Summary
Trasformazione Biolistic è un metodo utilizzato per generare stabile integrazione del DNA nel genoma delle opportunistiche neoformans patogeno Cryptococcus tramite ricombinazione omologa. Dimostreremo trasformazione biolistica di un costrutto, che ha l'acetato chinasi gene codificante fuso al tag mCherry fluorescente in C. neoformans.
Abstract
Il basidiomicete Cryptococcus neoformans, un patogeno opportunista invasivo del sistema nervoso centrale, è la causa più frequente di meningite fungina con conseguente tutto il mondo in più di 625.000 morti all'anno in tutto il mondo. Sebbene elettroporazione è stato sviluppato per la trasformazione di plasmidi in Cryptococcus, soltanto la consegna biolistic fornisce un mezzo efficace per trasformare DNA lineare che può essere integrato nel genoma mediante ricombinazione omologa.
Acetato ha dimostrato di essere un importante prodotto di fermentazione durante l'infezione criptococcica, ma il significato di questa non è ancora noto. Un percorso batterica composta da enzimi xilulosio-5-fosfato / di fruttosio-6-fosfato phosphoketolase (Xfp) e chinasi acetato (ACK) è uno dei tre possibili percorsi per la produzione di acetato in C. neoformans. Qui, dimostriamo la trasformazione biolistic di un costrutto,che ha il gene che codifica per Ack fuso al tag fluorescenti mCherry, in C. neoformans. Abbiamo poi Confermiamo l'integrazione della fusione ACK -mCherry nel locus ACK.
Protocol
NOTA: Lo schema generale di questo protocollo è descritto nella Figura 1.
1. C. neoformans Preparazione
- Per ogni reazione di trasformazione, crescere un 2-3 ml O / N cultura di C. neoformans in YPD medio a 30 ° C in agitazione a 250 rpm.
- Centrifugare la / cultura O N per 5 minuti a 900 xga 10 ° C e scartare il surnatante.
- Risospendere ogni pellet cellulare in 300 ml di lievito Peptone destrosio (YPD) medio.
- Utilizzando perle di vetro, si sviluppa lentamente 300 ml di sospensione cellulare lavato su agar YPD contenente 1 M sorbitolo.
- Lasciare le piastre ad asciugare a temperatura ambiente per 3-4 ore.
2. Oro microcarrier Preparazione
- Risospendere 0,25 g di 0,6 micron perle d'oro in 1 ml di DDH 2 O, centrifugare per 1 min a 900 xg a pellet le perline, e rimuovere il surnatante.
- Risospendere le perle d'oro in 1 ml di etanolo al 100%. </ Li>
- Distribuire le perline in 4 tubi, 250 microlitri ciascuna, e aggiungere 750 ml di etanolo al 100%.
- Conservare aliquote perline oro a 4 ° C.
Preparazione DNA 3.
- Preparare i dischi macrocarrier Biolistic arancione da loro immergendo in 100% etanolo usando pinze. Dischi Mettere in un grande piatto di Petri contenente Drierite asciugare (assicurarsi che il Drierite non tocchi i dischi).
- Una volta asciutto, premere i dischi macrocarrier nei supporti disco d'argento (precedentemente puliti con 100% di etanolo).
- Perline Vortex oro (preparato come al punto 2) e aliquote di 12 ml in 1,5 ml provetta, un tubo per la trasformazione.
- Aggiungere ad ogni provetta per: 2 mg di DNA (preferibilmente 2 ml di 1 mg / mL di DNA), 10 microlitri 2,5 M CaCl 2, e 2 ml 1 M spermidine base libera.
- Impostare un controllo negativo come nel passaggio 3.4 ma senza DNA.
- Vortex ciascuna provetta e incubare a temperatura ambiente per5 min. Flick delicatamente ogni tubo di tanto in tanto per risospendere le sfere regolate durante questa incubazione.
- Tubi Spin a 225 g per 30 sec a pellet perline oro rivestite di DNA. Rimuovere con attenzione il surnatante (pipettando o aspirazione) e scartare.
- Perline risospendere completamente in 600 ml di etanolo al 100% da lentamente pipettando su e giù.
- Spin provette a 225 xg per 30 secondi per far sedimentare le perline senza imballaggio. Rimuovere con cautela e scartare il surnatante.
- Risospendere le sfere d'oro rivestite di DNA a 8 ml di etanolo al 100% lentamente pipettando su e giù.
- Pipettare le perline oro rivestite di DNA sul centro del disco biolistic in un diametro di 1 cm e lasciare asciugare.
NOTA: Un cerchio oro essiccati visibile sul centro del disco biolistic indica che una concentrazione sufficiente di perline oro è presente.
NOTA: I dischi macrocarrier caricati con perle oro rivestite di DNA sono ora pronti per l'uso con la pistola gene.
4. OPerating il Gene Gun
- Accendere la pompa a vuoto.
- Accendere il gas elio ruotando la manopola in senso antiorario fino ad una pressione di circa 2200 psi viene raggiunto sul manometro.
- Accendere la pistola gene spostando l'interruttore rosso sulla sinistra.
- Assicurarsi che le portate per il vuoto e la ventola sono regolati in modo che il vuoto raggiungerà 28 pollici Hg entro 15 sec.
- Assicurarsi che la distanza tra il disco di rottura e macrocarrier è di circa 3/8 di pollice.
- Pulire l'intera camera pulendo giù con etanolo.
- Immergere i dischi di rottura di 100% di etanolo. Lasciare asciugare su una superficie sterile (ad esempio, Petri piatto).
- Utilizzare una chiave dinamometrica per allentare il supporto disco di rottura. Inserire un disco di rottura pulito nel supporto. Avvitare il supporto disco di rottura al suo posto e stringere con la chiave coppia girandolo una volta a destra.
NOTA: I dischi di rottura saranno sostituiti dopo ogni tiro. - Immergere the schermi di maglia in 100% di etanolo. Lasciare asciugare su una superficie sterile (ad esempio, Petri piatto).
- Una volta asciutto, mettere un setaccio a maglie lavato sulla piastra di montaggio in plastica bianca. Posizionare il lato titolare DNA disco macrocarrier giù nella camera del disco. Avvitare il tappo in argento, e posizionare la piastra di montaggio nel più alto slot.
NOTA: Lo schermo di maglia sarà sostituito dopo ogni tiro. - Posizionare un piatto YPD agar contenente 1 M sorbitolo sul fondo piatto.
- Chiudi porta della camera e bloccare in posizione.
- Premere e tenere premuto il tasto centrale rosso fino a coinvolgere il vuoto e permettere il vuoto di raggiungere 28 pollici Hg. Una volta che il livello di vuoto corretta viene raggiunto, spostare l'interruttore in posizione abbassata. Quando è pronto, tenere premuto il tasto rosso sulla destra per sparare. Quando il disco di rottura si apre, rilasciare immediatamente il pulsante di fuoco e premere l'interruttore centrale rossa in posizione centrale per sfogare la camera a 0 psi.
- Pulire i detriti disco di rottura e spegnere la pistola gene. Quindi spegnere il helium gas ruotando la manopola in senso orario, e, infine, spegnere la pompa a vuoto.
5. Cellule placcatura trasformate
- Lasciare le piastre di trasformazione a sedersi a temperatura ambiente per 4 ore per consentire alle cellule di recuperare.
- Pipettare 700 ml di YPD sulla piastra. Utilizzare un raschietto cellulare per raschiare delicatamente le cellule fuori del liquido agar e trasferirli in una sterile 1,5 ml provetta da microcentrifuga. Ripetere questo passaggio per assicurare tutte le cellule sono state recuperate dalla piastra.
- Agglomerare cellule a 225 xg per 30 sec. Rimuovere e scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet in 500 ml di YPD.
- Dispensare 100 l di sospensione cellulare sul centro dei piatti + antibiotici YPD e diffondere con perle di vetro.
- Lasciare le piastre capovolte a temperatura ambiente per 3-4 giorni. Come appaiono colonie, cerotto sulla nuova YPD + piastre antibiotici.
6. Isolamento DNA genomico per PCR
NOTA: Questa è una versione modificata utilizzando reagentis da un kit di purificazione del DNA (Vedi Tabella dei Materiali).
- Crescere una cultura 5 ml di ciascuno dei C. neoformans trasformanti in YPD liquido a 30 ° C in agitazione a 250 rpm O / N.
- Pellet 3 ml di cellule a 900 xg, e risospendere in 600 ml di soluzione di lisi dei nuclei.
- Aggiungere la sospensione ad una nuova provetta da 1,5 ml microcentrifuga con 200 ml di acido 0,5 millimetri lavati perline di vetro.
- Omogeneizzare per 45 secondi in un mini beadbeater a temperatura ambiente, tubo freddo sul ghiaccio, e ripetere.
- Lasciare che il campione di stabilirsi in ghiaccio per 2 minuti e trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml. Aggiungere 200 ml di soluzione proteica precipitazioni a ciascun tubo, (100 ml per ogni 600 ml di surnatante recuperato) e vortex energicamente per 20 sec.
- Lasciare che i campioni di stabilirsi in ghiaccio per 5 minuti, e centrifugare a 11.000 xg per 3 min.
- Trasferire il surnatante in una provetta da 1,5 ml pulito contenente 300 ml di RT isopropanolo. Mescolare delicatamente per inversione.
- Centrifugare i campioni a 11.000 xg per 2 minuti, rimuovere con attenzione il surnatante, e drenano i tubi su tovaglioli di carta.
- Aggiungere 300 ml di RT 70% di etanolo a ciascuna provetta, e capovolgere delicatamente per lavare il pellet.
- Centrifugare i campioni a 11.000 xg per 2 minuti, e con attenzione rimuovere tutti i etanolo.
- Svuotare il tubo sulla carta assorbente pulita, e permettere il pellet asciugare per 10-15 minuti.
- Aggiungere 50 ml di soluzione di reidratazione DNA e 1,5 ml di soluzione di RNase ad ogni pellet e vortice.
- Campioni di centrifugazione per 5 secondi per rimuovere tutto il liquido dal tappo.
- Incubare i campioni a 37 ° C per 15 min.
- Reidratare il DNA incubando i campioni a 65 ° C per 1 ora.
- Quantificare DNA spettrofotometricamente misurando l'assorbanza a 260 nm (un A 260 lettura di 1.0 è equivalente a ~ 50 ug / ml di DNA a doppio filamento), e utilizzare fino a 200 ng in ciascuna reazione PCR.
7. RNA Isolation perReverse Transcriptase-PCR.
- Utilizzando un kit di purificazione RNA (Vedi Tabella dei Materiali), seguire le istruzioni del produttore per isolare RNA da cellule di lievito con un minibeadbeater.
- Quantificare la concentrazione dell'RNA misurando l'assorbanza a 260 nm (un A 260 lettura di 1.0 è equivalente a ~ 40 ug / ml di RNA a singolo filamento).
- L'utilizzo di un kit di RT-PCR (vedi Tabella dei Materiali), seguire le istruzioni del produttore di creare reazioni RT-PCR, con circa 1 mg di RNA. Per i risultati ottenuti in questo studio, utilizzare i primer elencati nella Tabella 1.
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Representative Results
Un successo trasformazione biolistic di C. neoformans possono essere ottenute seguendo questo schema di protocollo (Figura 1). Con trasformazione biolistica, un germoglio successo delle perle oro rivestite è indicato da un anello oro visibile sulla piastra dopo il DNA è girato (Figura 2A). Colonie dovrebbero apparire entro 4 o 5 giorni se lasciato a temperatura ambiente dopo la placcatura le cellule recuperate dalle piastre sorbitolo YPD + 1M su terreni selettivi. Trasformando 2 ug di DNA dovrebbe comportare 20 a 30 colonie (Figura 2B). Quando appaiono le colonie, dovrebbero essere restreaked su terreni selettivi per le singole colonie.
Le singole colonie possono essere coltivate nei media YPD, ed entrambi DNA e RNA possono essere isolati da queste cellule e analizzati tramite PCR e RT-PCR per confermare la corretta integrazione e di espressione. Se questo protocollo viene utilizzato per tag fusione genica, come in questo esempio, i primers dovrebbero to ricottura all'interno della regione codificante del gene di interesse (primer 2) e nell'ambito della regione non codificante 3 'del gene di interesse (Primer 4) (Figura 3A). Con questo costrutto, il DNA amplificato dalla reazione di PCR è stato sequenziato per un'altra conferma che il tag mCherry stata fusa in frame gene ACK. Una conferma positiva PCR sarebbe un prodotto PCR grande dal DNA isolato dalle cellule trasformate rispetto al DNA isolato dalle cellule wild type. Un'altra reazione PCR avrebbe anche bisogno di essere condotta utilizzando il set di primer (primer 2 e 5) dove si Primer annealing di fuori del costrutto e all'interno del genoma circostante (fondo 5) per confermare la ricombinazione corretto nel locus desiderato (fondo 7 in tabella 1) (Figura 3B). RT-PCR sarà utilizzata per assicurarsi che sia il gene di interesse e l'etichetta sono espresse entrambe (Figura 3C). Il sequenziamento del RT-PCR prodotto di fusione indiCates che l'etichetta sia correttamente fuso al gene a livello dell'RNA.
Se questo protocollo è utilizzato per mettere fuori un gene di interesse, set di primer per PCR devono essere progettati in modo tale che un innesco annealing ad una sequenza genomica di fuori di dove il costrutto deve ricombinarsi nel genoma, e l'altro innesco annealing sia nella regione codificante del gene o il marcatore selettivo. Una conferma positiva che il costrutto ha successo e correttamente ricombinato nel genoma sarebbe la presenza del prodotto di dimensioni corrette per il set di primer che annealing all'interno del marcatore ma non con il primer che annealing al gene di interesse. Un'altra serie primer deve essere fatto che ha un primer annealing di fuori del costrutto progettato, che viene utilizzato con PCR per confermare che l'evento di ricombinazione verificato al locus corretta. Nello stesso disegno di creare un ko, RNA è isolato da entrambe le cellule trasformate e wild type (WT), le cellule, e RT-PCR è eseguita per confermare che nessuna espressione del gene di interesse viene osservata dalle cellule trasformate.
Poiché un tag fluorescente è stato fuso al gene ACK, un'altra conferma che la ricombinazione è un successo nel locus desiderata e che l'RNA viene tradotto in proteina è tramite microscopia a fluorescenza (Figura 4). Idealmente, sono già state stabilite le condizioni in cui si sa che la proteina di interesse sia espressa. Tuttavia, se il segnale fluorescente è troppo basso per osservare, vi è la possibilità che la ricombinazione successo ancora verificato, ma le condizioni di crescita devono essere modificati nel caso che non sono state soddisfatte le condizioni ottimali per l'espressione sufficiente, che porterebbe ad una bassa fluorescenza segnale. Questo dovrebbe essere confermata attraverso altri metodi come un western blot.
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Figura 1. Schema di protocollo.
Figura 2A. Perle oro rivestite di DNA girati su una piastra sorbitolo YPD + 1M. Un cerotto arancione visto nel centro della piastra sorbitolo YPD + 1M è dovuto alle perline oro rivestite di DNA, indicando corretta preparazione oro, così come un germoglio successo . Figura 2B. Trasformando 2 ug di DNA risultati in 20-30 colonie per piastra. Se le cellule sono stati diluiti come indicato nel protocollo, circa 20-30 colonie sono attesi prima di placcatura su terreni selettivi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3A. Schema del ACK: mCherry:.. Costruzione Neo e design Guida Figura 3B PCR utilizzati per confermare il successo ricombinazione omologa. Lanes 1 e 2: prodotti di PCR ottenuti utilizzando primer 2 e 5 (Tabella 1) con il DNA genomico da selvatici tipo C. neoformans H99 (corsia 1) e l'ACK: deformazione mCherry trasformati, (corsia 2). Dimensioni attesi sono il 1511 e il 5622 bp rispettivamente. Corsie 3 e 4 sono i prodotti di DNA di C. neoformans H99 (dimensioni previste 1443 bp) ed il ACK: mCherry (dimensioni previste 5552 bp) ceppi, rispettivamente, usando primer 2 e 4 in Tabella 1. Corsie 5 e 6 sono i prodotti di DNA di C. neoformans H99 (non dovrebbe temprare) e ACK: mCherry (dimensioni 3016 bp attesi) ceppi, rispettivamente, utilizzando primer 1 e 3. Figura 3C RT-PCR conferma di espressione del tag mCherry.. I primi vicoli sono i prodotti cDNA del prodotto ACKmCherry di fusione (prevista formato 683 bp) amplificato dalla C. neoformansH99 e l'ACK:. Ceppi mCherry utilizzando primer 2 e 3 della tabella 1 Il gene actina è stata inclusa come controllo e stato amplificato alle stesse condizioni come ACKmCherry (dimensioni previste 567 bp) utilizzando primer 6 e 7 nella tabella 1. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. fluorescenza del mCherry contrassegnati Ack. Analisi microscopica di ceppi produttori Ack fuso a un tag mCherry con una condizione ideale di eccitazione a 587 nm e un ottimale emissione a 610 nm. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| 1 | KI003 | 5 '- GTA GCG AGG TCT GGA AGC CAC - 3' |
| 2 | ACKmChRT-F | 5'-AAC GCT TTG GCC GGT ACT ACC -3 |
| 3 | ACKmChRT-R | 5'-GAC AGC TTC AAG TAG TCG GGG -3 ' |
| 4 | KI004 | 5 '- GAC TTG GGG AAG AGG AAT TC - 3' |
| 5 | KI0032 | 5 '- CGG GGT ACC ATC AAT AAA AGC TTT CTT CAC TCC - 3' |
| 6 | Actin 1 | 5'-CGC TAT CCT CCG TAT CGA TCT TGC -3 ' |
| 7 | Actin 2 | 5'-CAG CTG GAA GGT AGA CAA AGA GGC -3 ' |
Tabella 1. PCR e RT-PCR primer.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da premi dalla National Science Foundation (Award # 0.920.274) e l'esperimento South Carolina Progetto Stazione SC-1.700.340. Questo documento isTechnical Contributo No. 6283 del Experiment Station Clemson University. Gli autori ringraziano il Dr. Lukasz Kozubowski per i suoi utili consigli per lo sviluppo di questo protocollo finale e il dottor Cheryl Ingram-Smith, Katie Glenn, e Grace Kisirkoi per la lettura critica del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 μm gold beads | Bio-Rad | 165-2262 | http://www.bio-rad.com |
| Spermadine-free base | Sigma- Aldrich | S0266 | https://www.sigmaaldrich.com |
| G418 - Sulfate (Neomycin) | Gold Biotechnology | G-418-10 | www.goldbio.com |
| Hygromycin | Gold Biotechnology | H-270-1 | www.goldbio.com |
| 1350 psi Rupture Discs | Bio-Rad | 165-2330 | http://www.bio-rad.com |
| Stopping Screens | Bio-Rad | 165-2336 | http://www.bio-rad.com |
| Macrocarriers discs | Bio-Rad | 165-2335 | http://www.bio-rad.com |
| YPD Broth | Becton Dickinson & Co. | 242820 | www.bd.com |
| Agar | Becton Dickinson & Co. | 214530 | www.bd.com |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | http://www.fishersci.com |
| PDS-1000/He System | Bio-Rad | 165-2257 | http://www.bio-rad.com |
| Microscope | Zeiss | Axio | http://www.zeiss.com/microscopy |
| KOD One Step PCR Kit | EMD Millipore | 71086-4 | http://www.emdmillipore.com |
| One Step RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | www.qiagen.com |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | www.promega.com |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | www.qiagen.com |
| Mini Beadbeater - 1 | BioSpecs | 3110BX | http://www.biospec.com |
| Microfuge 18 Centrifuge | Beckman Coulter | F241.5P | www.beckmancoulter.com |
| Microplate Spectrophotometer | BioTek | EPOCH | www.biotek.com |
References
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