Summary
Transformation biolistique est une méthode utilisée pour générer une intégration stable de l'ADN dans le génome de l'agent pathogène Cryptococcus neoformans opportunistes par recombinaison homologue. Nous démontrerons transformation biolistique d'une construction, qui a la kinase acétate de codage de gène fusionné au marqueur fluorescent mCherry en C. neoformans.
Abstract
Le basidiomycète de Cryptococcus neoformans, un pathogène opportuniste invasive du système nerveux central, est la cause la plus fréquente de méningite fongique dans le monde entier résultant dans plus de 625 000 décès par an dans le monde. Bien que l'électroporation a été développé pour la transformation de plasmides dans Cryptococcus, ne délivrance biolistique fournit un moyen efficace pour transformer ADN linéaire qui peut être intégré dans le génome par recombinaison homologue.
Acétate a été montré pour être un produit de fermentation majeure lors de l'infection à Cryptococcus, mais l'importance de ce ne est pas encore connu. Une voie bactérienne composé des enzymes xylulose-5-phosphate / fructose-6-phosphate phosphocétolase (Xfp) et l'acétate kinase (ACK) est l'une des trois voies possibles pour la production d'acétate de C. neoformans. Ici, nous démontrons la transformation biolistique d'une construction,qui a le gène codant Ack fusionné au marqueur fluorescent mCherry, en C. neoformans. Nous confirmons donc l'intégration de la fusion ACK -mCherry dans le locus ACK.
Protocol
NOTE: Le régime global de ce protocole est décrit dans la figure 1.
1. C. neoformans Préparation
- Pour chaque réaction de transformation, 3.2 ml cultiver un O / N culture de C. neoformans en milieu YPD à 30 ° C sous agitation à 250 rpm.
- Centrifuger la culture O / N pendant 5 min à 900 g à 10 ° C et jeter le surnageant.
- Remettre en suspension chaque culot cellulaire dans 300 pi de levure peptone dextrose (YPD) moyenne.
- Utilisation des billes de verre, doucement propager 300 ul de la suspension cellulaire lavée sur de la gélose YPD contenant 1 M de sorbitol.
- Permettre plaques sécher à température ambiante pendant 3-4 heures.
2. Préparation microsupports d'or
- Remettre en suspension 0,25 g de 0,6 um perles d'or dans 1 ml de ddH 2 O, centrifugeuse pendant 1 min à 900 xg pour sédimenter les perles, et retirer le surnageant.
- Resuspendre les billes d'or dans 1 ml d'éthanol à 100%. </ Li>
- Distribuer les billes dans quatre tubes, 250 ul chacun, et ajouter 750 ul d'éthanol 100%.
- Magasin perle en or aliquotes à 4 ° C.
3. Préparation de l'ADN
- Préparer disques macrosupport de biolistiques oranges en les immergeant dans 100% d'éthanol en utilisant une pince. La place des disques dans une grande boîte de Pétri contenant driérite sécher (se assurer que le driérite ne touche pas les disques).
- Une fois sec, appuyez sur les disques de macrosupport dans les supports de disques d'argent (auparavant essuyé avec 100% d'éthanol).
- Vortex perles d'or (préparé comme à l'étape 2) et 12 ul aliquotes dans un tube de 1,5 ml microcentrifugeuse, un tube par la transformation.
- Ajouter à chaque tube dans l'ordre: 2 ug d'ADN (de préférence 2 ul de 1 ug / ul d'ADN), 10 ul de 2,5 M de CaCl2, et de la base libre 2 ul 1 M de spermidine.
- Mettre en place un contrôle négatif comme dans l'étape 3.4 mais sans ADN.
- Vortexer chaque tube et incuber à température ambiante pendant5 min. Tapotez doucement chaque tube à l'occasion pour remettre en suspension les perles réglées au cours de cette incubation.
- tubes à centrifuger à 225 g pendant 30 sec pour sédimenter les billes d'or recouvertes d'ADN. Retirer délicatement le surnageant (par la pipette ou aspiration) et le jeter.
- Remettre les billes complètement dans 600 pi d'éthanol à 100% par pipetage lentement de haut en bas.
- Spin tubes à 225 g pendant 30 secondes pour sédimenter les billes sans emballage. Retirez délicatement et jeter le surnageant.
- Resuspendre les billes d'or recouvertes d'ADN dans 8 ul d'éthanol à 100% en pipettant doucement de haut en bas.
- Pipeter les billes enrobées d'ADN or sur le centre du disque biolistique à un diamètre de 1 cm et laisser sécher.
REMARQUE: Un cercle d'or séché visible sur le centre du disque biolistique indique qu'une concentration suffisante de perles d'or est présent.
REMARQUE: Les disques de macrosupport chargés de perles enrobées d'ADN or sont maintenant prêt à utiliser avec le canon à gènes.
4. Oode Gene Gun
- Mettre la pompe à vide.
- Ouvrez le gaz d'hélium en tournant dans le sens inverse jusqu'à une pression de 2200 psi environ est atteint sur la jauge de pression.
- Allumez le canon à gènes en basculant l'interrupteur rouge sur la gauche.
- Assurez-vous que les débits pour le vide et l'évent sont ajustés de sorte que le vide atteindra 28 pouces de Hg dans les 15 secondes.
- Se assurer que la distance entre le disque de rupture et macrosupport est d'environ 3/8 de pouce.
- Nettoyez toute la chambre en l'essuyant avec de l'éthanol.
- Immerger les disques de rupture à 100% d'éthanol. Laisser sécher sur une surface stérile (par exemple, boîte de Pétri).
- Utilisez une clé dynamométrique pour desserrer le support de disque de rupture. Insérez un disque de rupture propre dans le support. Vissez le support de disque de rupture en place et serrer avec une clé dynamométrique en tournant une fois vers la droite.
REMARQUE: Les disques de rupture seront remplacés après chaque tournage. - Immerger etamis à mailles de e dans l'éthanol 100%. Laisser sécher sur une surface stérile (par exemple, boîte de Pétri).
- Une fois sec, placez un tamis à mailles lavé sur la plaque de montage en plastique blanc. Placez le côté d'ADN de support de disque de macrosupport vers le bas dans la chambre de disque. Visser le capuchon argenté, et placez la plaque de montage au plus haut fente.
REMARQUE: L'écran de maille sera remplacé après chaque tournage. - Placer une plaque de gélose YPD contenant 1 M de sorbitol sur la plaque de fond.
- Fermez la porte de la chambre et le verrouiller en place.
- Appuyez et maintenez enfoncé le bouton rouge du milieu pour engager vide et permettre le vide pour atteindre 28 pouces de Hg. Une fois le niveau de vide adéquate est atteinte, déplacer le commutateur sur la position basse. Lorsque vous êtes prêt, maintenez l'interrupteur rouge à droite au feu. Lorsque le disque de rupture apparaît, relâchez immédiatement le bouton de tir et appuyez sur l'interrupteur rouge du milieu en position centrale pour évacuer la chambre à 0 psi.
- Nettoyez les débris de disque de rupture et éteindre le canon à gènes. Puis éteignez le helium de gaz en tournant le bouton dans le sens horaire, et enfin, éteignez la pompe à vide.
5. Les cellules transformées Placage
- Laisser les plaques de transformation de se asseoir à la température ambiante pendant 4 heures pour permettre aux cellules de se rétablir.
- Pipette 700 pi de YPD sur la plaque. Utilisez un grattoir cellulaire pour gratter délicatement les cellules hors du liquide agar et pipette dans un tube de 1,5 ml microcentrifugeuse stérile. Répétez cette étape pour se assurer que toutes les cellules ont été récupérés sur la plaque.
- Pellet cellules à 225 g pendant 30 sec. Retirer et jeter le surnageant.
- Reprendre le culot dans 500 pi de YPD.
- Pipette 100 ul de la suspension cellulaire sur le centre des plaques + antibiotiques YPD et la propagation utilisant des billes de verre.
- Laissez plaques inversées à température ambiante pendant 3-4 jours. Comme les colonies apparaissent, transdermique sur la nouvelle YPD + plaques antibiotiques.
6. Isolement d'ADN génomique pour la PCR
NOTE: Ce est une version modifiée en utilisant le réactifs à partir d'un kit de purification d'ADN (voir le tableau des matériaux).
- Cultiver une culture de 5 ml de chacun des C. neoformans transformants dans YPD liquide à 30 ° C sous agitation à 250 rpm O / N.
- Pellet 3 ml de cellules à 900 xg, et remettre en suspension dans 600 ul de solution de lyse des noyaux.
- Ajouter la suspension dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 ml avec 200 ul d'acide 0,5 mm de billes de verre lavées.
- Homogénéiser pendant 45 secondes dans une mini BeadBeater à température ambiante, le tube refroidir sur glace, et répéter.
- Laisser l'échantillon se installer sur la glace pendant 2 min et transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml. Ajouter 200 ul de solution de précipitation des protéines à chaque tube, (100 ul pour chaque tranche de 600 ul de surnageant récupéré) et vortexer vigoureusement pendant 20 s.
- Laisser les échantillons se déposent sur la glace pendant 5 min, et centrifuger à 11 000 g pendant 3 min.
- Transférer le surnageant dans un tube de 1,5 ml propre contenant 300 pi de RT isopropanol. Mélanger doucement par inversion.
- Centrifuger les échantillons à 11 000 g pendant 2 min, retirez délicatement le surnageant, et égoutter les tubes sur du papier absorbant.
- Ajouter 300 pi de RT 70% d'éthanol à chaque tube et inverser doucement pour laver le culot.
- Centrifuger les échantillons à 11 000 g pendant 2 min et retirez soigneusement totalité de l'éthanol.
- Égoutter le tube sur des serviettes en papier propre, et de permettre le culot sécher à l'air pendant 10-15 min.
- Ajouter 50 pi de solution de réhydratation ADN et 1,5 pi de solution RNase à chaque pastille et le vortex.
- Centrifuger les échantillons pour 5 sec pour enlever tout le liquide par le bouchon.
- Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 15 min.
- Réhydrater l'ADN par incubation des échantillons à 65 ° C pendant 1 heure.
- Quantifier l'ADN par spectrophotométrie en mesurant l'absorbance à 260 nm (un A 260 lecture de 1,0 équivaut à ~ 50 pg / ml d'ADN double brin), et d'utiliser jusqu'à 200 ng dans chaque réaction PCR.
7. Isolement de l'ARN pourTranscriptase inverse-PCR.
- L'utilisation d'un kit de purification d'ARN (Voir le tableau des matériaux), suivre les instructions du fabricant pour isoler l'ARN à partir de cellules de levure en utilisant un minibeadbeater.
- Quantifier la concentration de l'ARN en mesurant l'absorbance à 260 nm (260 A une lecture de 1,0 est équivalente à ~ 40 pg / ml d'ARN simple brin).
- L'utilisation d'un kit RT-PCR (Voir le tableau des matériaux), suivre les instructions du fabricant de mettre en place des réactions de RT-PCR avec environ 1 ug d'ARN. Pour les résultats obtenus dans cette étude, utiliser les amorces énumérées dans le tableau 1.
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Representative Results
Une transformation biolistique réussie de C. neoformans peuvent être obtenus en suivant le schéma de protocole (figure 1). Avec la transformation biolistique, un lancement réussi des billes d'or recouvertes est indiqué par un anneau d'or visible sur la plaque après que l'ADN est prise (figure 2A). Colonies devraient apparaître dans les 4 à 5 jours lorsqu'il est laissé à la température ambiante après étalement des cellules récupérées à partir des plaques de sorbitol YPD + 1M sur des milieux sélectifs. Transformer 2 ug d'ADN devrait se traduire par 20 à 30 colonies (figure 2B). Lorsque les colonies apparaissent, ils doivent être réensemencer en stries sur des milieux sélectifs pour des colonies individuelles.
Les colonies individuelles peuvent être cultivées dans un milieu YPD, et les deux ADN et l'ARN peuvent être isolés à partir de ces cellules et analysés par PCR et RT-PCR pour confirmer l'intégration et d'expression approprié. Si ce protocole est utilisé pour la fusion de gènes marqués, comme dans cet exemple, les amorces devraient to recuit à l'intérieur de la région codante du gène d'intérêt (amorce 2) et dans la région non codante 3 'du gène d'intérêt (amorce 4) (figure 3A). Avec cette construction, l'ADN amplifié à partir de la réaction de PCR a été séquence pour une autre confirmation que l'étiquette mCherry a été fusionné dans le cadre avec le gène ACK. Une confirmation PCR positif serait un produit de PCR plus grand de l'ADN isolé à partir des cellules transformées par rapport à l'ADN isolé à partir des cellules de type sauvage. Une autre réaction PCR devra également être réalisée en utilisant le jeu d'amorces (amorces 2 et 5), où une amorce se apparie à l'extérieur de la construction et dans le génome environnant (amorce 5) pour confirmer la bonne recombinaison dans le locus souhaité (amorce 7 du tableau 1) (Figure 3B). RT-PCR sera utilisée pour se assurer que tant le gène d'intérêt et le tag sont tous deux étant exprimés (figure 3C). Le séquençage du produit de RT-PCR de fusion indidique que l'étiquette est correctement fusionné au gène au niveau de l'ARN.
Si ce protocole est utilisé pour éliminer un gène d'intérêt, jeux d'amorces pour la PCR doivent être conçus de telle sorte qu'une amorce se hybride à une séquence de génome à l'extérieur de l'endroit où l'assemblage doit se recombiner dans le génome, et l'autre amorce recuits soit dans la région codante du gène ou dans le marqueur sélectif. Une confirmation positive que la construction avec succès et a correctement recombiné dans le génome serait la présence du produit de taille correcte pour l'ensemble d'amorces qui se hybride à l'intérieur du marqueur mais pas avec le jeu d'amorces qui se hybride au gène d'intérêt. Un autre ensemble d'amorces doit être fait qui a une amorce qui se hybride à l'extérieur du produit d'assemblage conçu, qui est utilisé par PCR pour confirmer que l'événement de recombinaison se est produit au niveau du locus correct. Dans le même design pour créer un KO, l'ARN est isolé à la fois des cellules transformées et de type sauvage (WT) cellules, et RT-PCR est effectuée pour confirmer qu'aucune expression du gène d'intérêt est observée à partir des cellules transformées.
Parce qu'un marqueur fluorescent a été fusionné au gène ACK, une autre confirmation que la recombinaison a été un succès dans le locus souhaité et que l'ARN est traduit en protéine se fait par microscopie à fluorescence (Figure 4). Idéalement, les conditions ont déjà été mis en place lorsque l'on sait que la protéine d'intérêt est exprimée. Cependant, si le signal fluorescent est trop faible pour observer, il ya une possibilité que la recombinaison succès encore eu lieu, mais les conditions de croissance doivent être modifiés de la chance que les conditions optimales ne sont pas réunies pour une expression suffisante, ce qui conduirait à une faible fluorescente signaux. Cela devrait être confirmé par d'autres méthodes comme un western blot.
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Figure 1. Schéma Protocole.
La figure 2A. des billes enrobées d'ADN or tiré avec succès sur une plaque de sorbitol YPD + 1M. Une tache orange vu dans le centre de la plaque de sorbitol YPD + 1M est due aux billes enrobées d'ADN or, indiquant préparation d'or approprié, ainsi que d'un lancement réussi . Figure 2B. Transformer 2 ug des résultats d'ADN en 20-30 colonies par plaque. Si les cellules ont été diluées comme mentionné dans le protocole, environ 20-30 colonies sont attendus avant le placage sur des milieux sélectifs. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3A. Schéma de l'ACK: mCherry:.. Neo construction et la conception amorce figure 3B PCR utilisés pour confirmer la réussite recombinaison homologue. Les pistes 1 et 2: Les produits de PCR obtenus en utilisant les amorces 2 et 5 (tableau 1) avec de l'ADN génomique de type sauvage de C. neoformans H99 (voie 1) et le ACK: déformation mCherry transformé, (piste 2). Tailles sont attendus 1511 et 5622 pb, respectivement. Les pistes 3 et 4 sont les produits d'ADN de l'C. neoformans H99 (taille attendue 1443 pb) et le ACK: mCherry (taille attendue 5552 pb) des souches, respectivement, en utilisant les amorces 2 et 4 dans le tableau 1. Les pistes 5 et 6 sont des produits d'ADN de l'C. neoformans H99 (ne devrait pas recuire) et ACK: mCherry (attendus taille 3016 pb) souches, respectivement, en utilisant des amorces 1 et 3. confirmation figure 3C RT-PCR de l'expression de la balise mCherry.. Les voies sont les meilleurs produits d'ADNc du produit de fusion ACKmCherry (taille attendue de 683 pb) amplifié à partir de la C. neoformansH99 et l'accusé de réception. Souches mCherry en utilisant les amorces 2 et 3 dans le tableau 1 du gène d'actine a été inclus comme témoin et a été amplifié dans les mêmes conditions que ACKmCherry (taille attendue de 567 pb) en utilisant des amorces 6 et 7 dans le tableau 1. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. fluorescence de la mCherry étiqueté Ack. L'analyse microscopique des souches productrices Ack fusionnée à une étiquette mCherry avec un optimum d'excitation à 587 nm et un optimum d'émission à 610 nm. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| 1 | KI003 | 5 '- GTA GCG AGG GGA TCT AGC CAC - 3' |
| 2 | ACKmChRT-F | 5'AAC GCT TTG GCC GGT LOI ACC -3 |
| 3 | ACKmChRT-R | 5'-GAC AGC TTC AAG TAG TCG GGG -3 ' |
| 4 | KI004 | 5 '- GAC TTG GGG AAG AGG AAT TC - 3' |
| 5 | KI0032 | 5 '- CGG GGT ACC ATC AAT AAA AGC TTT CTT CAC TCC - 3' |
| 6 | Actine 1 | 5'-CGC TAT CCT GCC TAT CGA TCT TGC -3 ' |
| 7 | 2 Actin | 5'CAG CTG GAA GGT AGA CAA AGA GGC -3 ' |
Tableau 1. amorces de PCR et RT-PCR.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des prix de la National Science Foundation (Award # 0920274) et l'expérience de Caroline du Sud Projet de station de SC-1700340. Ce document isTechnical Contribution n ° 6283 de la station expérimentale de l'Université Clemson. Les auteurs remercient le Dr Lukasz Kozubowski pour ses conseils utiles dans le développement de ce protocole final et le Dr Cheryl Ingram-Smith, Katie Glenn, et Grace Kisirkoi pour leur lecture critique du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 μm gold beads | Bio-Rad | 165-2262 | http://www.bio-rad.com |
| Spermadine-free base | Sigma- Aldrich | S0266 | https://www.sigmaaldrich.com |
| G418 - Sulfate (Neomycin) | Gold Biotechnology | G-418-10 | www.goldbio.com |
| Hygromycin | Gold Biotechnology | H-270-1 | www.goldbio.com |
| 1350 psi Rupture Discs | Bio-Rad | 165-2330 | http://www.bio-rad.com |
| Stopping Screens | Bio-Rad | 165-2336 | http://www.bio-rad.com |
| Macrocarriers discs | Bio-Rad | 165-2335 | http://www.bio-rad.com |
| YPD Broth | Becton Dickinson & Co. | 242820 | www.bd.com |
| Agar | Becton Dickinson & Co. | 214530 | www.bd.com |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | http://www.fishersci.com |
| PDS-1000/He System | Bio-Rad | 165-2257 | http://www.bio-rad.com |
| Microscope | Zeiss | Axio | http://www.zeiss.com/microscopy |
| KOD One Step PCR Kit | EMD Millipore | 71086-4 | http://www.emdmillipore.com |
| One Step RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | www.qiagen.com |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | www.promega.com |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | www.qiagen.com |
| Mini Beadbeater - 1 | BioSpecs | 3110BX | http://www.biospec.com |
| Microfuge 18 Centrifuge | Beckman Coulter | F241.5P | www.beckmancoulter.com |
| Microplate Spectrophotometer | BioTek | EPOCH | www.biotek.com |
References
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