethanol.
  7. Sænk Brudskiver i 100% ethanol. Tillad at tørre på en steril overflade (f.eks petriskål).
  8. Anvend en momentnøgle til at løsne holderen brudskiven. Indsæt en ren brud disk i holderen. Skru holderen brudskiven tilbage på plads, og stram med momentnøgle ved at dreje den en gang til højre.
    BEMÆRK: Brudskiver vil blive erstattet efter hver skyde.
  9. Sænk the mesh skærme i 100% ethanol. Tillad at tørre på en steril overflade (f.eks petriskål).
  10. Når tør, placere en vaskede mesh skærm på den hvide plastik monteringsplade. Placer Makrobæreren Skiveholder DNA nedad til disk kammeret. Skru sølv cap, og placer monteringsplade i den højeste slot.
    BEMÆRK: maskesigte vil blive erstattet efter hver skyde.
  11. Placer en YPD-agarplade indeholdende 1 M sorbitol på bundpladen.
  12. Luk kammer døren og låses på plads.
  13. Tryk og hold den midterste røde kontakten op til at engagere vakuum og lade vakuum til at nå 28 inches Hg. Når ordentlig vakuum er nået, skal du flytte kontakten til den nederste position. Når du er klar, skal du holde den røde kontakt på retten til at skyde. Når brudskiven popper, omgående at løslade ilden knappen, og tryk den midterste røde kontakten til midterpositionen at udlufte kammeret til 0 psi.
  14. Rens brudskive snavs og slukke for genet pistol. Derefter slukke helium gas ved at dreje knappen med uret, og endelig slukke for vakuumpumpen.

5. Belægning transformerede celler

  1. Lad transformation pladerne til at sidde ved stuetemperatur i 4 timer for at tillade cellerne at komme sig.
  2. Pipette 700 pi YPD på pladen. Brug en celleskraber til forsigtigt at skrabe cellerne off af agar og pipette væske i en steril 1,5 ml mikrofugerør. Gentag dette trin for at sikre, at alle celler er blevet inddrevet fra pladen.
  3. Pelletere cellerne ved 225 x g i 30 sek. Fjern og kassér supernatanten.
  4. Resuspender pellet i 500 pi YPD.
  5. Afpipetteres 100 pi af cellesuspensionen på midten af ​​YPD + antibiotiske plader og spredt ved hjælp af glasperler.
  6. Efterlad inverterede plader ved stuetemperatur i 3-4 dage. Som kolonier vises, plaster på ny YPD + antibiotiske plader.

6. Genomisk DNA Isolation til PCR

BEMÆRK: Dette er en modificeret version ved hjælp reagenss fra en DNA-oprensning kit (se tabel Materialer).

  1. Dyrk en 5 ml kultur af hver af C. neoformans transformanter i YPD flydende ved 30 ° C under omrystning ved 250 rpm O / N.
  2. Pellet 3 ml celler ved 900 xg, og resuspender i 600 pi kerner lyseopløsning.
  3. Tilsæt suspensionen til en ny 1,5 ml mikrocentrifugerør med 200 pi 0,5 mm syrevaskede glasperler.
  4. Homogeniseres i 45 sekunder i en mini beadbeater ved omgivende temperatur, afkøles rør på is, og gentag.
  5. Tillad prøve at slå sig ned på is i 2 minutter og overføre supernatanten til et nyt 1,5 ml rør. Tilsæt 200 pi proteinudfældning opløsning til hvert rør (100 pi for hver 600 pi supernatant udvindes) og vortex kraftigt i 20 sek.
  6. Tillad prøver at slå sig ned på is i 5 minutter, og der centrifugeres ved 11.000 xg i 3 min.
  7. Supernatanten overføres til et rent 1,5 ml rør indeholdende 300 pi RT isopropanol. Bland forsigtigt ved at vende.
  8. Centrifuger prøver ved 11.000 xg i 2 min, fjern forsigtigt supernatanten, og tøm rørene på papirservietter.
  9. Tilføj 300 pi RT 70% ethanol til hvert rør, og vend forsigtigt at vaske pelleten.
  10. Centrifuger prøver ved 11.000 xg i 2 min, og fjern forsigtigt al ethanol.
  11. Tøm røret på ren køkkenrulle, og lad pillen lufttørre i 10-15 min.
  12. Der tilsættes 50 pi DNA rehydreringsopløsning og 1,5 pi RNase-opløsning til hver pellet og vortex.
  13. Centrifuger prøver til 5 sek at fjerne al væsken fra hætten.
  14. Inkuber prøver ved 37 ° C i 15 min.
  15. Rehydrere dna ved at inkubere prøverne ved 65 ° C i 1 time.
  16. Kvantificer DNA spektrofotometrisk ved måling af absorbansen ved 260 nm (A 260 læsning af 1,0 svarer til ~ 50 ug / ml dobbeltstrenget DNA), og bruge op til 200 ng i hver PCR-reaktion.

7. RNA Isolation forRevers transkriptase-PCR.

  1. Ved hjælp af en RNA-oprensning kit (se tabel Materialer), skal du følge producentens anvisninger for at isolere RNA fra gærceller ved hjælp af en minibeadbeater.
  2. Kvantificer koncentrationen af RNA ved at måle absorbansen ved 260 nm (A 260 læsning af 1,0 svarer til ~ 40 ug / ml enkeltstrenget RNA).
  3. Brug af et RT-PCR-kit (se tabel Materialer), skal du følge producentens anvisninger for at oprette RT-PCR-reaktioner med ca. 1 ug RNA. For de opnåede resultater i denne undersøgelse, anvende primere, der er opført i tabel 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En vellykket biolistisk transformation af C. neoformans kan opnås ved at følge denne protokol ordning (figur 1). Med biolistisk transformation, er et vellykket shoot af de overtrukne guldperler angivet med en guld ring synlig på pladen efter DNA'et er skudt (figur 2A). Kolonier skal vises inden for 4 til 5 dage, hvor efterladt ved stuetemperatur efter udpladning de udvundne celler fra YPD + 1M sorbitol plader på selektive medier. Omdannelse 2 ug DNA bør resultere i 20 til 30 kolonier (figur 2B). Når kolonier synes, bør de genudstrøget på selektive medier for de enkelte kolonier.

De enkelte kolonier kan dyrkes i YPD medier og både DNA og RNA kan isoleres fra disse celler og analyseret ved PCR og RT-PCR for at bekræfte korrekt integration og ekspression. Hvis denne protokol anvendes til mærkede genfusion, som i dette eksempel, ville primerne brug to annealer i den kodende region af genet af interesse (primer 2) og inden for den 3'-kodende region af genet af interesse (primer 4) (figur 3A). Med denne konstruktion, blev DNA amplificeret fra PCR-reaktionen sekventeret for en anden bekræftelse af, at mCherry tag blev fusioneret i ramme til ACK genet. En positiv PCR bekræftelse ville være en større PCR-produkt fra DNA isoleret fra de transformerede celler sammenlignet med DNA isoleret fra vildtype-celler. En anden PCR-reaktion skal også udføres under anvendelse af primer sæt (primere 2 og 5), hvor den ene primer annealer uden for konstruktionen og i det omgivende genom (primer 5) for at bekræfte den korrekte rekombination i det ønskede locus (primer 7 i tabel 1) (figur 3B). RT-PCR vil blive anvendt til at sikre, at både genet af interesse og tag er begge udtrykt (figur 3C). Sekventering af RT-PCR fusionsprodukt indiCates at etiketten er korrekt fusioneret til genet på RNA-niveau.

Hvis denne protokol anvendes til at slå et gen af ​​interesse, bør primersæt for PCR konstrueres således, at en primer annealer til et genom-sekvens uden for hvor konstruktionen skal rekombinere i genomet, og den anden primer annealer enten i den kodende region af genet eller i den selektive markør. En positiv bekræftelse af, at konstruktionen med held og korrekt har rekombineret ind i genomet ville være tilstedeværelsen af ​​den korrekte størrelse produkt til primersæt der annealer inden for markør, men ikke med primersæt der annealer til genet af interesse. En anden primer sæt bør der har en primer, der annealer uden for designet konstrukt, som anvendes med PCR for at bekræfte, at rekombination begivenhed fandt sted på det rigtige sted. I samme design for at skabe en knockout RNA isoleret fra både de transformerede celler og vildtype (WT) celler, og RT-PCR er udføres for at bekræfte, at ingen ekspression af genet af interesse er observeret fra de transformerede celler.

Fordi en fluorescerende tag blev fusioneret til ACK-genet, en anden bekræftelse af, at rekombination var en succes i det ønskede locus og at RNA bliver oversat til protein er gennem fluorescensmikroskopi (Figur 4). Ideelt er forholdene allerede etableret hvor det er kendt, at proteinet af interesse udtrykkes. Men hvis det fluorescerende signal er for lavt til at observere, er der en mulighed for, at en vellykket rekombination stadig fandt sted, men vækstbetingelser skal ændres i chancen for, at optimale betingelser ikke er opfyldt i tilstrækkelig udtryk, hvilket ville føre til en lav fluorescerende signal. Dette skulle blive bekræftet gennem andre fremgangsmåder, såsom en western blot.

"/>
Figur 1. Protokol ordningen.

Figur 2
Figur 2A. DNA-overtrukne guldperler held skudt på en YPD + 1M sorbitol plade. En orange patch ses i midten af YPD + 1M sorbitol pladen er på grund af de DNA-coatede guld perler, hvilket indikerer korrekt guld forberedelse, samt en vellykket shoot . Figur 2B. Transforming 2 ug af DNA resulterer i 20-30 kolonier per plade. Hvis der blev fortyndet som nævnt i protokollen cellerne, er ca. 20-30 kolonier forventes før udpladning på selektive medier. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3
Figur 3A. Skematisk af ACK: mCherry:.. Neo konstruktion og primer design figur 3B PCR anvendt til at bekræfte vellykket homolog rekombination. Bane 1 og 2: PCR-produkter opnået under anvendelse af primerne 2 og 5 (tabel 1) med genomisk DNA fra vildtype C. neoformans H99 (bane 1) og ACK: mCherry transformeret stamme, (bane 2). Forventede størrelser er 1511 og 5622 bp. Bane 3 og 4 er DNA-produkter i C. neoformans H99 (forventet størrelse 1443 bp) og ACK: mCherry (forventet størrelse 5552 bp) stammer, henholdsvis anvendelse af primerne 2 og 4 i tabel 1. Bane 5 og 6 er de DNA-produkter i C. neoformans H99 (skal ikke anneale) og ACK: mCherry (forventede størrelse 3016 bp) stammer, henholdsvis anvendelse af primere 1 og 3. Figur 3C RT-PCR bekræftelse af ekspression af mCherry tag.. De øverste baner er cDNA produkter af ACKmCherry fusionsproduktet (forventet størrelse 683 bp) amplificeret fra C. neoformansH99 og ACK:. MCherry stammer under anvendelse af primere 2 og 3 i tabel 1 actin genet var inkluderet som en kontrol og blev forstærket under de samme betingelser som ACKmCherry (forventet størrelse 567 bp) ved anvendelse af primere 6 og 7 i tabel 1. Klik her for et større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Fluorescens af mCherry mærkede Ack. Mikroskopisk analyse af stammer, der producerer Ack fusioneret til en mCherry tag med en excitation optimalt ved 587 nm og en emission optimalt ved 610 nm. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

1 KI003 5 '- GTA GCG AGG TCT GGA AGC CAC - 3'
2 ACKmChRT-F 5'GCT TTG GCC GGT ACT ACC AAC -3
3 ACKmChRT-R 5'- GAC AGC TTC AAG TAG TCG GGG -3 '
4 KI004 5 '- GAC TTG GGG AAG AGG AAT TC - 3'
5 KI0032 5 '- CGG GGT ACC ATC AAT AAA AGC TTT CTT CAC TCC - 3'
6 Actin 1 5'CGC TAT FTT CCG TAT CGA TCT TGC -3 '
7 Actin 2 5'CAG CTG GAA GGT AGA CAA AGA GGC -3 '

Tabel 1. PCR og RT-PCR-primere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af priser fra National Science Foundation (Award # 0920274) og South Carolina Experiment Station Project SC-1700340. Dette papir isTechnical bidrag No. 6283 af Clemson University Experiment Station. Forfatterne takker Dr. Lukasz Kozubowski for hans nyttige råd i udviklingen af ​​denne endelige protokol og Dr. Cheryl Ingram-Smith, Katie Glenn, og Grace Kisirkoi for deres kritisk læsning af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.6 μm gold beads Bio-Rad 165-2262 http://www.bio-rad.com
Spermadine-free base Sigma- Aldrich S0266 https://www.sigmaaldrich.com
G418 - Sulfate (Neomycin) Gold Biotechnology G-418-10 www.goldbio.com
Hygromycin Gold Biotechnology H-270-1 www.goldbio.com
1350 psi Rupture Discs Bio-Rad 165-2330 http://www.bio-rad.com
Stopping Screens Bio-Rad 165-2336 http://www.bio-rad.com
Macrocarriers discs Bio-Rad 165-2335 http://www.bio-rad.com
YPD Broth Becton Dickinson & Co. 242820 www.bd.com
Agar Becton Dickinson & Co. 214530 www.bd.com
Sorbitol Fisher Scientific BP439 http://www.fishersci.com
PDS-1000/He System Bio-Rad 165-2257 http://www.bio-rad.com
Microscope Zeiss Axio http://www.zeiss.com/microscopy
KOD One Step PCR Kit EMD Millipore 71086-4 http://www.emdmillipore.com
One Step RT-PCR Kit Qiagen 210212 www.qiagen.com
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1120 www.promega.com
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 www.qiagen.com
Mini Beadbeater - 1 BioSpecs 3110BX http://www.biospec.com
Microfuge 18 Centrifuge Beckman Coulter F241.5P www.beckmancoulter.com
Microplate Spectrophotometer BioTek EPOCH www.biotek.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Price, M. S., et al. Cryptococcusneoformans requires a functional glycolytic pathway for disease but not persistence in the host. MBio. 2, e00103-e00111 (2011).
  2. Bubb, W. A., et al. Heteronuclear NMR studies of metabolites produced by Cryptococcusneoformans in culture media: identification of possible virulence factors. Magn Reson Med. 42, 442-453 (1999).
  3. Himmelreich, U., et al. Identification of metabolites of importance in the pathogenesis of pulmonary cryptococcoma using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Microbes Infect. 5, 285-290 (2003).
  4. Wright, L., et al. Metabolites released by Cryptococcusneoformans var. neoformans and var. gattii differentially affect human neutrophil function. Microbes Infect. 4, 1427-1438 (2002).
  5. Hu, G., Cheng, P. Y., Sham, A., Perfect, J. R., Kronstad, J. W. Metabolic adaptation in Cryptococcusneoformans during early murine pulmonary infection. Mol Microbiol. 69, 1456-1475 (2008).
  6. Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. Acetate kinase: not just a bacterial enzyme. Trends Microbiol. 14, 249-253 (2006).
  7. Davidson, R. C., et al. Gene disruption by biolistic transformation in serotype D strains of Cryptococcus neoformans. Fungal Genet Biol: FG & B. 29, 38-48 (2000).
  8. Toffaletti, D. L., Rude, T. H., Johnston, S. A., Durack, D. T., Perfect, J. R. Gene transfer in Cryptococcusneoformans by use of biolistic delivery of DNA. J. Bacteriol. 175, 1405-1411 (1993).
  9. Edman, J. C., Kwon-Chung, K. J. Isolation of the URA5 gene from Cryptococcusneoformans var. neoformans and its use as a selective marker for transformation. Mol Cell Biol. 10, 4538-4544 (1990).
  10. Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J. Complementation of a capsule-deficient mutation of Cryptococcus neoformans restores its virulence. Mol Cell Biol. 14, 4912-4919 (1994).
  11. Del Poeta, M., et al. Topoisomerase I is essential in Cryptococcusneoformans: role In pathobiology and as an antifungal target. Genetics. 152, 167-178 (1999).
  12. McClelland, C. M., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J. High frequency transformation of Cryptococcusneoformans and Cryptococcusgattii by Agrobacteriumtumefaciens. Fungal Genet Biol:FG & B. 42, 904-913 (2005).
  13. Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor 'DiOlistic' labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
  14. Nicola, A. M., Frases, S., Casadevall, A. Lipophilic dye staining of Cryptococcusneoformans extracellular vesicles and capsule. Eukaryot Cell. 8, 1373-1380 (2009).

Tags

Molekylærbiologi genafbrydelse, acetat kinase overlap PCR fluorescens
Biolistisk transformation af en fluorescerende Tagged gen i den opportunistiske svampepatogenet<em&gt; Cryptococcus neoformans</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Taylor, T., Bose, I., Luckie, T.,More

Taylor, T., Bose, I., Luckie, T., Smith, K. Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans. J. Vis. Exp. (97), e52666, doi:10.3791/52666 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter