Summary
Biyolistik dönüşüm homolog yeniden bağlama aracılığıyla fırsatçı patojen Cryptococcus neoformans genomuna DNA'nın kararlı bütünleşmesinin oluşturmak için kullanılan bir yöntemdir. Biz C.neoformans içine floresan etiket mCherry kaynaşmış kodlayan gen asetat kinaz olan bir yapı, biolistik dönüşümü gösterecektir.
Abstract
basidiyomiset Cryptococcus neoformans, merkezi sinir sisteminin bir invaziv fırsatçı patojen, dünya çapında, dünya çapında yılda fazla 625.000 ölümle sonuçlanan mantar menenjitin en sık nedenidir. Elektroporasyon Cryptococcus plasmidlerin dönüştürülmesi için geliştirilmiş olmasına rağmen, sadece biyolistik homolog rekombinasyon ile genomun içine entegre edilebilir lineer DNA dönüşümü için etkili bir araç sağlar.
Asetat HIV enfeksiyonu sırasında büyük bir fermentasyon ürünü olduğu gösterilmiştir, ancak bu önemi henüz bilinmemektedir. Enzimler ksiluloz-5-fosfat / fruktoz-6-fosfat fosfoketolaz (Xfp) ve asetat kinaz (ACK) oluşan bir bakteriyel yol C'de asetat üretimi için üç potansiyel geçiş yollarından biri olup neoformans. Burada, bir yapının Biyolistik dönüşüm gösterir,Ack kodlayan gen, MCherry floresan etiketi kaynaşmış C geri olan neoformans. Daha sonra ACK mahaline içine ACK -mCherry füzyon entegrasyonu onaylayın.
Protocol
NOT: Bu protokolün genel şeması Şekil 1'de özetlenmiştir.
1. C. neoformans Hazırlık
- Her bir dönüşüm reaksiyonu için, C 2-3 mi O / N kültürünün yetiştirilmesi 30 ° C'de YPD besiyeri içinde neoformans 250 rpm 'de çalkalanarak.
- 10 ° C'de 900 x g'de 5 dakika boyunca O / N kültürü santrifüj ve süpernatant atılır.
- Maya Peptonlu Dekstroz (YPD) orta 300 ul her hücre pelletini.
- Cam boncuklar kullanılarak, yavaşça 1 M sorbitol içeren YPD agar üzerine yıkandı hücre süspansiyonu 300 ul yayıldı.
- Plakalar 3-4 saat için çevre sıcaklığında kurumaya bırakın.
2. altın mikro taşıyıcı preparatı
- GKD 2 O, 1 ml 0.6 um altın parçacıkları, 0.25 g yeniden süspanse 900 xg'de 1 dakika boyunca santrifüj boncuk pelet ve süpernatan.
- % 100 etanol içinde 1 ml altın boncuk tekrar. </ Li>
- 4 tüpler, her ul 250 içine boncuk dağıtın ve% 100 etanol 750 ul ekleyin.
- 4 ° C'de saklayın altın boncuk tümbölenleri.
3. DNA hazırlanması
- % 100 etanol kullanılarak forseps onları daldırarak turuncu macrocarrier biolistik diskleri hazırlayın. Kuruması için Drierite içeren geniş bir petri içine yerleştirin diskler (DRIERIT diskleri temas etmediğinden emin olun).
- Kuruduktan sonra, (daha önce% 100 etanol ile sildi) gümüş disk sahipleri içine macrocarrier diskleri basın.
- Dönüşüm başına yaklaşık 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü, bir tüp içine (aşama 2'de tarif edildiği gibi hazırlanır) Burulma altın boncuklar ve kısım 12 ul.
- Için her bir tüpe ekleyin: 2 DNA'sının ug (tercihen 1 ug DNA / ml 2 ul), 10 ul 2.5 M CaCI2 ve 2 ul 1 M spermidin serbest baz.
- Adım 3.4 olarak ama hiçbir DNA ile bir negatif kontrol kurmak.
- Vorteks her boru ve çevre sıcaklığında inkübe5 dak. Yavaşça bu inkübasyon sırasında yerleşmiş boncuk tekrar süspansiyon bazen her tüp fiske.
- 30 saniye için 225 x g'de santrifüj tüpleri DNA-kaplı altın boncukların topaklanması için. Dikkatle (pipetle veya aspirasyon ile) süpernatant kaldırmak ve atın.
- Yavaş yavaş yukarı ve aşağı pipetleme tamamen% 100 etanol 600 ul süspanse boncuk.
- Ambalaj olmadan boncuk pelet 30 saniye için 225 xg'de tüpler Spin. Dikkatle çıkarın ve süpernatant atın.
- Yavaş bir şekilde pipetli yukan aşağı% 100 etanol içinde 8 ul DNA ile kaplanmış altın boncukları yeniden süspanse edin.
- 1 cm çapında biolistik diskin merkezi üzerine DNA kaplı altın boncuk Pipet ve kurumasını bekleyin.
Not: Biyolistik diskin merkezinden görünür bir kuru, altın daire altın parçacıkları yeterli bir konsantrasyon olduğunu gösterir.
Not: DNA-kaplı altın parçacıkları ile yüklenen makro-taşıyıcı disklerin hemen gen tabancası ile kullanım için hazırdır.
4. ÇGen Tabancası perating
- Vakum pompası açın.
- Yaklaşık 2.200 psi basınç kadar saat yönünün düğmeyi çevirerek helyum gazı açın manometre ulaşılır.
- Soldaki kırmızı anahtarı çevirerek gen tabancası açın.
- Vakum 15 saniye içinde 28 inç Hg ulaşacak, böylece vakum ve havalandırma için debileri ayarlanmış olduğundan emin olun.
- Kopma diski ve makrotaşıyıcı arasındaki mesafe yaklaşık 3/8 inç olduğundan emin olun.
- Etanol ile silerek tüm odasını temizleyin.
- % 100 etanol içinde kopma diskleri Batmak. Steril bir yüzey üzerinde kurumaya bırakın (örneğin, Petri kabı).
- Rüptür disk yuvasını gevşetmek için bir tork anahtarı kullanın. Tutucu içine temiz bir kopma diski takın. Geri yerine kopma disk tutucu vida ve sağa kez çevirerek tork anahtarı ile sıkın.
NOT: Kesilme diskleri her sürgün aşağıdaki değiştirilecektir. - Th Batmak% 100 etanol içinde E örgü ekranları. Steril bir yüzey üzerinde kurumaya bırakın (örneğin, Petri kabı).
- Kuruduktan sonra, beyaz plastik montaj plakası üzerinde bir yıkanmış elek yerleştirin. Disk odasına aşağı macrocarrier disk tutucu DNA tarafı yerleştirin. Gümüş kapağı vidalayın ve yüksek yuvasına montaj plakasını yerleştirin.
NOT: örgü ekranı her çekimlerden sonra değiştirilecektir. - Alt plaka üzerinde 1 M sorbitol içeren bir YPD agar plaka koyun.
- Kamara kapıyı kapattı ve yerine kilitleyin.
- Itin ve vakum meşgul ve vakum 28 inç Hg ulaşmak için izin orta kırmızı anahtarını tutun. Uygun vakum seviyesi ulaşıldığında, aşağı pozisyona getiriniz. Hazır olduğunuzda, yangın sağdaki kırmızı düğmeyi basılı tutun. Rüptür disk attığında, hemen yangın düğmesini bırakın ve 0 psi odasına havalandırma için orta pozisyona orta kırmızı anahtarı itin.
- Rüptür disk enkaz temizleyin ve gen silahı kapatın. Sonra heliu kapatmakdüğmeyi saat yönünde çevirerek, ve nihayet, vakum pompası kapatmak tarafından m gazı.
5. Kaplama Dönüştürülmüş hücreler
- Dönüşüm plakalar hücre kurtarmak için izin vermek için, 4 saat boyunca oda sıcaklığında bekletin.
- Plaka üzerine YPD Pipet 700 ul. Yavaşça bir steril 1.5 ml mikrofuge'de tüp içine agar ve pipet sıvı kapalı hücreleri kazımak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Tüm hücreleri plaka elde edilmiştir sağlamak için bu adımı tekrarlayın.
- 30 saniye için 225 x g'de topak hücrelere. Süpernatantı çıkarın ve atın.
- YPD 500 ul pelletini.
- Pipet 100 YPD + antibiyotik plakalar merkezi üzerine hücre süspansiyonu ul ve cam boncuklar kullanarak yayılır.
- 3-4 gün boyunca oda sıcaklığında ters plakaları bırakın. Koloniler görünür gibi, yeni YDP + antibiyotik plakalar üzerine yama.
PCR için 6. genomik DNA izolasyonu
NOT: Bu reaktif kullanılarak modifiye edilmiş bir versiyonudurDNA saflaştırma kiti s (Malzeme Tablo bakınız).
- C her biri 5 ml'lik bir kültür büyütün 30 ° C'de YPD sıvı içinde neoformans transformantlar 250 rpm'de göre O / N çalkalanarak.
- 900 x g'de hücrelerin 3 ml Pelet, ve çekirdekler lizis çözeltisinin 600 ul süspansiyon haline getirin.
- 0,5 mm asit 200 ul yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne süspansiyonu ekleyin cam boncuk yıkanmıştır.
- Buz üzerinde ortam sıcaklığında, serin tüp mini beadbeater 45 sn için homojenize ve tekrarlayın.
- Örnek 2 dakika süreyle buz üzerine yerleşebilecek ve yeni bir 1.5 ml'lik tübe süpernatan aktarmak için izin verir. 20 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde ve vorteks (süpernatan geri kazanılmış her 600 ul için 100 ul), her bir tüpe, protein çökeltme çözeltisinin 200 ul ekle.
- Numuneler, 5 dakika için buz üzerine yerleşmek ve 3 dakika süre ile 11,000 x g'de santrifüj izin verin.
- RT izopropanol 300 ul içeren bir temiz 1,5 ml tüp süpernatant aktarın. Yavaşça tersine çevirerek karıştırın.
- Santrifüj örnekleri 2 dakika boyunca 11.000 xg'de, dikkatle süpernatant kaldırmak ve kağıt havlu üzerine tüpleri boşaltın.
- Her bir tüp, RT% 70 etanol içinde 300 ul ekleyin ve yavaşça pelet yıkama için ters.
- Dikkatle 11,000 2 dakika xg, ve Santrifüj örnekleri etanol kaldırmak.
- Temiz bir kağıt havlu üzerine tüp boşaltın ve 10-15 dakika boyunca kuru hava pelet izin.
- DNA rehidrasyon solüsyonu 50 ul, her topak ve vorteks RNaz çözeltisi 1.5 ul ekleyin.
- 5 saniye boyunca santrifüj örnekleri kapağından sıvı kaldırmak için.
- 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- 1 saat boyunca 65 ° C'de örneklerin inkübe etmek suretiyle DNA rehidrate.
- 260 nm'de absorbans spektrofotometrik olarak ölçülmesiyle DNA niceliğini (1.0 A 260 okuma ~ 50 ug / ml, çift dallı DNA eşdeğerdir) ve her PCR reaksiyonunda 200 ng kadar kullanılabilir.
7. RNA İzolasyon içinTranscriptase-PCR Ters.
- Bir RNA arıtma kiti (Malzeme Tablo bakınız) kullanarak, bir minibeadbeater kullanarak maya hücrelerinden RNA izole etmek için üreticinin talimatlarını izleyin.
- 260 nm'de absorbans ölçülerek RNA konsantrasyonunu belirlemek (1.0 A 260 okuma eşdeğerdir mi ~ 40 ug / tek sarmallı RNA).
- RT-PCR kiti (Malzeme Tablo bakınız) kullanarak, yaklaşık 1 ug RNA RT-PCR reaksiyonları kurmak için üreticinin talimatlarını izleyin. Bu çalışmada elde edilen sonuçlar için Tablo 1 'de listelenen primerleri kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C başarılı bir biolistik transformasyon neoformans bu protokol şeması (Şekil 1) takip edilerek elde edilebilir. DNA, püskürtmenin (Şekil 2A) sonra biyolistik dönüşüm ile kaplanmış altın parçacıkları başarılı bir filiz plaka üzerinde görünür bir altın ile gösterilir. Seçici ortama YPD + 1M sorbitol plakaları kurtarıldı hücreleri kaplama sonra oda sıcaklığında sol Koloniler 4 ila 5 gün içinde görünmelidir. DNA 2 ug Dönüşümü 20-30 koloniler (Şekil 2B) ile sonuçlanmalıdır. Koloniler görünür, bunlar tek tek koloniler için seçici ortam üzerinde tekrar edilmelidir.
bireysel koloniler YPD ortamında yetiştirilebilir, ve DNA ve RNA hem de uygun bir şekilde entegre ve ifadesini teyit etmek üzere PCR ve RT-PCR ile, bu hücrelerden izole edilebilir ve analiz edilebilir. Bu protokol, etiketli gen füzyonu için kullanılıyorsa, bu örnekte olduğu gibi, primerler t gerekirİlgi alanına (astar 2) geninin kodlama bölümü içindeki ve ilgi (primer 4) (Şekil 3A) ve genin 3 'kodlama yapmayan bölge içinde o tavlama. Bu yapıda, PCR reaksiyonundan elde büyütülmüş DNA MCherry etiket ACK genine çerçeve içinde kaynaşmış olan bir başka onay için dizilenmiştir. Bir PCR pozitifliği onay vahşi tip hücrelerinden izole DNA göre dönüştürülmüş hücrelerden izole edilen DNA'dan daha büyük bir PCR ürünü olacaktır. Bir başka PCR reaksiyonu, aynı zamanda Tablo l'de arzu edilen mahaline (primer 7 içine doğru rekombinasyona teyit etmek için primer seti (primerler 2 ve 5) bir primer yapısının dışında ve çevresindeki genom (primer 5) içinde tavlanır kullanılarak yapılan gerekecektir 1) (Şekil 3B). RT-PCR, ilgi konusu genin ve etiket de hem (Şekil 3C) olarak ifade edilmektedir olduğundan emin olmak için kullanılır. RT-PCR, füzyon ürünü indi dizilenmesietiketin doğru RNA seviyesinde genine kaynaşmış uygulandığını gösterir.
Bu protokol, ilgili genin nakavt kullanılırsa, PCR için primer kümeleri bir primer yapısı genomuna rekombine nerede dışında genom sekansına tavlanan şekilde tasarlanmıştır ve diğer primer ile sertleşen ya da kodlama bölgesi içinde olmalıdır genin ya da seçici marker. Yapı başarılı ve doğru bir genom birleştirilemeyeceğini olan bir pozitif onay işaretleyici içinde değil ilgi gen tavlanan astar seti ile yumuşayan astar kümesi için doğru boyutta ürünün varlığı olacaktır. Başka bir primer seti rekombinasyon olayı doğru lokusta meydana geldiğini teyit etmek için PCR kullanılır tasarlanmış yapının, dış tavlanan bir primer olduğu yapılmalıdır. Bir nakavt oluşturmak için aynı tasarımda, RNA, dönüştürülmüş hücreler ve vahşi tip (WT) hücreleri hem de izole edilir ve RT-PCR ile olduğu İlgi konusu genin ekspresyonu dönüştürülmüş hücrelerden görülmektedir onaylamak için gerçekleştirildi.
Bir floresan etiket ACK genine kaynaşmış Çünkü, rekombinasyon başka bir onay istenen lokus içine bir başarı olduğunu ve bu RNA floresan mikroskobu ile (Şekil 4) proteine çevrilir ediliyor. İlgilenilen proteinin ifade ediliyor olduğu bilinmektedir İdeali, koşullar zaten kurulmuştur. Floresan sinyal gözlemlemek çok düşük Ancak, orada bir olasılık başarılı rekombinasyon hala meydana geldiğini, ancak büyüme koşulları, düşük floresan yol açacak optimum koşullar yeterli ifadesi için bir araya geldi edilmemiş olması tesadüf, değiştirilemez gerekir sinyali. Bu durum, bir Batı lekesi gibi diğer yöntemlerle teyit edilmesi gerekir.
"/>
1. Protokol düzeni Şekil.
Şekil 2A. DNA-kaplı altın parçacıkları başarılı YPD + 1M sorbitol plaka üzerine çekilmiş. YPD + 1M sorbitol plakasının merkezinde görülen turuncu bir yama DNA-kaplı altın parçacıkları nedeniyle, uygun altın hazırlanmasını gösteren, hem de başarılı bir çekim olarak . Şekil 2B. plaka başına 20-30 koloniler DNA sonuçları 2 ug Dönüşümü. Protokolde belirtildiği gibi hücreler seyreltilmiş olsaydı, yaklaşık 20-30 koloniler seçici ortama kaplama öncesinde bekleniyor. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3A. MCherry: ACK şematik.. Neo yapı ve astar tasarım Şekil 3B PCR başarılı homolog rekombinasyon onaylamak için kullanılır. Kuşak 1 ve 2: PCR ürünleri, vahşi tip C genomik DNA ile primerler 2 ve 5 (Tablo 1) kullanılarak elde edilen neoformans H99 (hat 1) ve ACK: MCherry transforme suş (şerit 2). Beklenen boyutları sırasıyla, 1511 ve 5622 bp. 3 ve 4 çizgileri C DNA ürünleridir neoformans H99 (beklenen büyüklüğü 1443 bp) ve ACK: sırasıyla MCherry (beklenen büyüklüğü 5552 bp) suşları, 1. Geçitler 5 ve 6 ° C arasında, DNA ürünleri Tablo primerler 2 ve 4 kullanılarak neoformans H99 (tavlanması olmamalıdır) ve ACK: MCherry (beklenen büyüklüğü 3016 bp) suşları, sırası ile, astar 1 ve MCherry etiketinin ifade 3. Şekil 3C, RT-PCR ile teyit kullanılmıştır.. Üst şerit C amplifiye ACKmCherry füzyon ürününün (beklenen boyutu 683 bp) cDNA ürünleri neoformansH99 ve ACK:. Tablo 1 'de primerler 2 ve 3 ile MCherry suşları aktin geni, bir kontrol olarak dahil edildi ve ACKmCherry (beklenen boyutu 567 bp), primerler kullanılarak 6 ve Tablo 1' de 7 ile aynı koşullar altında amplifiye edildi. tıklayın Burada bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.
MCherry Şekil 4. Floresan Ack etiketledi. 587 nm bir uyarım optimum ve 610 nm emisyon optimum bir MCherry etiketi kaynaşmış Ack üreten suşlar mikroskobik analizi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| 1 | KI003 | 5 '- GTA GCG AGG TCT GGA AGC CAC - 3' |
| 2 | ACKmChRT-F | 5'GTT TTG GCC GGT ACT ACC AAC -3 |
| 3 | ACKmChRT-R, | GAC AGC TTG AAG TAG TCG GGG 5'-3 ' |
| 4 | KI004 | 5 '- GAC TTG GGG AAG AGG AAT TC - 3' |
| 5 | KI0032 | 5 '- CGG GGT ACC ATC AAT AAA AGC TTT CTT CAC TCC - 3' |
| 6 | Actin 1 | 5'CGC TAT SKK CCG TAT CGA TCT TGC -3 ' |
| 7 | Aktin 2 | 5'CAG CTG GAA GGT AGA CAA AGA GGC -3 ' |
Tablo 1. PCR ve RT-PCR primerlerini gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (Ödül # 0.920.274) ve Güney Carolina Deney İstasyonu Projesi SC-1.700.340 dan ödülle tarafından desteklenmiştir. Clemson Üniversitesi Deney Station Bu kağıt isTechnical Katkı sayılı 6283. Yazarlar bu son protokol ve yazının eleştirel okuma Dr Cheryl Ingram-Smith, Katie Glenn, Grace Kisirkoi gelişiminde onun yararlı tavsiyeler Dr. Lukasz Kozubowski teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 μm gold beads | Bio-Rad | 165-2262 | http://www.bio-rad.com |
| Spermadine-free base | Sigma- Aldrich | S0266 | https://www.sigmaaldrich.com |
| G418 - Sulfate (Neomycin) | Gold Biotechnology | G-418-10 | www.goldbio.com |
| Hygromycin | Gold Biotechnology | H-270-1 | www.goldbio.com |
| 1350 psi Rupture Discs | Bio-Rad | 165-2330 | http://www.bio-rad.com |
| Stopping Screens | Bio-Rad | 165-2336 | http://www.bio-rad.com |
| Macrocarriers discs | Bio-Rad | 165-2335 | http://www.bio-rad.com |
| YPD Broth | Becton Dickinson & Co. | 242820 | www.bd.com |
| Agar | Becton Dickinson & Co. | 214530 | www.bd.com |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | http://www.fishersci.com |
| PDS-1000/He System | Bio-Rad | 165-2257 | http://www.bio-rad.com |
| Microscope | Zeiss | Axio | http://www.zeiss.com/microscopy |
| KOD One Step PCR Kit | EMD Millipore | 71086-4 | http://www.emdmillipore.com |
| One Step RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | www.qiagen.com |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | www.promega.com |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | www.qiagen.com |
| Mini Beadbeater - 1 | BioSpecs | 3110BX | http://www.biospec.com |
| Microfuge 18 Centrifuge | Beckman Coulter | F241.5P | www.beckmancoulter.com |
| Microplate Spectrophotometer | BioTek | EPOCH | www.biotek.com |
References
- Price, M. S., et al. Cryptococcusneoformans requires a functional glycolytic pathway for disease but not persistence in the host. MBio. 2, e00103-e00111 (2011).
- Bubb, W. A., et al. Heteronuclear NMR studies of metabolites produced by Cryptococcusneoformans in culture media: identification of possible virulence factors. Magn Reson Med. 42, 442-453 (1999).
- Himmelreich, U., et al. Identification of metabolites of importance in the pathogenesis of pulmonary cryptococcoma using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Microbes Infect. 5, 285-290 (2003).
- Wright, L., et al. Metabolites released by Cryptococcusneoformans var. neoformans and var. gattii differentially affect human neutrophil function. Microbes Infect. 4, 1427-1438 (2002).
- Hu, G., Cheng, P. Y., Sham, A., Perfect, J. R., Kronstad, J. W. Metabolic adaptation in Cryptococcusneoformans during early murine pulmonary infection. Mol Microbiol. 69, 1456-1475 (2008).
- Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. Acetate kinase: not just a bacterial enzyme. Trends Microbiol. 14, 249-253 (2006).
- Davidson, R. C., et al. Gene disruption by biolistic transformation in serotype D strains of Cryptococcus neoformans. Fungal Genet Biol: FG & B. 29, 38-48 (2000).
- Toffaletti, D. L., Rude, T. H., Johnston, S. A., Durack, D. T., Perfect, J. R. Gene transfer in Cryptococcusneoformans by use of biolistic delivery of DNA. J. Bacteriol. 175, 1405-1411 (1993).
- Edman, J. C., Kwon-Chung, K. J. Isolation of the URA5 gene from Cryptococcusneoformans var. neoformans and its use as a selective marker for transformation. Mol Cell Biol. 10, 4538-4544 (1990).
- Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J. Complementation of a capsule-deficient mutation of Cryptococcus neoformans restores its virulence. Mol Cell Biol. 14, 4912-4919 (1994).
- Del Poeta, M., et al. Topoisomerase I is essential in Cryptococcusneoformans: role In pathobiology and as an antifungal target. Genetics. 152, 167-178 (1999).
- McClelland, C. M., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J. High frequency transformation of Cryptococcusneoformans and Cryptococcusgattii by Agrobacteriumtumefaciens. Fungal Genet Biol:FG & B. 42, 904-913 (2005).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor 'DiOlistic' labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Nicola, A. M., Frases, S., Casadevall, A. Lipophilic dye staining of Cryptococcusneoformans extracellular vesicles and capsule. Eukaryot Cell. 8, 1373-1380 (2009).
