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Immunology and Infection

편의적 곰팡이 병원균에 형광 태그 유전자의과 유전자 변형 Published: March 19, 2015 doi: 10.3791/52666
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Genetics and Biochemistry, Eukaryotic Pathogens Innovation Center (EPIC), Clemson University, 2Department of Biology, Western Carolina University

Summary

유전자 총 변형은 상동 재조합을 통하여 기회 병원체 크립토 콕 쿠스 네오 포르 만 스의 게놈 DNA 내로 안정적으로 통합을 생성하는 데 사용되는 방법이다. 우리는 C. 콕 쿠스 네오 포르 만 스에 mCherry 형광 태그에 융합 된 유전자 부호화 아세테이트 키나아제를 갖는 구조, 유전자 총의 변화를 설명 할 것이다.

Abstract

담자균 크립토 콕 쿠스 네오 포르 만, 중추 신경계의 침입 기회 병원균은 전 세계적으로 전 세계적으로 연간 이상 625,000 명이 사망 진균 성 수막염의 가장 흔한 원인이다. 전기 천공은 크립토에서 플라스미드의 형질 전환을 위해 개발되었지만, 오직과 유전자 전달은 상동 재조합에 의해 게놈 내로 통합 될 수있는 선형 DNA를 변환하는 효과적인 수단을 제공한다.

아세트산 크립토 감염시 중요한 발효 산물 것으로 도시 하였지만, 이것의 의미는 아직 알려져 있지 않다. 효소 크실 로스 -5- 포스페이트 / 프 룩토 오스 -6- 포스페이트 phosphoketolase (XFP 광고) 및 아세테이트 키나아제 (ACK)로 구성된 세균 통로 C. 아세테이트의 제조를위한 세 개의 가능한 경로 중 하나이다 콕 쿠스 네오 포르 만. 여기, 우리는 구조의과 유전자 변형을 보여,긍정 응답을 코딩하는 유전자는 mCherry 형광 태그에 융합시킨 C. 콕 쿠스 네오 포르 만. 우리는 그 다음 ACK 궤적에 ACK -mCherry 융합의 통합을 확인합니다.

Protocol

참고 :이 프로토콜의 전체 체계는 그림 1에 설명되어 있습니다.

1. C. 콕 쿠스 네오 포르 만 준비

  1. 각각의 변환 반응, C.의 2-3 ㎖의 O / N 배양 성장 30 ° C에서 YPD 배지에서 콕 쿠스 네오 포르 만 250 rpm에서 진탕.
  2. 10 ° C에서 900 XG에서 5 분 동안 O / N 문화를 원심 분리기 상층 액을 버린다.
  3. 효모 펩톤 덱스 트로 오스 (YPD) 매체의 300 μL의 각 세포 펠렛을 재현 탁.
  4. 유리 비드를 사용하여 조심스럽게 1 M 소르비톨을 함유하는 YPD 한천 상으로 세정 세포 현탁액 300 μl를 확산.
  5. 판은 3 ~ 4 시간 동안 상온에서 건조하도록 허용합니다.

2. 골드 미세 전달체 준비

  1. DDH 2 O 1 ml의 0.6 μm의 골드 비즈의 0.25 g을 재현 탁, 900 XG에 1 분 동안 원심 분리기는 비드 펠렛, 상층 액을 제거합니다.
  2. 100 % 에탄올 1 ㎖에 금 비드를 재현 탁. </ 리>
  3. 4 튜브, 각 μL (250)에 구슬을 배포, 100 % 에탄올 750 μl를 추가합니다.
  4. 4 ℃에서 보관 골드 비드 씩.

3. DNA 준비

  1. 100 % 에탄올을 사용하여 집게에서 그들을 잠수에 의해 오렌지 마크로 캐리어의 유전자 총 디스크를 준비합니다. 건조 drierite를 포함하는 큰 페트리 접시에 배치 디스크 (drierite가 디스크에 닿지 않도록해야합니다).
  2. 일단 건조, (이전에 100 % 에탄올로 닦여)은 디스크 홀더에 마크로 캐리어 디스크를 누르십시오.
  3. 변환 당 1.5 ml의 microcentrifuge 관, 하나의 튜브에 (2 단계에서와 같이 제조) 소용돌이 골드 비즈와 나누어지는 12 μL.
  4. 위해 각 튜브에 추가 : 2 DNA의 μg의 (바람직하게는 1 μg의 DNA의 / μL 2 μL), 10 ㎕의 2.5 M CaCl2를, 2 μL 1 M 스퍼 미딘 유리 염기.
  5. 단계 3.4에서와 같이하지만 DNA와 음성 대조군을 설정합니다.
  6. 소용돌이 각각의 튜브는 상온에서 부화5 분. 조심스럽게이 배양 동안 정착 구슬을 재현 탁 가끔씩 각 튜브를 가볍게.
  7. 30 초 동안 225 XG에 스핀 튜브는 DNA 코팅 골드 비즈 펠렛합니다. 조심스럽게 (피펫 또는 흡인에 의해) 상층 액을 제거하고 폐기합니다.
  8. 천천히 피펫 아래로 완전히 100 % 에탄올 600 μL에 재현 탁 구슬.
  9. 포장없이 구슬을 펠렛 30 초 동안 225 XG에 튜브를 스핀. 조심스럽게 제거하고 상층 액을 버린다.
  10. 천천히 피펫 아래 100 % 에탄올의 8 μL의 DNA 코팅 골드 비즈을 재현 탁.
  11. 1cm 직경과 유전자 디스크의 중심에 DNA 코팅 골드 비즈를 피펫 건조 할 수 있습니다.
    참고 : 유전자 총 디스크의 중앙에 표시 건조 골드 원 골드 비즈의 충분한 농도가 존재 함을 나타냅니다.
    참고 : DNA 코팅 골드 비즈와 함께로드 마크로 캐리어 디스크는 이제 유전자 총을 사용할 준비가되었습니다.

4. O유전자 총을 perating

  1. 진공 펌프의 전원을 켭니다.
  2. 약 2,200 PSI의 압력까지 시계 반대 방향으로 노브를 돌려 헬륨 가스를 켜고 압력 게이지에 도달.
  3. 왼쪽에있는 빨간색 스위치를 틀지하여 유전자 총을 켭니다.
  4. 진공 15 초 이내에 28인치 수은에 도달 할 수 있도록 진공 배기의 유속이 조정되어 있는지 확인합니다.
  5. 파열판 및 마크로 캐리어 사이의 거리가 약 3/8 인치 있는지 확인하십시오.
  6. 에탄올로 닦고하여 전체 챔버를 청소합니다.
  7. 100 % 에탄올에 파열 디스크를 담근다. 멸균 표면에 건조하도록 허용 (예를 들어, 페트리 접시).
  8. 파열판 홀더를 풀고 토크 렌치를 사용합니다. 홀더에 깨끗한 파열 디스크를 넣습니다. 다시 제자리에 파열 디스크 홀더 나사 오른쪽으로 한 번 돌려 토크 렌치로 조입니다.
    참고 : 파열 디스크는 각각 촬영 다음과 같은 대체됩니다.
  9. 제 잠수함100 % 에탄올 중의 E 메쉬 스크린. 멸균 표면에 건조하도록 허용 (예를 들어, 페트리 접시).
  10. 일단 건조, 흰색 플라스틱 마운팅 플레이트에 세척 메쉬 스크린을 배치합니다. 디스크 챔버로 아래 마크로 캐리어 디스크 홀더 DNA 측 놓습니다. 실버 캡 나사, 가장 높은 슬롯에 장착 판을 배치합니다.
    주 : 메쉬 스크린은 각 촬영 후 대체됩니다.
  11. 바닥 판에 1 M 소르비톨을 포함하는 YPD 한천 플레이트를 놓습니다.
  12. 실 문을 종료하고 제자리에 고정.
  13. 밀어 진공 참여하고 진공 28인치 수은에 도달 할 수 있도록 중간 빨간색 스위치를 누르고 있습니다. 적절한 진공 레벨에 도달하면, 아래 위치에이 스위치를 이동합니다. 준비가되면은, 발사 오른쪽에있는 빨간색 스위치를 누르십시오. 파열판이 올라 오면 즉시 발사 버튼을 해제하고 0 PSI에 챔버를 배출하기 위해 중간 위치에 중간 빨간색 스위치를 밀어 넣습니다.
  14. 파열 된 디스크 파편을 청소하고 유전자 총을 끄십시오. 그런 다음 heliu을 해제노브를 시계 방향으로 회전하고, 최종적으로 진공 펌프를 해제함으로써 m 가스.

5. 도금 형질 전환 세포

  1. 변환 판이 세포가 복구 할 수 있도록 4 시간 동안 실온에서 방치시키고.
  2. 접시에 YPD의 피펫 700 μL. 부드럽게 멸균 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 한천과 피펫 액체의 떨어져 세포를 긁어 세포 스크레이퍼를 사용합니다. 모든 세포가 판에서 발견 된 보장하기 위해이 단계를 반복합니다.
  3. 30 초 동안 225 XG에서 세포 펠렛. 제거하고 상층 액을 버린다.
  4. YPD 500 μL에 펠렛을 재현 탁.
  5. 피펫 100 + 항생제 YPD 플레이트의 중심 상에 세포 현탁액 μL 및 유리 비드를 사용하여 확산.
  6. 3~4일 동안 실온에서 거꾸로 판을 둡니다. 식민지가 나타날 때, 새로운 YPD + 항생제 플레이트 상에 패치.

PCR 6. 게놈 DNA 분리

주 :이 시약을 사용하여 수정 된 버전 인DNA 정제 키트들 (재료의 표 참조).

  1. C. 각 5 ml의 문화를 성장 30 ° C에서 YPD 액체에 콕 쿠스 네오 포르 만의 형질 전환 체는 250 rpm으로 O / N에 떨고.
  2. 900 XG에 3 ml의 세포를 펠렛 및 핵 분해 용액 600 μL에 재현 탁.
  3. 0.5 mm 산 200 μL와 새로운 1.5 ㎖의 마이크로 원심 분리 튜브에 현탁액을 추가 유리 비드를 세척 하였다.
  4. 얼음에 주위 온도, 냉각 관에서 미​​니 beadbeater 45 초 동안 균질화하고, 반복합니다.
  5. 샘플은 2 분 동안 얼음에 정착하고 새로운 1.5 ML 튜브에 뜨는을 전송하도록 허용합니다. 20 초 동안 격렬하게 소용돌이 (상층 액을 회수마다 600 ㎕를 100 μl를), 각각의 튜브에 단백질 침전 용액 200 μl를 추가합니다.
  6. 샘플은 5 분 동안 얼음에 정착, 3 분 동안 11,000 XG에서 원심 분리 할 수​​ 있습니다.
  7. RT 이소프로판올 300 μl를 포함하는 깨끗한 1.5 ML 튜브에 뜨는을 전송합니다. 부드럽게 반전으로 섞는다.
  8. 원심 분리기 샘플은 2 분 동안 11,000 XG에서 조심스럽게 상층 액을 제거하고 종이 타월에 튜브를 배출.
  9. 각각의 튜브에 RT 70 % 에탄올 300 μl를 추가하고 부드럽게 펠렛을 씻어 반전.
  10. 주의 깊게 11,000 2 분 XG, 그리고 원심 분리기 샘플은 에탄올을 모두 제거합니다.
  11. 깨끗한 종이 타월에 튜브를 배출하고, 10 ~ 15 분간 자연 건조 펠렛을 할 수 있습니다.
  12. DNA의 수분 보충 용액 50 μl의 각 펠렛와 소용돌이에의 RNase 솔루션의 1.5 μl를 추가합니다.
  13. 5 초 동안 원심 분리기 샘플은 캡에서 모든 액체를 제거합니다.
  14. 15 분 동안 37 ° C에서 샘플을 인큐베이션.
  15. 1 시간 동안 65 ° C에서 샘플들을 배양하여 DNA를 재수.
  16. 260 nm에서 흡광도를 측정하여 DNA를 정량 분광 광도 (1.0 (260)는 판독 ~ 50 ㎍ / ml의 이중 가닥 DNA와 동등), 각각의 PCR 반응에서 200 ng를까지 사용한다.

7. RNA 분리에 대한효소-PCR 역.

  1. RNA 정제 키트 (재료의 표 참조)를 사용하여, minibeadbeater을 사용하여 효모 세포에서 RNA를 분리 제조업체의 지침을 따르십시오.
  2. 260 nm에서 흡광도를 측정하여 RNA의 농도를 정량화 (1.0의 260 독서에 해당 ml의 ~ 40 ㎍ / 단일 가닥 RNA를).
  3. RT-PCR 키트 (재료의 표 참조)를 사용하여, 약 1 μg의 RNA의와 RT-PCR 반응을 설정하는 제조업체의 지침을 따르십시오. 이 연구에서 얻은 결과는 표 1에 열거 된 프라이머를 사용한다.

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Representative Results

C.의 성공과 유전자 변형 콕 쿠스 네오 포르 만이 프로토콜 방식 (도 1)를 수행하여 얻을 수있다. DNA가 샷 (그림 2A)이 후과 유전자 변형으로, 코팅 된 골드 비즈의 성공적인 촬영은 접시에 보이는 골드 반지로 표시됩니다. 선택적 매체 상 YPD + 1M 소르비톨 플레이트로부터 세포를 회수 한 후 도금을 실온에서 방치 할 때 콜로니 4-5일 내에 표시한다. DNA의 2 μg의 변형은 20 ~ 30 식민지 (그림 2B)에서 발생한다. 식민지가 나타날 때, 그들은 개별 식민지에 대한 선택 배지에 restreaked해야합니다.

개별 콜로니를 YPD 배지에서 성장 될 수 있고, DNA 및 RNA 모두 적절한 통합 및 발현을 확인 PCR 및 RT-PCR을 통해 이러한 세포로부터 단리하고 분석 할 수있다. 이 프로토콜이 태그 유전자 융합에 사용되는 경우,이 예에서와 같이, 프라이머는 t를 필요이자 (프라이머 2)의 유전자의 코딩 영역 내의 관심 (프라이머 4) (도 3A)의 유전자의 3 '비 암호화 영역 내의 O 어닐. 이 구조로, PCR 반응에서 증폭 된 DNA는 mCherry 태그 ACK 유전자와 프레임에서 융합 된 다른 서열 확인 하였다. PCR 포지티브 확인은 야생형 세포로부터 단리 DNA에 비해 형질 전환 세포로부터 단리 DNA로부터 PCR 생성물 큰 것이다. 또 다른 PCR 반응은 또한 표에 원하는 궤적 (프라이머 7에 정확한 재결합을 확인하는 프라이머 세트 (프라이머 2, 5) 하나의 프라이머는 구조체의 외부 및 주변 유전체 (프라이머 5) 내에서 어닐링 이용하는 실시 될 필요 1) (그림 3B). RT-PCR은 관심의 유전자와 태그 모두 모두 (그림 3C)로 표현되고 있음을 확인하는 데 사용됩니다. RT-PCR 융합 제품 개별 주문의 시퀀싱태그가 제대로 RNA 수준에서 유전자에 융합되어있는 Cates.

이 프로토콜은 관심 유전자를 녹아웃하기 위해 이용되는 경우, PCR 용 프라이머 세트는 하나의 프라이머는 구조체가 게놈 내로 재결합해야하는 위치의 외측에 게놈 서열에 어닐링하도록 설계하고, 다른 프라이머 어닐링하거나 코딩 영역에 있어야 유전자의 또는 선택 마커에. 구조가 성공적으로 올바르게 게놈에 재결합 한 양의 확인은 자 내에 있지만 관심의 유전자 어닐링하는 프라이머 세트로 어닐링하는 프라이머 세트에 대한 올바른 크기의 제품의 존재 일 것이다. 또, 프라이머 세트는 재조합 이벤트가 발생한 정확한 궤적 상에 확인하는 PCR로 사용되는 설계 구조, 외부 프라이머 어닐링 하나를 갖도록해야한다. 녹아웃을 만드는 동일한 디자인으로, RNA는 형질 전환 된 세포와 야생형 (WT) 세포 모두에서 고립되고, RT-PCR이다 관심있는 유전자의 어떤 표현 형질 전환 된 세포에서 관찰되지 않았 음을 확인하기 위해 수행.

형광 태그가 ACK 유전자 융합 되었기 때문에, 재결합은 다른 확인 원하는 궤적에 성공했고 그 RNA는 형광 현미경을 통해 (그림 4)는 단백질로 번역되고 있음. 그것이 관심있는 단백질이 발현되는 것으로 알려져있다 곳에 이상적 조건은 이미 설립되어있다. 형광 신호가 관찰 너무 낮은 경우에는,이 가능성이 성공적인 재조합은 여전히​​ 발생한다는이지만 성장 조건은 낮은 형광 이어질 것이다 최적 조건이 충분 식 충족되지 않았다고 기회에서 변경 될 필요 신호. 이것은 서양 얼룩 같은 다른 방법을 통해 확인 될 필요가있을 것이다.

"/>
1. 프로토콜 방식을 그림.

그림 2
도 2A. DNA 코팅 골드 비드 성공적 YPD + 1M 소르비톨 플레이트 상 샷. YPD + 1M 소르비톨 플레이트의 중심에서 본 오렌지 패치 DNA 코팅 골드 비드에 의한 적절한 골드 준비를 나타내는뿐만 성공적인 쏠로 . 그림 2B. 접시 당 20-30 식민지에서 DNA 결과 2 μg의 변형. 프로토콜에서 언급 한 바와 같이 세포가 희석 된 경우, 약 20 ~ 30 식민지가 선택 배지에 도금하기 전에 예상된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3A. mCherry : ACK의 개략도.. 네오 구조 및 프라이머 디자인은 그림 3B PCR 성공 상동 재조합을 확인하는 데 사용됩니다. 레인 1 및 2 : PCR 제품은 야생형 C.로부터 게놈 DNA와 프라이머 2, 5 (표 1)에 의해 구해 콕 쿠스 네오 포르 만 스의 H99 (레인 1) 및 ACK : mCherry 형질 전환 균주, (레인 2). 예상 크기는 각각 1511 및 5622 BP이다. 레인 3 및 4의 DNA C. 제품 아르 H99 콕 쿠스 네오 포르 만 스 (예상 크기 BP 1443)과 ACK : 각각 mCherry (예상 크기 5552 BP) 균주, 1. 레인 5 및 6은 C. DNA의 제품이다 표 2 및 4의 프라이머를 사용하여 콕 쿠스 네오 포르 만의 H99 (어닐링 안) 및 ACK : mCherry (예상 크기 3016 BP) 균주 각각 프라이머 1 mCherry 태그의 발현 3. 그림 3C RT-PCR 확인을 사용하여.. 상위 차선 C.에서 증폭 된 ACKmCherry 융합 제품 (예상 크기 683 BP를)의 cDNA의 제품입니다 콕 쿠스 네오 포르 만H99 및 ACK :. 표 1 프라이머 2 및 3을 사용 mCherry 균주 액틴 유전자를 대조군으로서 포함하고, ACKmCherry (예상 크기 567 BP)를 사용하여 프라이머 6 및 표 1의 (7)과 동일한 조건으로 증폭 하였다. 링크를 클릭 여기에이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

그림 4
mCherry 그림 4. 형광 긍정 응답 태그. 587 nm에서 여기 최적의 및 610 nm에서 방출 최적으로 mCherry 태그에 융합 된 승인을 생산하는 균주의 현미경 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

(1) 케이I003 5 '- GTA GCG AGG TCT GGA AGC CAC - 3'
이 ACKmChRT-F 5' GCT TTG GCC GGT ACT ACC의 AAC -3
3 ACKmChRT-R GAC AGC TTC AAG의 TAG TCG GGG를 5' -3 '
4 KI004 5 '- GAC TTG GGG AAG AGG AAT TC - 3'
(5) KI0032 5 '- CGG GGT ACC ATC AAT AAA AGC TTT CTT CAC TCC - 3'
(6) 굴지 1 5'-CGC TAT CCT CCG TAT CGA TCT TGC -3 '
7 굴지 2 5' CAG CTG GAA GGT AGA CAA AGA GGC -3 '

표 1. PCR 및 RT-PCR 프라이머.

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Acknowledgments

이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation 상 # 0920274)와 사우스 캐롤라이나 실험 역 프로젝트 SC-1700340에서 수상에 의해 지원되었다. 클렘 슨 대학 시험장이 종이 isTechnical 공헌 호 6283. 저자는 마지막 프로토콜과 원고의 비판적 읽기 박사 셰릴 잉그램 스미스, 케이티 글렌, 그레이스 Kisirkoi의 개발에 그의 도움이 조언 박사 루카스 Kozubowski 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.6 μm gold beads Bio-Rad 165-2262 http://www.bio-rad.com
Spermadine-free base Sigma- Aldrich S0266 https://www.sigmaaldrich.com
G418 - Sulfate (Neomycin) Gold Biotechnology G-418-10 www.goldbio.com
Hygromycin Gold Biotechnology H-270-1 www.goldbio.com
1350 psi Rupture Discs Bio-Rad 165-2330 http://www.bio-rad.com
Stopping Screens Bio-Rad 165-2336 http://www.bio-rad.com
Macrocarriers discs Bio-Rad 165-2335 http://www.bio-rad.com
YPD Broth Becton Dickinson & Co. 242820 www.bd.com
Agar Becton Dickinson & Co. 214530 www.bd.com
Sorbitol Fisher Scientific BP439 http://www.fishersci.com
PDS-1000/He System Bio-Rad 165-2257 http://www.bio-rad.com
Microscope Zeiss Axio http://www.zeiss.com/microscopy
KOD One Step PCR Kit EMD Millipore 71086-4 http://www.emdmillipore.com
One Step RT-PCR Kit Qiagen 210212 www.qiagen.com
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1120 www.promega.com
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 www.qiagen.com
Mini Beadbeater - 1 BioSpecs 3110BX http://www.biospec.com
Microfuge 18 Centrifuge Beckman Coulter F241.5P www.beckmancoulter.com
Microplate Spectrophotometer BioTek EPOCH www.biotek.com

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References

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Taylor, T., Bose, I., Luckie, T., Smith, K. Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans. J. Vis. Exp. (97), e52666, doi:10.3791/52666 (2015).

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