Summary
Biolistische Transformation ein Verfahren verwendet werden, um eine stabile Integration der DNA in das Genom der opportunistisches Pathogen Cryptococcus neoformans durch homologe Rekombination zu erzeugen. Wir biolistische Transformation eines Konstrukts, das den kodierenden Gens Acetatkinase zur Fluoreszenzmarkierung mCherry in C. neoformans fusioniert hat demonstrieren.
Abstract
Die Basidiomyceten Cryptococcus neoformans, eine invasive opportunistische Erreger des zentralen Nervensystems, ist die häufigste Ursache für Pilzmeningitis weltweiten was zu mehr als 625.000 Todesfälle pro Jahr weltweit. Obwohl Elektroporation zur Transformation von Plasmiden in Cryptococcus entwickelt, liefert nur biolistischen Anlieferung ein wirksames Mittel, um eine lineare DNA, die in das Genom durch homologe Rekombination integriert werden kann, zu transformieren.
Acetat wurde gezeigt, ein Hauptfermentationsprodukt während cryptococcal Infektion sein, aber die Bedeutung dieser Tatsache wird noch nicht bekannt. Eine bakterielle Wegs der Enzyme Xylulose-5-Phosphat / Fructose-6-phosphat Phosphoketolase (XFP) und Acetatkinase (Ack) zusammengesetzt ist, eines von drei möglichen Pfade für Acetatproduktion in C. neoformans. Hier zeigen wir die biolistische Transformation eines Konstrukts,was hat die Ack kodierende Gen in die fluoreszierende Markierung verschmolzen mCherry, in C. neoformans. Wir bestätigen dann die Integration des ACK -mCherry Fusion in die ACK-Locus.
Protocol
HINWEIS: Das Gesamtkonzept dieses Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. C. neoformans Vorbereitung
- Für jedes Transformationsreaktion, wachsen einem 2-3 ml O / N-Kultur von C. neoformans in YPD-Medium bei 30 ° C unter Schütteln bei 250 rpm.
- Zentrifugieren Sie die O / N-Kultur für 5 Minuten bei 900 · g bei 10 ° C und den Überstand verwerfen.
- Resuspendieren Zellpellets in 300 & mgr; l Hefe-Pepton-Dextrose (YPD) Medium.
- Mit Glasperlen, sanft verteilen 300 ul der gewaschenen Zellsuspension auf YPD-Agar, 1 M Sorbitol.
- Zulassen Platten bei Raumtemperatur für 3-4 Stunden trocknen.
2. Gold Mikro Vorbereitung
- Resuspendieren 0,25 g von 0,6 um Gold Perlen in 1 ml ddH 2 O, Zentrifuge für 1 min bei 900 xg pelletiert die Perlen, und entfernen Sie den Überstand.
- Resuspendieren der Gold Perlen in 1 ml 100% Ethanol. </ Li>
- Verteilen Sie die Perlen in 4 Röhrchen wurden 250 ul jeder, und fügen Sie 750 ul 100% Ethanol.
- Shop Goldperle Aliquots bei 4 ° C.
3. DNA-Präparation
- Bereiten Orange Makroträger biolistischen Scheiben durch Eintauchen sie in 100% Ethanol mit einer Pinzette. Platz Scheiben in eine große Petrischale Drierite zu trocknen, die (sicherstellen, dass der Drierite nicht die Scheiben berühren).
- Nach dem Trocknen, drücken Sie die Makroträger Scheiben in die Silberplattenhalter (bisher mit 100% Ethanol abgewischt).
- Vortex Gold Perlen (wie in Schritt 2 hergestellt) und aliquote 12 ul in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, eine Röhre pro Transformation.
- Hinzufügen zu jedem Röhrchen, um: 2 ug DNA (vorzugsweise 2 & mgr; l von 1 & mgr; g / & mgr; l DNA), 10 ul 2,5 M CaCl 2 und 2 ul 1 M Spermidin freie Base.
- Eine negative Kontrolle, wie in Schritt 3.4, aber ohne DNA festgelegt.
- Vortex jedes Röhrchen und Inkubation bei Raumtemperatur5 min. Flick vorsichtig jedes Röhrchen gelegentlich die siedelt Perlen Während dieser Inkubation resuspendieren.
- Spin-Röhrchen bei 225 g für 30 Sekunden bis zu pelletieren Sie die DNA-beschichteten Goldperlen. Den Überstand (durch Pipettieren oder Aspiration) Entfernen und entsorgen.
- Resuspendieren Perlen vollständig in 600 ul 100% Ethanol durch langsames Auf- und Abpipettieren.
- Spin-Röhrchen bei 225 xg für 30 Sekunden, um die Kügelchen zu pelletieren ohne Verpackung. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
- Resuspendieren der DNA-beschichteten Goldperlen in 8 ul 100% Ethanol durch langsames Auf- und Abpipettieren.
- Pipettieren Sie die DNA-beschichteten Goldperlen auf die Mitte des biolistischen Scheibe in einer 1 cm Durchmesser und trocknen lassen.
HINWEIS: Eine getrocknete gold Kreis in der Mitte des biolistischen Scheibe sichtbar zeigt an, dass eine ausreichende Konzentration von Gold Perlen vorliegt.
HINWEIS: Die Makroträger Scheiben mit DNA-beschichteten Goldkügelchen beladen sind jetzt bereit für den Einsatz mit der Genkanone.
4. O-perating die Gene Gun
- Einschalten der Vakuumpumpe.
- Schalten Sie das Heliumgas durch Drehen des Knopfes gegen den Uhrzeigersinn, bis ein Druck von etwa 2200 psi wird am Manometer erreicht.
- Schalten Sie den Gen-Kanone, indem Sie den roten Schalter auf der linken Seite.
- Achten Sie darauf, dass die Durchflussraten für das Vakuum und die Entlüftung werden so eingestellt, das Vakuum 28 Zoll Hg innerhalb von 15 Sekunden zu erreichen.
- Seien Sie sicher, dass der Abstand zwischen der Berstscheibe und Makroträger ist ungefähr 3/8 Zoll.
- Die gesamte Kammer Reinigen durch Abwischen mit Ethanol.
- Tauchen Sie die Berstscheiben in 100% Ethanol. Zulassen, um eine sterile Oberfläche trocknen auf (zB Petrischale).
- Verwenden Sie einen Drehmomentschlüssel, um die Berstscheibe Halter lockern. Legen Sie eine saubere Berstscheibe in die Halterung. Schrauben Sie die Berstscheibe Halter zurück an ihren Platz und ziehen Sie mit einem Drehmomentschlüssel durch einmaliges Drehen Sie ihn nach rechts.
HINWEIS: Berstscheiben wird nach jedem Shooting ersetzt werden. - Tauchen Sie the Maschensieben in 100% Ethanol. Zulassen, um eine sterile Oberfläche trocknen auf (zB Petrischale).
- Einmal trocken, legen Sie ein gewaschen Sieb auf dem weißen Kunststoff-Montageplatte. Setzen Sie den Macrocarrier Scheibenhalter DNA Seite nach unten in das Disc-Kammer. Schrauben Sie die silberne Kappe und legen Sie die Montageplatte in der höchsten Steckplatz.
HINWEIS: Das Sieb wird nach jedem Shooting ersetzt werden. - Legen Sie eine YPD-Agar-Platte mit 1 M Sorbit auf der Bodenplatte.
- Halt die Kammertür und einrasten.
- Drücken und halten Sie den mittleren roten Schalter bis zu Vakuum engagieren und das Vakuum bis 28 Zoll Hg erreichen. Sobald geeignete Vakuumniveau erreicht ist, bewegen Sie den Schalter in die untere Position. Wenn Sie bereit sind, halten Sie den roten Schalter auf der rechten Seite, um Feuer. Wenn die Berstscheibe öffnet, lassen Sie sofort den Feuerknopf und drücken Sie den mittleren roten Schalter in die mittlere Position, um die Kammer auf 0 psi entlüften.
- Reinigen Sie Berstscheibe Schutt und schalten Sie den Gen-Kanone. Schalten Sie dann den helium Gas durch Drehen des Knopfes im Uhrzeigersinn, und schließlich, schalten Sie die Vakuumpumpe.
5. Überzug transformierten Zellen
- Lassen Sie die Transformationsplatten bei RT 4 Stunden ruhen lassen, damit die Zellen sich zu erholen.
- Pipette 700 ul YPD auf die Platte. Verwenden Sie einen Zellschaber, um sanft kratzen die Zellen aus der Agar und Pipette Flüssigkeit in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie diesen Schritt, um sicherzustellen, dass alle Zellen von der Platte wiederhergestellt.
- Pelle Zellen bei 225 · g für 30 sec. Entfernen Sie den Überstand.
- Das Pellet in 500 ul YPD.
- Je 100 ul der Zellsuspension in die Mitte der YPD + Antibiotikum Platten und verbreiten mit Glasperlen.
- Lassen umgekehrten Platten bei Raumtemperatur für 3-4 Tage. Wie Kolonien erscheinen, Patch auf neue YPD + Antibiotikum Platten.
6. Die genomische DNA Isolierung für die PCR
Hinweis: Dies ist eine modifizierte Version mit Reagenzs aus einem DNA-Reinigungskits (Siehe Tabelle der Materialien).
- Wachsen Sie eine 5-ml-Kultur von jedem der C neoformans -Transformanten in YPD Flüssigkeit bei 30 ° C unter Schütteln bei 250 rpm O / N.
- Pelle 3 ml Zellen bei 900 · g und Resuspension in 600 & mgr; l der Zellkerne Lyselösung.
- Fügen Sie die Suspension in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 200 ul 0,5 mm säuregewaschene Glasperlen.
- Homogenisierung für 45 Sekunden in einem Mini BeadBeater bei Umgebungstemperatur, kühle Röhrchen auf Eis, und wiederholen.
- Lassen Sie Probe auf Eis für 2 min absetzen und übertragen Stand in ein neues 1,5-ml-Tube. Gib 200 ul Proteinfällungslösung zu jedem Röhrchen (100 & mgr; l pro 600 & mgr; l Überstand gewonnen) und Vortex kräftig 20 sec.
- Werden die Proben auf Eis für 5 min absitzen und Zentrifugieren bei 11.000 g für 3 min.
- Den Überstand in ein sauberes 1,5 ml Röhrchen mit 300 ul RT Isopropanol. Vorsichtig mischen durch Umdrehen.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 11.000 g für 2 min, entfernen Sie vorsichtig den Überstand, und entleeren Sie die Rohre auf Papiertücher.
- Hinzufügen von 300 & mgr; l RT 70% Ethanol zu jedem Röhrchen und vorsichtig umgedreht, um das Pellet zu waschen.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 11.000 g für 2 min, und entfernen Sie vorsichtig die gesamte Ethanol.
- Lassen Sie das Rohr auf die saubere Papierhandtücher, und lassen Sie das Pellet an der Luft trocknen für 10-15 min.
- In 50 ul DNA Rehydrationslösung und 1,5 ul RNase-Lösung zu jedem Pellet und Wirbel.
- Zentrifuge Proben für 5 sec bis die gesamte Flüssigkeit aus der Kappe zu entfernen.
- Proben bei 37 ° C für 15 min.
- Rehydrieren die DNA durch Inkubation der Proben bei 65 ° C für 1 Stunde.
- Quantifizierung DNA spektrophotometrisch durch Messung der Absorption bei 260 nm (A 260 ein Lesen von 1,0 ist äquivalent zu ~ 50 & mgr; g / ml doppelsträngige DNA), und Verwendung von bis zu 200 ng in jeder PCR-Reaktion.
7. RNA-Isolierung fürReverse Transkriptase-PCR.
- Mit Hilfe eines RNA-Reinigungskits (Siehe Tabelle der Materialien), folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, um RNA aus Hefezellen mit einem minibeadbeater isolieren.
- Quantifizierung der Konzentration der RNA durch Messung der Absorption bei 260 nm (A 260 ein Lesen von 1,0 ist äquivalent zu ~ 40 & mgr; g / ml Einzelstrang-RNA).
- Die Verwendung eines RT-PCR-Kit (siehe Tabelle der Materialien), folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, um die RT-PCR-Reaktionen mit ungefähr 1 ug RNA einzurichten. Für die in dieser Studie erhaltenen Ergebnisse, die in Tabelle 1 aufgelisteten Primer.
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Representative Results
Eine erfolgreiche biolistische Transformation von C. neoformans kann durch Anschluss an diese Protokollschema (Abbildung 1) erreicht werden. Mit biolistische Transformation, ist ein erfolgreicher Shooting der beschichteten Goldkügelchen von einem goldenen Ring auf der Platte sichtbar angezeigt, nachdem die DNA Aufnahme (Abbildung 2A). Kolonien sollte innerhalb von 4 bis 5 Tage angezeigt werden, wenn bei Raumtemperatur nach der Plattierung der gewonnenen Zellen von den YPD + 1 M Sorbitol Platten auf selektiven Medien überlassen. Transformation von 2 ug DNA sollte in 20 bis 30 Kolonien (2B) führen. Wenn Kolonien erscheinen, sollten sie auf selektiven Medien für Einzelkolonien ausgestrichen werden.
Die einzelnen Kolonien können in YPD-Medium gezüchtet werden, und beide DNA und RNA aus diesen Zellen isoliert und analysiert werden durch PCR und RT-PCR, um richtige Integration und Expression zu bestätigen. Wenn dieses Protokoll für tagged Genfusion verwendet, wie in diesem Beispiel die Primer müsste to Glühen innerhalb der kodierenden Region des Gens von Interesse (Primer 2) und innerhalb der 3'-nicht-kodierenden Region des Gens von Interesse (Primer 4) (3A). Mit diesem Konstrukt wurde die aus der PCR-Reaktion amplifizierte DNA für eine weitere Bestätigung, dass die mCherry Markierung wurde im Leserahmen an das ACK Gen fusioniert sequenziert. Eine positive PCR Bestätigung würde eine größere PCR-Produkt aus der aus den transformierten Zellen im Vergleich zu den von den Wildtyp-Zellen isolierte DNA isoliert DNA sein. Eine weitere PCR-Reaktion müsste auch durchgeführt werden unter Verwendung des Primersets (Primer 2 und 5), wo ein Primer annealt außerhalb des Konstrukts und innerhalb der umgebenden Genoms (Primer 5), um die korrekte Rekombination in den gewünschten Ort (Primer 7 in Tabelle bestätigen 1) (3B). RT-PCR wird verwendet, um sicherzustellen, dass sowohl das Gen von Interesse und der Tag sind beide ausgedrückt (3C) werden. Sequenzierung des RT-PCR-Fusionsprodukt indihin, dass das Etikett richtig auf das Gen auf RNA-Ebene fusioniert.
Wenn dieses Protokoll verwendet wird, um Knockout eines Gens von Interesse, sollten Primer-Sätze für die PCR entworfen, so daß ein Primer an eine Genomsequenz außerhalb wobei das Konstrukt sollte in das Genom rekombiniert werden, und der andere Primer lagert entweder in der kodierenden Region des Gens oder in der selektiven Marker. Eine positive Bestätigung, dass das Konstrukt erfolgreich und vollständig in das Genom rekombiniert würde das Vorhandensein der richtigen Größe für das Produkt-Primersatz, der in dem Marker, aber nicht mit dem Primer-Satz, die mit dem Gen von Interesse annealt annealt werden. Ein weiteres Primer-Satz zu sagen, daß ein Primer, der außerhalb des entworfenen Konstrukt, das in der PCR verwendet wird, um zu bestätigen, dass das Rekombinationsereignis auftrat bei der richtigen Stelle anlagert hat. Im gleichen Design, einen Knockout zu erzeugen, wird RNA sowohl aus den transformierten Zellen und Wildtyp (WT) Zellen isoliert und RT-PCR ist durchgeführt, um zu bestätigen, dass keine Expression des Gens von Interesse ist, aus den transformierten Zellen beobachtet.
Weil eine fluoreszierende Markierung wurde auf die ACK-Gen fusioniert, eine weitere Bestätigung, daß die Rekombination erfolgreich war in den gewünschten Ort und die RNA wird in ein Protein übersetzt wird durch Fluoreszenzmikroskopie (Abbildung 4). Idealerweise haben sich die Bedingungen bereits hergestellt, wenn bekannt ist, dass das Protein von Interesse exprimiert wird. Jedoch, wenn das Fluoreszenzsignal zu niedrig, um zu beobachten ist, gibt es eine Möglichkeit, dass eine erfolgreiche Rekombination noch stattgefunden hat, aber die Wachstumsbedingungen in der Möglichkeit, dass optimale Bedingungen für eine ausreichende Expression erreicht wurden, die zu einer geringen Fluoreszenz führen würde geändert werden müssen Signal. Dies müsste wie ein Western-Blot, durch andere Methoden bestätigt werden.
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Abbildung 1. Protokoll Schema.
2A. DNA-beschichteten Goldperlen erfolgreich auf eine YPD + 1 M Sorbitol Platte als erfolgreiches Shooting erschossen. Ein orangefarbener Fleck in der Mitte der YPD + 1 M Sorbitol Platte gesehen durch die DNA-beschichteten Goldperlen ist, was auf die richtige Goldpräparat sowie . 2B. Transforming 2 ug DNA führt zu 20-30 Kolonien pro Platte. Wenn die Zellen wurden verdünnt, wie im Protokoll erwähnt, sind ca. 20-30 Kolonien erwartet vor auf selektiven Medien Plattierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
3A. Schematische Darstellung des ACK: mCherry:.. Neo-Konstrukts und Primerdesign 3B PCR verwendet werden, um eine erfolgreiche homologe Rekombination zu bestätigen. Bahnen 1 und 2: PCR-Produkte unter Verwendung der Primer 2 und 5 (Tabelle 1) mit genomischer DNA aus dem Wildtyp C. neoformans H99 (Bahn 1) und das ACK: mCherry transformierten Stamm, (Spur 2). Erwartete Größen sind 1511 und 5622 bp. Bahnen 3 und 4 sind die DNA-Produkte der C. neoformans H99 (erwartete Größe 1443 bp) und das ACK: mCherry (erwartete Größe 5552 bp) Stämme jeweils mit den Primern 2 und 4 in Tabelle 1. Die Spuren 5 und 6 die DNA-Produkte der C. neoformans H99 (nicht tempern) und ACK: mCherry (erwartete Größe 3016 bp) Stämme jeweils mit den Primern 1 und 3 3C RT-PCR-Nachweis der Expression des mCherry Tag.. Die Top-Bahnen sind die cDNA-Produkte des ACKmCherry Fusionsprodukt (erwarteten Größe 683 bp) aus dem C verstärkt neoformansH99 und die ACK:. MCherry Stämme unter Verwendung von Primern 2 und 3 in der Tabelle 1 Die Aktin-Gen wurde als Kontrolle und wurde unter den gleichen Bedingungen wie ACKmCherry (erwarteten Größe 567 bp) unter Verwendung von Primern 6 und 7 in Tabelle 1 verstärkt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Fluoreszenz der mCherry getaggt Ack. Die mikroskopische Analyse von Stämmen, die Ack an einen mCherry Tag mit einem Anregungsoptimum bei 587 nm und einer Emissions Optimum bei 610 nm verschmolzen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
| 1 | KI003 | 5 '- GTA GCG AGG TCT GGA AGC CAC - 3' |
| 2 | ACKmChRT-F | 5'GCT TTG GGT GCC ACT ACC AAC -3 |
| 3 | ACKmChRT-R | 5'-GAC AGC TTC AAG TAG TCG GGG -3 ' |
| 4 | KI004 | 5 '- GAC TTG GGG AAG AGG AAT TC - 3' |
| 5 | KI0032 | 5 '- CGG GGT ACC ATC AAT AAA AGC TTT CTT CAC TCC - 3' |
| 6 | Actin-1- | 5'-CGC TAT CCT CCG TAT CGA TCT TGC-3 ' |
| 7 | Actin 2 | 5 'CAG CTG GAA GGT AGA CAA AGA GGC -3' |
Tabelle 1. PCR und RT-PCR-Primer.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Auszeichnungen von der National Science Foundation (Preis # 0.920.274) und dem South Carolina Experiment Station Projekt SC-1.700.340 unterstützt. Dieses Papier isTechnical Beitrag Nr 6283 der Clemson University Experiment Station. Die Autoren danken Dr. Lukasz Kozubowski für seine hilfreiche Ratschläge bei der Entwicklung dieser letzten Protokoll und Dr. Cheryl Ingram-Smith, Katie Glenn, und Grace Kisirkoi für die kritische Durchsicht des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 μm gold beads | Bio-Rad | 165-2262 | http://www.bio-rad.com |
| Spermadine-free base | Sigma- Aldrich | S0266 | https://www.sigmaaldrich.com |
| G418 - Sulfate (Neomycin) | Gold Biotechnology | G-418-10 | www.goldbio.com |
| Hygromycin | Gold Biotechnology | H-270-1 | www.goldbio.com |
| 1350 psi Rupture Discs | Bio-Rad | 165-2330 | http://www.bio-rad.com |
| Stopping Screens | Bio-Rad | 165-2336 | http://www.bio-rad.com |
| Macrocarriers discs | Bio-Rad | 165-2335 | http://www.bio-rad.com |
| YPD Broth | Becton Dickinson & Co. | 242820 | www.bd.com |
| Agar | Becton Dickinson & Co. | 214530 | www.bd.com |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | http://www.fishersci.com |
| PDS-1000/He System | Bio-Rad | 165-2257 | http://www.bio-rad.com |
| Microscope | Zeiss | Axio | http://www.zeiss.com/microscopy |
| KOD One Step PCR Kit | EMD Millipore | 71086-4 | http://www.emdmillipore.com |
| One Step RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | www.qiagen.com |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | www.promega.com |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | www.qiagen.com |
| Mini Beadbeater - 1 | BioSpecs | 3110BX | http://www.biospec.com |
| Microfuge 18 Centrifuge | Beckman Coulter | F241.5P | www.beckmancoulter.com |
| Microplate Spectrophotometer | BioTek | EPOCH | www.biotek.com |
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