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Medicine

Mammosphere saggio Formazione di Human Breast Cancer tessuti e linee cellulari

Published: March 22, 2015 doi: 10.3791/52671
* These authors contributed equally

Abstract

Simile ai tessuti sani, molti di sangue e tumori solidi sono ora pensato di essere organizzati gerarchicamente, con un sottoinsieme di cellule tumorali staminali, come quello auto-rinnovarsi dando origine a una progenie più differenziato. La comprensione e il targeting queste cellule staminali tumorali nel cancro al seno, che può possedere una maggiore chemio e radio-resistenza rispetto alla massa tumorale non-staminali, è diventato un importante settore di ricerca. Marcatori compreso CD44, CD24, e l'attività ALDH possono essere valutati utilizzando la fluorescenza delle cellule attivate (FACS) per isolare in modo prospettico le cellule che mostrano una maggiore tumorigenicità quando impiantati in topi immunocompromessi: il saggio mammosphere è diventato anche ampiamente utilizzato per la sua capacità di identificare in modo retrospettivo Sfera d' formando cellule che si sviluppano da cloni di cellule simil-staminali singolo. Qui descriviamo approcci per la coltura appropriato di mammospheres da linee cellulari o campioni elementari di pazienti, la loro passaging, e calcoli per stimare sfera fefficienza orming (SFE). Prima discutiamo considerazioni chiave e le insidie ​​della pianificazione e l'interpretazione degli esperimenti mammosphere appropriata.

Introduction

L'esistenza di linee cellulari tumorali guidati da cellule staminali tumorali staminali come ha notevolmente aggiunto alla nostra comprensione del tumore eterogeneità. Mentre alcuni diversità fenotipica nei tumori si pone dalla conseguenza clonale di cloni geneticamente distinte, una componente importante sembra essere il risultato di differenze epigenetiche: le cellule tumorali possono passare (a volte in modo reversibile) tra stelo, progenitore, e gli stati differenziati attraverso l'attivazione o la repressione di specifici geni programmi di espressione 1 - 3. Questo può riflettere cellulari fattori intrinseci o estrinseci, riflettendo il programma genica attualmente espressa in una cella con la sua conseguente Autocrino in combinazione con segnalazione paracrina dalla vicina cancro stromale o cellule immunitarie consegna fattori modulatori e condizioni microambientali quali il grado di ipossia 2,4,5.

Anche se gli approcci innovativi lineage tracingstanno avanzando la nostra capacità di studiare le cellule staminali del cancro putativi in loro in vivo nicchia 6-8, saggi-sfera formando rimangono un approccio popolare e conveniente per stimare il potenziale delle cellule del cancro al seno 'a comportarsi come cellule staminali, almeno nelle condizioni di analisi utilizzati. E 'spesso usato insieme a metodi retrospettivi per le cellule staminali del cancro purificante, per la loro espressione di marcatori di membrana CD44 e CD24 9, e livelli di attività dell'enzima ALDH (aldeide deidrogenasi) 10, marcatori che sono state proposte per corrispondere a più mesenchymal- e epiteliale cellule staminali del cancro -come rispettivamente 11. L'approccio di formazione sfera è stato sviluppato come il saggio neurosfere, permettendo la crescita delle cellule staminali putative da singoli cloni non aderenti, condizioni privo di siero con l'aggiunta di fattore di crescita epiteliale (EGF) 12, dopo essere utilmente applicato alla normalità e cancerose tessuti del seno.

Osso quiescente cellule staminali in buona lungo termine, pensato per riposare in fase G0, non sperimenteranno la precisa combinazione di fattori che potrebbero favorire l'attivazione in vivo. Il saggio mammosphere consente invece la crescita delle cellule sia pronta per divisione mitotica o già divisione 13. Questi progenitori, pur non essendo un cellulare veramente riposo, possono essere il palcoscenico delle cellule che prolifera con i mitogeni FEG e il fattore di crescita dei fibroblasti di base (bFGF) utilizzati nel test. Tuttavia, contengono una serie di segnalazione cellulare associata staminali attivato Percorsi di 14. Inoltre, il tasso della loro formazione riguarda la tumorigenicità del tessuto sono stati prelevati da, misurata dalla loro potenza in saggi di diluizione limitate eterotrapianti topo 2,15,16 </ Sup>.

Qui forniamo protocolli dettagliati per isolare singole cellule e generare mammospheres primari da entrambe le linee di cellule di cancro al seno umano e campioni clinici di tumori al seno. Abbiamo anche descrivono come eseguire passaggi seriali di mammospheres primari per valutare auto-rinnovamento, e come calcolare sfera formando efficienza che consente il confronto tra diverse densità di semina (vedi schema in figura 1).

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Protocol

Le procedure di seguito sono stati eticamente approvati dal Imperial College di Londra.

1. Generazione di mammospheres primarie di Human Breast Cancer Cell Lines

NOTA: eseguire le seguenti operazioni sotto una cappa cultura sterile.

  1. Preparare Mammosphere media contenente DMEM / F12 integrato con 2 mM L-glutammina, 100 U / ml di penicillina, 100 U / ml di streptomicina. Preparare completo supporto al momento dell'uso con l'aggiunta di 20 ng ml ricombinante fattore / di crescita epidermico umano (EGF, Sigma), 10 ng / ml ricombinante di base del fattore di crescita dei fibroblasti umani (bFGF; Sistemi di R & S) e 1x B27 supplemento.
  2. Aspirare mezzi di pallone contenente aderenti MCF-7 o MDA-MB-231 cellule (o una linea cellulare di cancro al seno di tua scelta; 70-80% confluenza), lavare due volte in 1x PBS, e trypsinize cellule.
  3. Cellule centrifugare a 200 xg a temperatura ambiente per 5 min. Surnatante e risospendere le cellule decantare in 1-5 ml di mezzi mammosphere. Pipettasu e giù e se necessario utilizzare un filtro tappo filtro cella 40 micron per ottenere cella singola sospensione. Utilizzare un emocitometro per garantire una sospensione singola cella è formata (se non, utilizzare un ago G 25 alla siringa sospensione cellulare fino a 3 volte).
  4. Se necessario isolare CD44 + CD24- sottoinsieme cellulare tramite FACS con anti-CD24-ficoeritrina (PE) e isotiocianato (FITC) anticorpi monoclonali anti-CD44 9-fluoresceina. In alternativa, isolare tale popolazione utilizzando una cella magnetica attivato l'ordinamento del sistema (MACS) con anti-CD44 e anti-CD24-biotina microsfere combinati come da istruzioni del produttore. Eseguire selezione positiva utilizzando LS colonne, e selezione negativa utilizzando colonne LD e confermare i fenotipi di tutte le cellule isolate mediante citometria di flusso 17.
  5. Calcolare il numero di cellule vitali per ml utilizzando trypan blue.
    NOTA: La vitalità cellulare è calcolato come il numero di cellule vitali diviso per il numero totale di celle all'interno delle griglie sul hemocyTometer. Le cellule che occupano blu trypan sono considerate non vitali. La seguente procedura viene utilizzata per determinare con precisione percentuale di cellule vitali.
    1. Preparare una soluzione allo 0,4% di blu trypan in PBS. Aggiungere 0,1 ml di trypan blu stock soluzione a 1 ml di cellule. Caricare un emocitometro ed esaminare immediatamente al microscopio a basso ingrandimento. Contare il numero di cellule totali e il numero di cellule colorazione blu.
      Cellule vitali = [1.00 - (Numero di celle blu ÷ Numero di cellule totali)] × 100.
    2. Per calcolare il numero di cellule vitali per ml di cultura, utilizzare la formula seguente. Ricordare di correggere il fattore di diluizione.
      Numero di cellule vitali × 10 4 × 1,1 = cellule / ml cultura
  6. Risospendere una quantità predeterminata di cellule in 2 ml di mezzi completi mammosphere in ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti aderente ultra-bassa. La densità di semina è normalmente 500-4,000 cellule / cm 2 cellule per pozzetto. Uso Opzionalmente loattacco w piastre da 24 pozzetti, mentre la semina di cellule alla stessa densità in 0,5 ml di media.
    NOTA: si consiglia l'ottimizzazione di densità di semina e il tempo della cultura per ogni linee cellulari di interesse.
  7. Incubare bassa fissaggio 6 pozzetti ultra a 37 ° C e 5% CO 2 per 5-10 giorni (a seconda della linea cellulare e le dimensioni mammospheres) senza disturbare le piastre, in particolare durante la fase di crescita dei primi 5 giorni .

2. Generazione di mammospheres primarie di cancro al seno umano campioni clinici

NOTA: tessuto del cancro del seno umano può essere ottenuto da pazienti sottoposti a chirurgia per la rimozione di tumori al seno. Tessuto Store sul ghiaccio per un massimo di 24 ore in 50 ml provette sterili in coltura contenente 100 U / ml di penicillina e 100 U / ml di streptomicina. Eseguire i seguenti passaggi sotto una cappa cultura sterile.

  1. Trasferire il campione in un piatto Petri tessuto 100 mm con un piccolo volume di media. Remove il tessuto adiposo con le forbici sterili, scapel e pinzette.
  2. Aggiungere 2-3 ml di DMEM / F12 e tritare il campione in 1 mm 3 pezzi con scapel sterile o lama di rasoio fino a quando rimangono senza grandi pezzi.
  3. Risospendere le parti di tessuto a pre-riscaldato a 10 ml di DMEM contenente enzimi proteolitici (3.000 U / ml di collagenasi e 1000 U / ml ialuronidasi) e incubare a 37 ° C in un agitatore rotativo fino a che tutti i frammenti di tessuto vengono digeriti. Di solito la digestione completa richiede 1-3 ore. Regolare il tempo di digestione secondo caratteri patologici di tumori. (Per esempio adenocarcinoma mammario è generalmente difficile da digerire rispetto al carcinoma mucinoso che è più fragile e richiede tempi più rapidi). Valutare il grado di digestione ogni ora ½ osservando 20 microlitri di sospensione sotto emocitometro.
  4. Lasciare i frammenti a sedimentare per 5 minuti, poi trasferire il surnatante in una provetta di polipropilene da 15 ml conica e centrifugare a 200 xg per 10 min a temtemperatura. Decantare con cautela le cellule surnatante e risospendere in 1 - 5 ml di media mammosphere.
  5. Seguire i passaggi 1,1-1,4 sopra descritte per linee cellulari per ottenere e piastra di sospensioni di cellule singole. Passano cellule attraverso il 25 G siringa un massimo di 2 volte, se necessario, per limitare le cellule dannose.

3. Mammosphere Forming Efficiency (%) Calcolo

  1. Dopo il periodo di coltura, contare le mammospheres (maggiori di 40 micron di diametro) con un microscopio a 40X di ingrandimento. Immagine 5 campi aleatori utilizzando una fotocamera digitale su un microscopio ottico e determinano la dimensione mammospheres utilizzando il software di acquisizione. Utilizzare qualsiasi immagine software di analisi.
  2. Calcola Mammosphere Efficienza Forming (MFE%) mediante la seguente equazione:
    MFE (%) = (° mammospheres per pozzetto) / (° cellule seminate per pozzetto) x 100

4. Passaging serie di mammospheres per la valutazione di Self-rinnovamento

  1. Gettare il surnatante e risospendere il pellet in 500 ml di pre-riscaldato 0,5% tripsina / 0,2% EDTA. Incubare per 2-3 min.
  2. Aggiungere 500 ml di FCS per neutralizzare tripsina. Centrifugare a 500 g per 5 min. Gettare il surnatante e risospendere pellet in 100 ml di mammospheres media, pipettando su e giù per disaggregare sfere.
  3. Contare le cellule con emocitometro e determinare se le cellule sono in sospensione di cellule singole. Se non passare attraverso un 25 G siringa fino a 3 volte per ottenere cellule singole. Seme le cellule in un nuovo minimo attaccamento 6 pozzetti ultra alla stessa densità utilizzata nella generazione primaria.
  4. Dopo 5-10 giorni, contare sfere> 40 micron e calcolare l'efficienza sfera che forma con la formula riportata prima.

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Representative Results

Diversi campioni o quelli sottoposti a trattamenti diversi possono variare nel numero di mammospheres> 40 micron che formano dopo normalizzazione per celle iniziali seminate. Calcola mammosphere formando efficienza (MFE) per ogni trattamento cresciuto in triplice copia. Ciò consente esperimenti con diverse densità di semina da confrontare. I dati sono migliori visualizzata su un grafico a barre, idealmente con controlli positivi e negativi, e la visualizzazione della deviazione standard di tutti i pozzetti in triplicato. Coerentemente trasferire cellule aderenti in piastre non aderenti tra il 60-80% di confluenza. Conteggio delle cellule accurata è essenziale per quantificare con precisione gli effetti dei trattamenti. Stimare il grado di variabilità che questo passaggio chiave sta contribuendo ai risultati preparando più sospensioni separatamente dallo stesso trattamento bene. Se la concentrazione cellulare misurata differisce in modo significativo dallo stesso pozzo, di perfezionare il tuo approccio di conteggio (Figura 2).


Figura 1: Il trattamento dei tumori al seno primari e campioni di linee cellulari per ottenere colture mammosphere campioni vengono enzimaticamente digerite, convalidate come singole cellule, e placcato su piastre non aderenti in senza siero medio mammosphere con fattori di crescita.. Le lastre devono essere manipolati durante la fase di crescita per evitare la fusione sfera. L'immagine a destra mostra rappresentativi MCF-7 sfere fotografati dopo 5 giorni. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2: Risultati rappresentativi di mammospheres formata da un estrogeno epiteliale positivo (MCF-7), ed una tripla negati mesenchimalive (MDA-MB-231) linea di cellule. fusione cellulare Minimal / aggregazione è stato raggiunto mediante placcatura bassa densità, qui a 500 cellule / cm 2 per MCF-7, e 1000 cellule / cm 2 per MDA-MB-231.

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Discussion

La valutazione di successo di mammospheres primarie e secondarie si basa su cellule in fase placcato in sufficientemente basse densità che mammospheres forma da singoli cloni, con un minimo di aggregazione sfera. Tuttavia a densità che sono troppo bassi, troppo pochi mammospheres possono formare per distinguere gli effetti dei trattamenti statisticamente. Densità di semina deve essere ottimizzata per ciascuna linea cellulare utilizzata dal momento che possono variare notevolmente in loro efficienza sfera formando (coloro che esprimono basso E-caderina possono formare mammosphere culture meno stabili e più breve termine di 18). Questa fase di ottimizzazione dovrebbe garantire risultati più formazione sfera primarie e secondarie della crescita clonale di singole cellule. Placcatura una cella per pozzetto è l'unico modo per garantire completamente la formazione mammosphere clonale, e può essere raccomandato per quantificare i tassi di auto-rinnovamento / differenziazione dei campioni freschi derivati ​​13. Ma questo approccio soffre anche di fattori di complicazione: una mammosphere formaturaefficienza del 1% produrrà un solo mammosphere per piastra da 96 pozzetti, e l'efficienza può essere sottostimato con minori mammospheres essendo formate in assenza del fattore di crescita paracrini segnalazione tra cellule sospese. Infine, la frequenza di sfere secondarie dopo passaging in grado di stimare i livelli di auto-rinnovamento, e una maggiore efficienza della secondaria di formazione sfera primario dovrebbe essere previsto se davvero la selezione per le cellule con proprietà delle cellule staminali del cancro. Riaggregazione è un problema particolare quando deriva sfere secondarie e delle cellule di tipo appropriate densità di cellule molto basse devono essere ottimizzati in direzione.

Il tempo necessario per mammospheres a crescere a> 40 micron anche variare e mammospheres da campioni clinici può avere bisogno di essere contati tra 5-12 giorni a seconda della velocità di crescita sfera. Aggregazione e fusione di sfere si verifica inevitabilmente causa di locomozione intrinseca delle cellule intorno alla media, ma il processo sembra essere sostanzialmente rafforzata da experimenters spostano le piastre durante la fase di crescita 19, qualcosa quindi da evitare.

Mentre le grandi sfere sono regolarmente pensato di venire da cellule staminali con maggiore capacità replicativa a lungo termine questa ipotesi deve essere trattato con cautela. Sfere più grandi possono riflettere la capacità proliferativa dei progenitori, la capacità di risposta ai fattori di crescita, o essere un prodotto di aggregazione o fusione. Sia le cellule staminali e le loro cellule figlie transito amplificazione sono in grado di dare origine a mammospheres 20, anche se la frequenza combinato di entrambi i tipi di cellule può ancora riflettere la tumorigenicità del tessuto di origine.

Il dosaggio mammosphere è limitata da un difetto di catturare la complessità della formazione delle cellule staminali del cancro e comportamento nella loro nicchia in vivo. Per valutare veramente a lungo termine in vitro e in vivo di auto-rinnovamento e la differenziazione delle cellule staminali del cancro al seno in modo prospettico isolate, Mammotest sfera dovrebbero quindi idealmente essere eseguiti in collaborazione con lineage tracing e esperimenti di xenotrapianto. Mentre lineage tracing si basa su indicatori che riflettono accuratamente il sottoinsieme di cellule staminali del cancro, che traggono grande beneficio dal mantenimento delle condizioni in vivo che contribuiscono alla formazione dinamica di 'buona fede' osso cellule staminali del cancro. Valutare la formazione di tumori negli esperimenti di xenotrapianto in topi immunocompromessi fornirà anche molti componenti di nicchia mancanti saggi mammosphere, mentre mancano ancora i componenti del sistema immunitario e stromali umane 21. Anche se tecnicamente più esigente, queste tecniche dovrebbero essere tentato per una visione più completa e informativo di cancro al seno proprietà delle cellule staminali e tumorigenicità.

Il saggio mammosphere fa fornire uno strumento informativo e pratico, a condizione che venga effettuata con attenzione e le limitazioni di cui sopra considerati: infatti come la nostra conoscenza della Condi in vivozioni vissute da cellule staminali del cancro avanza, saggi mammosphere possono incorporare una gamma crescente di fattori molecolari ed ambientali. Utilizzando l'approccio di cui sopra, i tassi di sfera-formazione corrispondono ai tassi di tumore-iniziazione in eterotrapianti 2,15,16, e di auto-rinnovamento delle sfere fa incremento dei tumori al seno più aggressivi 22 e seguenti interventi di cellule staminali crescente come la chemioterapia 23. Nel frattempo le sfere stesse in grado di fornire una risorsa preziosa con cui studiare le differenze di espressione e nuovi fattori coinvolti nella cellula staminale espressione genica architettura.

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Acknowledgments

Questo lavoro è supportato dal BRC Imperiale, l'Istituto Nazionale per la Ricerca Sanitaria, e lotta contro il cancro, con menzione speciale per Craft Hilary e Sir Douglas Myers.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 Lonza CC-3151
2 mM L-glutamine Sigma Aldrich G8540
100 U/ml Penicillin & Streptomycin Sigma Aldrich P4083
20 ng/ml Recombinant human epidermal growth factor (EGF) Sigma Aldrich E9644
20 ng/ml Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) R&D systems 233-FB-025
1x B27 supplement Invitrogen 17504-044
Phosphate buffered saline (PBS) Thermo Scientific 12399902
0.5% trypsin/0.2% EDTA Sigma Aldrich 59418C
Fetal calf serum First Link UK 02-00-850
Trypan blue Sigma Aldrich 93595
Low attachment 6-well plates Corning CLS3814
Collagenase type 1A Sigma Aldrich C9891
Hyaluronidase Sigma Aldrich H3506
Sterile razor blades Fisher Scientific 12443170
Sterile scalpel Fisher Scientific 11758353
Sterile micro-dissecting scissors Sigma Aldrich S3146

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Lombardo, Y., de Giorgio, A., Coombes, C. R., Stebbing, J., Castellano, L. Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines. J. Vis. Exp. (97), e52671, doi:10.3791/52671 (2015).

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