Abstract
स्वस्थ ऊतकों, कई रक्त और ठोस कैंसर के लिए इसी प्रकार अब और अधिक विभेदित संतान को जन्म दे रही है, जबकि स्वयं को नवीनीकृत कि स्टेम तरह के कैंसर की कोशिकाओं का एक सबसेट के साथ, पदानुक्रम का आयोजन किया जा लगा रहे हैं। समझ और बढ़ाया chemo- और गैर स्टेम ट्यूमर थोक की तुलना में रेडियो-प्रतिरोध के अधिकारी हो सकता है, जो स्तन कैंसर में इन कैंसर स्टेम कोशिकाओं को निशाना, एक महत्वपूर्ण अनुसंधान के क्षेत्र बन गया है। Mammosphere परख भी व्यापक रूप से पूर्वव्यापी sphere- की पहचान करने की क्षमता के लिए इस्तेमाल किया हो गया है: CD44, CD24, और ALDH गतिविधि सहित मार्करों भावी immunocompromised चूहों में प्रत्यारोपित बढ़ाया जब tumorigenicity प्रदर्शित कि कोशिकाओं को अलग करने के लिए छंटनी (FACS) प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है एकल स्टेम सेल की तरह क्लोन से विकसित कोशिकाओं है कि बनाने। यहाँ हम सेल लाइनों या प्राथमिक रोगी के नमूने, उनके passaging, और क्षेत्र च अनुमान लगाने के लिए गणना से mammospheres की उचित संवर्धन के लिए दृष्टिकोण की रूपरेखा तैयारorming दक्षता (SFE)। पहले हम उचित योजना और mammosphere प्रयोगों की व्याख्या में महत्वपूर्ण विचार और नुकसान पर चर्चा की।
Introduction
स्टेम तरह के कैंसर स्टेम कोशिकाओं की अध्यक्षता में ट्यूमर सेल प्रजातियों के अस्तित्व को बहुत ट्यूमर विविधता के बारे में हमारी समझ के लिए जोड़ा गया है। ट्यूमर में कुछ प्ररूपी विविधता आनुवंशिक रूप से अलग क्लोन के प्रतिरूप परिणाम से पैदा करता है, एक बड़ा घटक epigenetic मतभेद से परिणाम के लिए प्रकट होता है: कैंसर की कोशिकाओं को विशिष्ट जीन की सक्रियता या दमन के माध्यम से स्टेम, पूर्वज, और विभेदित राज्यों के बीच (reversibly कभी कभी) संक्रमण कर सकते अभिव्यक्ति कार्यक्रमों 1-3। यह वर्तमान में modulatory कारकों पहुंचाने कैंसर, स्ट्रोमल या प्रतिरक्षा कोशिकाओं पड़ोसी से पैराक्राइन संकेतन के साथ संयोजन के रूप में अपने परिणामी autocrine संकेतन के साथ एक सेल में व्यक्त की जा रही जीन अभिव्यक्ति कार्यक्रम को दर्शाती है, सेल आंतरिक या बाह्य कारकों को प्रतिबिंबित कर सकते हैं और इस तरह की डिग्री के रूप में microenviromental शर्तों हाइपोक्सिया 2,4,5।
अभिनव वंश अनुरेखण दृष्टिकोण यद्यपिउनके इन विवो आला 6 में ख्यात कैंसर स्टेम कोशिकाओं का अध्ययन करने की हमारी क्षमता आगे बढ़ रहे हैं - 8, क्षेत्र के गठन assays के कम से कम इस्तेमाल किया परख शर्तों के तहत, स्टेम कोशिकाओं की तरह व्यवहार करने के लिए स्तन कैंसर की कोशिकाओं को 'संभावित अनुमान लगाने के लिए एक लोकप्रिय और सुविधाजनक दृष्टिकोण रहते हैं। यह अक्सर करने के लिए और अधिक mesenchymal- और उपकला अनुरूप करने का प्रस्ताव किया गया है कि झिल्ली मार्कर CD44 और CD24 9, और एंजाइम ALDH (एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज) की गतिविधि का स्तर 10, मार्कर की उनकी अभिव्यक्ति के द्वारा, सफ़ाई कैंसर स्टेम कोशिकाओं के लिए पूर्वव्यापी के तरीकों के साथ प्रयोग किया जाता है की तरह कैंसर स्टेम कोशिकाओं को क्रमश: 11। क्षेत्र के गठन के दृष्टिकोण पहले उपकला वृद्धि कारक (EGF) 12 के अलावा के साथ गैर-पक्षपाती, सीरम मुक्त शर्तों में एकल क्लोन से ख्यात स्टेम कोशिकाओं के विकास को सक्षम करने, neurosphere परख के रूप में विकसित किया गया था, बाद में उपयोगी सामान्य और कैंसर के लिए लागू किया जा रहा है स्तन के ऊतकों।
हड्डी फाइड स्टेम सेल, विवो में सक्रियण एहसान होगा कि कारकों के सटीक संयोजन का अनुभव नहीं होगा, G0 चरण में आराम करने के लिए। mammosphere परख बजाय mitotic विभाजन के लिए तैयार हैं या पहले से ही 13 से विभाजित या तो कोशिकाओं के विकास को सक्षम बनाता है। ये पूर्वज, नहीं वास्तव में एक मौन सेल हालांकि, परख में इस्तेमाल EGF और बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF) mitogens साथ proliferates कि सेल मंच हो सकता है। फिर भी, वे सक्रिय स्टेम सेल जुड़े संकेतन की एक सीमा के 14 रास्ते होते हैं। इसके अलावा, उनके गठन की दर माउस xenografts 2,15,16 में सीमित कमजोर पड़ने assays में अपनी शक्ति द्वारा मापा वे जब से लिया गया ऊतक के tumorigenicity से संबंधित है </ Sup>।
यहाँ हम एकल कोशिकाओं को अलग और मानव स्तन कैंसर कोशिका लाइनों और स्तन ट्यूमर के नैदानिक नमूनों दोनों से प्राथमिक mammospheres उत्पन्न करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम यह भी आत्म नवीकरण का आकलन करने के लिए प्राथमिक mammospheres के धारावाहिक मार्ग प्रदर्शन करने के लिए कैसे, और क्षेत्र के विभिन्न बोने घनत्व भर तुलना (चित्रा 1 में योजना देखें) की अनुमति देता है कि दक्षता के गठन की गणना करने के लिए कैसे का वर्णन।
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Protocol
प्रक्रियाओं नीचे नैतिकता की दृष्टि से इंपीरियल कॉलेज, लंदन द्वारा अनुमोदित किया गया है।
मानव स्तन कैंसर कोशिका लाइनों से प्राथमिक Mammospheres 1. पीढ़ी
नोट: एक बाँझ संस्कृति हुड के अंतर्गत निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन।
- Mammosphere मीडिया 2 मिमी एल glutamine के साथ पूरक DMEM / F12, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 यू / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त तैयार करें। , 10 एनजी / एमएल पुनः संयोजक मानव बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF, आर एंड डी सिस्टम) और 1x B27 पूरक, 20 एनजी / एमएल पुनः संयोजक मानव epidermal वृद्धि कारक (सिग्मा EGF) जोड़कर उपयोग करने से पहले तुरंत पूरा मीडिया तैयार करें।
- (या अपनी पसंद का एक स्तन कैंसर कोशिका लाइन, 70-80% संगम) पक्षपाती MCF 7 या एमडीए MB-231 कोशिकाओं से युक्त कुप्पी से महाप्राण मीडिया, 1x पीबीएस में दो बार धोने, और कोशिकाओं trypsinize।
- 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 200 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं। Mammosphere मीडिया के 1-5 मिलीलीटर में छानना सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं। विंदुकएक 40 माइक्रोन सेल झरनी टोपी फिल्टर ऊपर और नीचे और आवश्यक का उपयोग करते हैं एकल कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए। एक एकल कक्ष निलंबन (यदि नहीं, तीन बार करने के लिए सेल निलंबन ऊपर सिरिंज के लिए एक 25 जी सुई का उपयोग करें) का गठन किया है सुनिश्चित करने के लिए एक hemocytometer का प्रयोग करें।
- FACS के माध्यम से आवश्यक अलग CD44 + CD24- सेलुलर सबसेट विरोधी CD24-phycoerythrin (पीई) और विरोधी CD44-fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 9 का उपयोग कर रहे हैं। वैकल्पिक रूप से, एक चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई विरोधी CD44 और निर्माता के निर्देशों के अनुसार विरोधी CD24 बायोटिन संयुक्त microbeads के साथ (एमएसीएस) प्रणाली का उपयोग करते हुए इस तरह की आबादी को अलग। एलडी स्तंभों का उपयोग रास स्तंभों का उपयोग सकारात्मक चयन, और नकारात्मक चयन प्रदर्शन और 17 प्रवाह cytometry द्वारा सभी अलग कक्षों के phenotypes की पुष्टि करें।
- Trypan नीले रंग का उपयोग कर मिलीलीटर प्रति व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की गणना।
नोट: सेल व्यवहार्यता hemocy पर ग्रिड के भीतर कोशिकाओं की कुल संख्या से विभाजित व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या के रूप में गणना की हैtometer। Trypan नीले हाथ में ले लिया है कि कोशिकाओं को गैर-व्यवहार्य माना जाता है। निम्नलिखित प्रक्रिया सही रूप से व्यवहार्य कोशिकाओं का अनुपात निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है।- पीबीएस में trypan नीले रंग की एक 0.4% समाधान तैयार है। कोशिकाओं के एक मिलीलीटर trypan नीले शेयर समाधान के 0.1 मिलीलीटर जोड़ें। एक hemocytometer लोड और कम बढ़ाई पर एक खुर्दबीन के नीचे तुरंत जांच करते हैं। कुल कोशिकाओं की संख्या और नीले रंग धुंधला कोशिकाओं की संख्या की गणना।
व्यवहार्य कोशिकाओं = [1.00 - (नीला कोशिकाओं की संख्या ÷ कुल कोशिकाओं की संख्या)] 100 ×। - संस्कृति के प्रति मिलीलीटर व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए, नीचे सूत्र का उपयोग करें। कमजोर पड़ने कारक के लिए सही करने के लिए याद रखें।
10 4 × 1.1 = कोशिकाओं / एमएल संस्कृति × व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या
- पीबीएस में trypan नीले रंग की एक 0.4% समाधान तैयार है। कोशिकाओं के एक मिलीलीटर trypan नीले शेयर समाधान के 0.1 मिलीलीटर जोड़ें। एक hemocytometer लोड और कम बढ़ाई पर एक खुर्दबीन के नीचे तुरंत जांच करते हैं। कुल कोशिकाओं की संख्या और नीले रंग धुंधला कोशिकाओं की संख्या की गणना।
- 6 अच्छी तरह से अल्ट्रा कम पक्षपाती थाली के प्रत्येक कुएं में पूरा mammosphere मीडिया के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं के एक पूर्व निर्धारित राशि Resuspend। बोने घनत्व सामान्य रूप से 500-4,000 कोशिकाओं / सेमी प्रति अच्छी तरह से दो सेल है। वैकल्पिक रूप से उपयोग लोडब्ल्यू लगाव 24 अच्छी तरह प्लेटें मीडिया के 0.5 मिलीलीटर में एक ही घनत्व में कोशिकाओं बोने है।
नोट: हम ब्याज की प्रत्येक कोशिका लाइनों के लिए बोने घनत्व और संस्कृति के समय के अनुकूलन सलाह देते हैं। - विशेष रूप से पहले 5 दिनों के विकास के चरण के दौरान, प्लेटें परेशान बिना (सेल लाइन और mammospheres के आकार पर निर्भर करता है) 5-10 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में अल्ट्रा कम लगाव 6 अच्छी तरह प्लेटें सेते ।
मानव स्तन कैंसर नैदानिक नमूनों से प्राथमिक Mammospheres 2. जनरेशन
नोट: मानव स्तन कैंसर के ऊतकों स्तन ट्यूमर को हटाने के लिए सर्जरी के दौर से गुजर रोगियों से प्राप्त किया जा सकता है। 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 यू / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त संस्कृति मीडिया में 50 मिलीलीटर बाँझ ट्यूबों में अप करने के लिए 24 घंटे के लिए बर्फ पर स्टोर ऊतक। एक बाँझ संस्कृति हुड के अंतर्गत निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन।
- मीडिया की एक छोटी मात्रा के साथ एक 100 मिमी ऊतक पेट्री डिश में नमूना स्थानांतरण। Removबाँझ कैंची, scapel और चिमटी का उपयोग कर ई वसा ऊतकों।
- DMEM / F12 के 2-3 मिलीलीटर जोड़ें और कोई बड़े टुकड़े रहते हैं जब तक एक बाँझ scapel या धार के साथ एक 3 मिमी टुकड़ों में नमूना कीमा।
- में ऊतक टुकड़े Resuspend एंजाइमों (3000 यू / एमएल collagenase और 1000 यू / मिलीलीटर hyaluronidase) युक्त 10 मिलीलीटर DMEM पूर्व गर्म और सभी ऊतक टुकड़े पचा रहे हैं जब तक एक रोटरी प्रकार के बरतन में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। आम तौर पर पूरी तरह से पाचन 1-3 घंटा से लेता है। ट्यूमर के रोग पात्रों के अनुसार पाचन समय समायोजित करें। (उदाहरण के लिए स्तन ग्रंथिकर्कटता अधिक नाजुक है और कम पाचन समय की जरूरत है जो mucinous कार्सिनोमा की तुलना में पचाने के लिए आमतौर पर कठिन है)। Hemocytometer के तहत 20 μl निलंबन देख द्वारा पाचन हर आधा घंटे की डिग्री का आकलन।
- टुकड़े, फिर 5 मिनट के लिए तलछट कक्ष मंदिर में 10 मिनट के लिए 200 XG पर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार polypropylene ट्यूब और अपकेंद्रित्र में सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण करने की अनुमतितापमान। Mammosphere मीडिया के 5 मिलीलीटर - ध्यान से 1 में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं बंद छानना।
- प्राप्त करने और एकल कक्ष निलंबन थाली करने के लिए सेल लाइनों के लिए ऊपर वर्णित चरणों 1.1-1.4 का पालन करें। यदि आवश्यक हो तो 25 जी के माध्यम से कोशिकाओं को नुकसान पहुँचाए कोशिकाओं को सीमित करने के लिए दो बार के एक अधिकतम सिरिंज से गुजरती हैं।
3. Mammosphere क्षमता (%) गणना गठन
- संस्कृति अवधि के बाद, 40X बढ़ाई पर एक खुर्दबीन के नीचे mammospheres (अधिक से अधिक 40 माइक्रोन) व्यास गिनती। डिजीटल छवि 5 रैंडम एक प्रकाश माइक्रोस्कोप पर एक डिजिटल कैमरे का उपयोग खेतों और अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर mammospheres आकार का निर्धारण। किसी भी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें।
- निम्न समीकरण का उपयोग Mammosphere बनाने क्षमता (यूके%) की गणना:
यूके (%) = (अच्छी तरह से प्रति mammospheres की #) / (अच्छी तरह से प्रति वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के #) 100 x
आत्म नवीकरण के आकलन के लिए Mammospheres 4. सीरियल Passaging
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पूर्व गर्म 0.5% / trypsin 0.2% EDTA के 500 μl में गोली resuspend। 2-3 मिनट के लिए सेते हैं।
- Trypsin बेअसर करने के लिए एफसीएस के 500 μl जोड़ें। 5 मिनट के लिए 500 XG पर अपकेंद्रित्र। क्षेत्रों disaggregate करने के लिए नीचे mammospheres मीडिया, pipetting के ऊपर के 100 μl में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली त्यागें और।
- Hemocytometer के साथ कोशिकाओं की गणना और कोशिकाओं एकल कक्ष निलंबन में हैं, तो यह निर्धारित। एक 25 जी के माध्यम से पारित नहीं तो एकल कक्षों प्राप्त करने के लिए तीन गुना तक सिरिंज। प्राथमिक पीढ़ी में इस्तेमाल एक ही घनत्व में एक नए अल्ट्रा कम लगाव 6 अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं बीज।
- 5-10 दिनों के बाद, क्षेत्रों> 40 माइक्रोन गिनती और पहले की सूचना दी सूत्र का उपयोग क्षेत्र के गठन दक्षता की गणना।
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Representative Results
विभिन्न नमूनों या अलग उपचार के अधीन उन वरीयता प्राप्त प्रारंभिक कोशिकाओं के लिए सामान्य बनाने के बाद कि फार्म mammospheres> 40 माइक्रोन की संख्या में भिन्न हो सकते हैं। तीन प्रतियों में उगाई जाने वाली प्रत्येक उपचार के लिए mammosphere गठन दक्षता (यूके) की गणना। यह अलग बोने घनत्व के साथ प्रयोगों तुलना में किया जा करने के लिए सक्षम बनाता है। डाटा सबसे अच्छा आदर्श रूप से सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के साथ, एक बार ग्राफ पर प्रदर्शित है, और तीन प्रतियों कुओं भर में मानक विचलन प्रदर्शित कर रहा है। लगातार 60-80% संगम के बीच में गैर पक्षपाती प्लेटों में पक्षपाती कोशिकाओं हस्तांतरण। सावधान सेल गिनती सही रूप में उपचार के प्रभाव बढ़ाता के लिए आवश्यक है। इस महत्वपूर्ण कदम अच्छी तरह से एक ही इलाज से अलग कई निलंबन की तैयारी करके अपने परिणाम के लिए योगदान दे रहा है कि परिवर्तनशीलता की डिग्री का अनुमान है। मापा सेल एकाग्रता एक ही अच्छी तरह से काफी अलग हैं, तो आपकी गिनती दृष्टिकोण (चित्रा 2) को परिष्कृत करने पर विचार करें।
चित्रा 1: प्राथमिक स्तन कैंसर और सेल लाइन के नमूनों की प्रोसेसिंग mammosphere संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए नमूने enzymatically, पच एकल कक्षों के रूप में मान्य है, और वृद्धि कारकों के साथ सीरम मुक्त mammosphere माध्यम में गैर पक्षपाती प्लेटों पर चढ़ाया जाता है।। प्लेट्स क्षेत्र संलयन से बचने के लिए विकास के चरण के दौरान संभाला नहीं किया जाना चाहिए। सही पर तस्वीर 5 दिनों के बाद फोटो खिंचवाने प्रतिनिधि MCF 7 क्षेत्रों को दर्शाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: सकारात्मक एक उपकला एस्ट्रोजन से गठित mammospheres के प्रतिनिधि परिणाम (MCF 7), और एक mesenchymal ट्रिपल negative (एमडीए MB-231) सेल लाइन। मिनिमल सेल संलयन / एकत्रीकरण एमसीएफ-7 के लिए 500 कोशिकाओं / 2 सेमी पर यहाँ, कम घनत्व चढ़ाना द्वारा प्राप्त कर ली है, और 1000 कोशिकाओं / 2 सेमी एमडीए MB-231 के लिए किया गया था।
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Discussion
प्राथमिक और माध्यमिक mammospheres के सफल आकलन कोशिकाओं न्यूनतम क्षेत्र एकत्रीकरण के साथ, एकल क्लोन से फार्म mammospheres कि पर्याप्त रूप से कम घनत्व पर चढ़ाया जा रहा है पर निर्भर करता है। हालांकि बहुत कम हैं कि घनत्व में, बहुत कुछ mammospheres सांख्यिकीय उपचार के प्रभाव भेद करने के लिए हो सकता है। बोने घनत्व है कि वे अपने क्षेत्र बनाने क्षमता में काफी भिन्न हो सकते हैं के बाद से इस्तेमाल प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए (कम ई cadherin व्यक्त उन कम स्थिर और कम अवधि mammosphere संस्कृतियों 18 फार्म कर सकते हैं)। यह अनुकूलन चरण एकल कक्षों का प्रतिरूप वृद्धि से अधिकांश प्राथमिक और माध्यमिक क्षेत्र के गठन के परिणाम सुनिश्चित करना चाहिए। अच्छी तरह से प्रति एक सेल चढ़ाना पूरी तरह प्रतिरूप mammosphere गठन सुनिश्चित करने के लिए एक ही रास्ता है, और हौसले से व्युत्पन्न नमूने 13 के आत्म नवीकरण / भेदभाव दरों बढ़ाता के लिए सिफारिश की जा सकती है। अभी तक इस दृष्टिकोण भी उलझी कारकों से ग्रस्त: एक mammosphere गठन1% की दक्षता में 96 अच्छी तरह से थाली प्रति केवल एक ही mammosphere निकलेगा, और दक्षता कम mammospheres निलंबित कोशिकाओं के बीच संकेत पैराक्राइन वृद्धि कारक के अभाव में गठन किया जा रहा है साथ कम करके आंका जा सकता है। अंत में, passaging के बाद माध्यमिक क्षेत्रों की आवृत्ति आत्म नवीकरण के स्तर का अनुमान कर सकते हैं, और वास्तव में कैंसर स्टेम सेल गुणों के साथ कोशिकाओं के लिए का चयन यदि प्राथमिक क्षेत्र के गठन से माध्यमिक उच्च दक्षता की उम्मीद की जानी चाहिए। माध्यमिक क्षेत्रों और सेल प्रकार उचित बहुत कम सेल घनत्व के प्रति अनुकूलित किया जाना चाहिए पाने के लिए जब Reaggregation एक विशेष समस्या है।
यह भी अलग अलग होंगे माइक्रोन 40> को mammospheres लिए लिया गया समय विकसित करने के लिए, और नैदानिक नमूनों से mammospheres क्षेत्र विकास की गति के आधार पर 5-12 दिनों के बीच में गिना जा करना पड़ सकता है। एकत्रीकरण और क्षेत्रों के फ्यूजन अनिवार्य रूप से की वजह से मीडिया के आसपास की कोशिकाओं के निहित हरकत के लिए होता है, लेकिन इस प्रक्रिया में काफी पूर्व से बढ़ाया जा करने के लिए प्रकट होता हैविकास के चरण में 19 के दौरान प्लेटें आगे बढ़ perimenters, इसलिए कुछ को टाला जा सकता।
बड़े क्षेत्रों नियमित तौर पर उच्च लंबी अवधि replicative क्षमता के साथ स्टेम सेल से आने के लिए लगा रहे हैं, वहीं इस धारणा को सावधानी के साथ व्यवहार किया जाना चाहिए। बड़ा क्षेत्रों progenitors के proliferative क्षमता, वृद्धि कारकों के लिए जवाबदेही को दर्शाते हैं, या एकत्रीकरण या संलयन का एक उत्पाद हो सकता है। दोनों प्रकार की कोशिकाओं के संयुक्त आवृत्ति अब भी स्रोत ऊतक के tumorigenicity प्रतिबिंबित कर सकते हैं, हालांकि दोनों स्टेम कोशिकाओं और उनके पारगमन amplifying बेटी कोशिकाओं, mammospheres 20 को जन्म देने में सक्षम हैं।
mammosphere परख उनके vivo में आला में कैंसर स्टेम सेल के गठन और व्यवहार की जटिलता पर कब्जा करने के लिए एक विफलता के द्वारा सीमित है। सही मायने में इन विट्रो में और vivo आत्म नवीकरण और भावी पृथक स्तन कैंसर स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव, मम्मो में लंबी अवधि का आकलन करने के लिएक्षेत्र assays के इसलिए आदर्श वंश अनुरेखण और xenotransplantation प्रयोगों के साथ संयोजन के रूप में किया जाना चाहिए। वंश अनुरेखण सही ढंग से कैंसर स्टेम सेल सबसेट को प्रतिबिंबित कि मार्कर पर निर्भर करता है, वे 'हड्डी फाइड' कैंसर स्टेम कोशिकाओं के गतिशील गठन में योगदान कि इन विवो शर्तों को बनाए रखने से बहुत लाभ होगा। अभी भी मानव प्रतिरक्षा और स्ट्रोमल घटकों 21 की कमी है, जबकि immunocompromised चूहों में xenograft प्रयोगों में ट्यूमर गठन का आकलन भी, mammosphere assays से लापता कई आला घटकों प्रदान करेगा। अधिक तकनीकी रूप से मांग हालांकि, इन तकनीकों स्तन कैंसर स्टेम सेल गुण और tumorigenicity का एक और अधिक पूर्ण और सूचनात्मक देखने के लिए प्रयास किया जाना चाहिए।
mammosphere परख एक जानकारीपूर्ण और सुविधाजनक उपकरण प्रदान करता है, यह ध्यान से बाहर किया जाता है और इसके बाद के संस्करण सीमाओं माना प्रदान की: वास्तव में विवो कब्जा करने के हमारे ज्ञान के रूप मेंकैंसर स्टेम कोशिकाओं अग्रिमों द्वारा अनुभवी माहौल, mammosphere assays के आणविक और पर्यावरणीय कारकों की एक बढ़ती हुई श्रृंखला को शामिल कर सकते हैं। ऊपर उल्लिखित दृष्टिकोण का प्रयोग, क्षेत्र-गठन दरों xenografts 2,15,16 में ट्यूमर दीक्षा दरों के अनुरूप है, और क्षेत्रों के आत्म नवीकरण और अधिक आक्रामक स्तन कैंसर 22 में वृद्धि हुई है और कीमोथेरेपी के रूप में 23 ऐसे निम्नलिखित स्टेम सेल बढ़ती हस्तक्षेप नहीं करता है। इस बीच क्षेत्रों खुद को अभिव्यक्ति मतभेद और स्टेम सेल जीन अभिव्यक्ति वास्तुकला में शामिल उपन्यास कारकों का अध्ययन करने के साथ जो एक मूल्यवान संसाधन उपलब्ध करा सकते हैं।
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Acknowledgments
इस काम हिलेरी क्राफ्ट और सर डगलस मायर्स के लिए विशेष उल्लेख के साथ इंपीरियल बीआरसी, स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए राष्ट्रीय संस्थान, और एक्शन अगेंस्ट कैंसर द्वारा समर्थित है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Lonza | CC-3151 | |
| 2 mM L-glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | |
| 100 U/ml Penicillin & Streptomycin | Sigma Aldrich | P4083 | |
| 20 ng/ml Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| 20 ng/ml Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | R&D systems | 233-FB-025 | |
| 1x B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Scientific | 12399902 | |
| 0.5% trypsin/0.2% EDTA | Sigma Aldrich | 59418C | |
| Fetal calf serum | First Link UK | 02-00-850 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Low attachment 6-well plates | Corning | CLS3814 | |
| Collagenase type 1A | Sigma Aldrich | C9891 | |
| Hyaluronidase | Sigma Aldrich | H3506 | |
| Sterile razor blades | Fisher Scientific | 12443170 | |
| Sterile scalpel | Fisher Scientific | 11758353 | |
| Sterile micro-dissecting scissors | Sigma Aldrich | S3146 |
References
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