Mammosphere Formation analysen fra Menneskelig Breast Cancer Vev og cellelinjer

Abstract

Ligner på friskt vev, mange blod og solide maligniteter er nå antatt å være organisert hierarkisk, med en undergruppe av stilk-lignende kreftceller som selv fornye samtidig gi opphav til mer differensiert avkom. Forståelse og rettet mot disse kreftstamceller i brystkreft, noe som kan ha forsterket kjemo- og radio-motstand i forhold til ikke-stammen svulst bulk, har blitt et viktig forskningsområde. Markører inkludert CD44, CD24, og ALDH aktivitet kan vurderes ved hjelp fluorescens aktivert celle sortering (FACS) til prospektivt isolere celler som viser forbedret tumorigenisitet når implantert i immunsupprimerte mus: den mammosphere analysen har også blitt mye brukt for sin evne til å retrospektivt identifisere Sphere forming celler som utvikler seg fra enkelt stamcelleliknende kloner. Her vi skissere metoder for riktig dyrkning av mammospheres fra cellelinjer eller primære pasientprøver, deres aging, og beregninger for å anslå sfære fforme effektivitet (SFE). Først diskuterer vi viktige hensyn og fallgruver i riktig planlegging og tolkning av mammosphere eksperimenter.

Introduction

Eksistensen av tumorcelle linjene ledet av stammelignende kreft stamceller har stor grad lagt til vår forståelse av svulst heterogenitet. Mens noen fenotypiske mangfoldet i svulster ikke oppstår fra klonal utvekst av genetisk forskjellige kloner, vises en vesentlig komponent å skyldes epigenetiske forskjeller: kreftceller kan overgangen (noen ganger reversibelt) mellom stammen, stamfar, og differensierte statene via aktivering eller undertrykkelse av spesifikt gen uttrykk programmer ^{1 - 3.} Dette kan gjenspeile celle indre eller ytre faktorer, som reflekterer genekspresjon programmet som uttrykkes i en celle med sin resulterende autokrin signalering i forbindelse med parakrin signalering fra nabo kreft, stromal eller immunceller levere modulerende faktorer, og microenviromental tilstander slik som graden av hypoksi ^2,4,5.

Selv innovative avstamning sporing tilnærmingerer fremme evnen til å studere mulige kreft stamcellene i deres in vivo nisje ^{6 - 8,} kuledannende analyser er fortsatt et populært og praktisk metode for å estimere brystkreftceller potensial til å oppføre seg som stamceller, i det minste under de analysebetingelser som benyttes. Det blir ofte brukt sammen med retrospektive fremgangsmåter for rensing av kreft stamceller, ved deres ekspresjon av membranmarkører CD44 og CD24 ^9, og aktiviteten av enzymet ALDH (aldehyd dehydrogenase) ^10, markører som er blitt foreslått å svare til mer mesenchymal- og epitelial -lignende kreft stamceller henholdsvis ^11. Sfæren dannelse tilnærming ble først utviklet som neurosfærene assay, slik at veksten av putative stamceller fra enkeltkloner i ikke-adherente, serum-frie betingelser med tillegg av epitelial vekstfaktor (EGF) ^12, som senere blir med fordel anvendt på normal og kreft brystvev.

bein fide stamceller, tenkte å hvile i G0 fase, vil ikke oppleve presis kombinasjon av faktorer som vil favorisere aktivering in vivo. Den mammosphere analysen gjør stedet veksten av celler enten klar for mitotisk divisjon eller allerede dele ^13. Disse forløpere, selv om det ikke er en virkelig hvilecelle, kan være cellestadiet som prolifererer med EGF og basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF) mitogener som benyttes i analysen. Ikke desto mindre, inneholder de en rekke aktiverte stamcelle-assosierte signalbaner ^14. I tillegg er hastigheten av deres dannelse vedrører tumorgenisitet i vevet de ble tatt fra, når målt ved deres potens med hensyn til et begrenset fortynning assays i mus xenotransplantater ^{2,15,16 <}/ Sup>.

Her gir vi detaljerte protokoller for å isolere enkeltceller og genererer primære mammospheres fra både menneskelige brystkreftcellelinjer og kliniske prøver av brystsvulster. Vi beskriver også hvordan du utfører serie passasjer av primær mammospheres å vurdere selvfornyelse, og hvordan man skal beregne sfære forming effektivitet som gjør at sammenligning på tvers av ulike seeding tettheter (se skjema i figur 1).

Protocol

Prosedyrene nedenfor er etisk godkjent av Imperial College, London.

1. generasjon av Primary Mammospheres fra Menneskelig Breast Cancer Cell Lines

MERK: Utfør følgende trinn under en steril kultur hette.

1. Forbered Mammosphere Media inneholdende DMEM / F12 supplert med 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 U / ml streptomycin. Forbered fullstendig medium umiddelbart før bruk ved tilsetning av 20 ng / ml rekombinant human epidermal vekstfaktor (EGF; Sigma), 10 ng / ml rekombinant humant basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF; R & D Systems), og 1x B27 supplement.
2. Aspirer media fra kolbe med heft MCF-7 eller MDA-MB-231 celler (eller en brystkreft cellelinje av ditt valg; 70-80% samløpet), vask to ganger i 1x PBS, og trypsineres celler.
3. Sentrifuger cellene ved 200 x g ved romtemperatur i 5 min. Dekanter supernatanten og resuspender cellene i 1-5 ml mammosphere medier. Pipetteopp og ned, og hvis det benyttes et 40 um celle sil cap filter for å tilveiebringe enkelt-cellesuspensjon. Bruke et hemocytometer for å sikre en enkeltcelle-suspensjon har dannet seg (dersom ikke, å bruke en 25 G nål for å sprøyte cellesuspensjonen opp til 3 ganger).
4. Hvis det er nødvendig å isolere CD44 + CD24- cellulære undersett via FACS ved anvendelse av anti-CD24-fykoerytrin (PE) og anti-CD44-fluorescein-isotiocyanat (FITC) monoklonale antistoffer ^9. Alternativt isolere slik befolkning ved hjelp av en magnetisk-aktivert celle sortering (MACS) system med anti-CD44 og anti-CD24-biotin kombinerte mikroperler som i henhold til produsentens instruksjoner. Utføre positiv utvelgelse hjelp LS kolonner, og negativ seleksjon ved hjelp av LD kolonner og bekrefte fenotyper av alle isolerte celler ved flowcytometri ^17.
5. Beregne antallet levedyktige celler per ml ved hjelp av trypanblått.
   MERK: Cellenes levedyktighet beregnes som antallet levedyktige celler dividert med det totale antall celler i gitrene på hemocyTometer. Celler som tar opp trypanblått anses ikke-levedyktig. Den følgende fremgangsmåte anvendes for å nøyaktig bestemme andelen av levedyktige celler.
   1. Forberede en 0,4% løsning av trypanblått i PBS. Tilsett 0,1 ml av trypan blå lagerløsning til 1 ml av celler. Legg i en hemocytometer og undersøke umiddelbart under et mikroskop ved lav forstørrelse. Tell antall av totale celler og antallet blå flekker celler.
      Levedyktige celler = [1,00 - (Antall blå celler ÷ Antall totale celler)] × 100.
   2. For å beregne antall levedyktige celler per ml kultur, bruke formelen nedenfor. Husk å korrigere for fortynningsfaktoren.
      Antall levedyktige celler x 10 ⁴ x 1,1 = celler / ml kultur
6. Resuspender en forhåndsbestemt mengde av celler i 2 ml fullstendig mammosphere medier i hver brønn på en 6-brønners ultra-lav heftende plate. Seeding tetthet er normalt 500-4,000 celler / ^cm2 celle per brønn. Eventuelt bruk low feste 24-brønners plater samtidig såing celler på samme tetthet i 0,5 ml media.
   MERK: Vi anbefaler optimalisering av seeding tetthet og tid for kultur for hver cellelinjer av interesse.
7. Inkuber ultra lav-feste 6-brønners plater ved 37 ° C og 5% _CO2 i 5-10 dager (avhengig av cellelinjen og størrelsen på mammospheres) uten å forstyrre platene, særlig i løpet av vekstfasen av de første 5 dagene .

2. generasjon av Primary Mammospheres fra Menneskelig Breast Cancer kliniske prøver

MERK: Human brystcancer vev kan oppnås fra pasienter som gjennomgår kirurgi for fjerning av brystsvulster. Butikk vevet på is i opp til 24 timer i 50 ml sterilt rør i kulturmedier inneholdende 100 U / ml penicillin og 100 U / ml streptomycin. Utfør følgende trinnene under en steril kultur hette.

1. Overføre prøven i en 100 mm petriskål vevet med et lite volum av mediet. Fjernelsee fettvev ved hjelp av steril saks, skalpellen og pinsett.
2. Legg 2-3 ml DMEM / F12 og hakke prøven i en mm ^tre stykker med en steril skalpellen eller barberblad til det ikke store biter forbli.
3. Resuspendere vev stykker i forvarmet 10 ml DMEM inneholdende proteolytiske enzymer (3000 U / ml kollagenase og 1000 U / ml hyaluronidase) og inkuberes ved 37 ° C på en rotasjonsrister inntil alle vev fragmenter blir spaltet. Vanligvis komplett fordøyelsen tar 1-3 timer. Juster fordøyelsen tid i henhold til patologiske tegn på tumorer. (For eksempel bryst adenokarsinom er vanligvis vanskeligere å fordøye i forhold til mucinous karsinom som er mer skjøre og trenger kortere fordøyelsen tid). Vurdere graden av fordøyelsen hver ½ time ved å observere 20 fil henge opp under hemocytometer.
4. Tillat fragmentene å sedimentere i 5 minutter, og deretter overføre supernatanten i en 15 ml konisk polypropylenrør og sentrifuger ved 200 xg i 10 min ved værelses temtemperatur. Nøye dekanter supernatanten og resuspender cellene i 1 - 5 ml mammosphere media.
5. Følg trinnene 1.1 til 1.4 som er beskrevet ovenfor for cellelinjer for å skaffe og plate enkeltcellesuspensjoner. Passere cellene gjennom 25 G sprøyte maksimalt to ganger om nødvendig for å begrense skadelige celler.

3. Mammosphere Forming Effektivitet (%) Beregning

1. Etter dyrkningsperioden telle mammospheres (større enn 40 pm) diameter under et mikroskop ved 40 gangers forstørrelse. Digitalt bilde 5 tilfeldige felt med et digitalt kamera på et lysmikroskop og bestemme mammospheres størrelse etter oppkjøps programvare. Bruk noen Image Analysis Software.
2. Beregne Mammosphere Forming Effektivitet (MFE%) ved hjelp av følgende ligning:
   MFE (%) = (# av mammospheres per brønn) / (antall celler sådd per brønn) x 100

4. Serieaging av Mammospheres for Assessment of Self-fornyelse

1. Kast supernatanten og resuspender pelleten i 500 pl av forvarmet 0,5% trypsin / 0,2% EDTA. Inkuber i 2-3 min.
2. Legg 500 mL av FCS å nøytralisere trypsin. Sentrifuger ved 500 xg i 5 min. Kast supernatant og resuspender pellet i 100 mL av mammospheres media, pipettering opp og ned for å disaggregert sfærer.
3. Tell cellene med hemocytometer og bestemme om cellene er i enkeltcellesuspensjon. Hvis ikke passere gjennom en 25 G sprøyte opptil tre ganger for å få enkeltceller. Seed cellene inn i en ny ultra lav-feste 6-brønn plate med samme tetthet som brukes i den primære produksjon.
4. Etter 5-10 dager, telle kuler> 40 um og beregne kuledannende effektivitet ved bruk av formelen rapportert tidligere.

Representative Results

Forskjellige prøver eller de som utsettes for forskjellige behandlinger kan variere i antall mammospheres> 40 um som dannes etter normalisering for innledende celler sådd. Beregne mammosphere forming effektivitet (MFE) for hver behandling vokst i tre eksemplarer. Dette gjør det mulig for eksperimenter med forskjellige tettheter seeding som skal sammenlignes. Data er best vist i et stolpediagram, ideelt sett med positive og negative kontroller, og viser standardavvik på tvers av triplikatbrønner. Gående overføre adherente celler til ikke-adherente plater ved mellom 60-80% konfluens. Nøye celletelling er vesentlig for nøyaktig å kvantifisere virkningene av behandlingene. Anslå grad av variasjon som denne viktig skritt er å bidra til resultatene ved å forberede flere suspensjoner separat fra den samme behandlingen godt. Hvis cellen konsentrasjon målt vesentlig forskjellig fra den samme brønn, bør du vurdere å avgrense telling tilnærming (figur 2).

Figur 1: Behandling av primær brystkreft og cellelinjesampler for å oppnå mammosphere kulturer Prøver blir enzymatisk spaltet, validert som enkeltceller og sådd ut på ikke-adherente plater i serumfritt medium mammosphere med vekstfaktorer.. Platene skal ikke håndteres i løpet av vekstfasen for å unngå sfære fusjon. Bildet til høyre viser representative MCF-7 sfærer fotografert etter fem dager. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Representative resultater av mammospheres dannet fra en epitelial østrogen positive (MCF-7), og en mesenchymale trippel negative (MDA-MB-231) cellelinje. Minimal cellefusjon / aggregering ble oppnådd ved lav tetthet plettering, her på 500 celler / cm ² for MCF-7, og 1000 celler / cm ² for MDA-MB-231.

Discussion

Vellykket vurdering av primære og sekundære mammospheres avhengig av celler som blir belagt med tilstrekkelig lave tettheter som mammospheres form fra enkelt kloner, med minimal sfære aggregering. Men med en tetthet som er for lav, kan også få mammospheres danner skille effekten av behandlinger statistisk. Seeding tetthet skal være optimalisert for hver cellelinje brukt siden de kan variere betydelig i deres sfære forming effektivitet (de som uttrykker lav E-cadherin kan danne mindre stabile og mer kortsiktige mammosphere kulturer ^18). Denne optimalisering stadiet bør sikre de fleste primære og sekundære sfære formasjons resultater fra klonal vekst av enkeltceller. Plating én celle per brønn er den eneste måten å helt sikre klonal mammosphere formasjon, og kan anbefales for å kvantifisere de selvfornyelse / differensiering priser av fersk avledet prøvene ^13. Likevel er denne tilnærmingen lider også av kompliserende faktorer: en mammosphere formingvirkningsgrad på 1% vil gi bare en enkelt mammosphere per 96-brønners plate, og effektivitet kan være underestimert med færre mammospheres som dannes i fravær av parakrine vekstfaktor-signalering mellom suspenderte celler. Endelig kan frekvensen av sekundære kuler etter aging anslå grad av selvfornyelse, og høyere effektivitet av sekundær enn primærkuledannelse bør forventes hvis virkelig seleksjon for celler med kreftstamcelleegenskaper. Reaggregering er et spesielt problem når utlede sekundære sfærer og celle-type egnede meget lave celletettheter bør optimaliseres mot.

Tiden det tar for mammospheres å vokse til> 40 mikrometer vil også variere, og mammospheres fra kliniske prøver kan trenge å bli regnet mellom 5-12 dager avhengig sfære vekst hastighet. Aggregering og fusjon av kuler uunngåelig oppstår på grunn av iboende bevegelse av celler rundt media, men prosessen ser ut til å bli vesentlig forbedret ved experimenters bevegelige platene i løpet av vekstfasen ^19, noe som derfor må unngås.

Mens store kuler blir rutinemessig antatt å komme fra stamceller med høyere langsiktig replicative kapasitet denne antagelsen bør behandles med forsiktighet. Større kuler kan gjenspeile den proliferative kapasiteten til stamceller, i respons til vekstfaktorer, eller være et produkt av aggregeringen eller sammensmelting. Begge stamceller og deres transitt forsterkerdattercellene er i stand til å gi opphav til mammospheres ^20, selv om det kombinerte frekvensen av begge celletyper kan likevel reflektere tumorgenisitet av kilden vev.

Den mammosphere analysen er begrenset av en manglende evne til å fange kompleksiteten av kreft stamcelle dannelse og oppførsel i deres in vivo nisje. For virkelig å vurdere den langsiktige in vitro og in vivo selvfornyelse og differensiering av prospektivt isolerte brystkreft stamceller, mammosfære analyser bør derfor ideelt sett være utført i forbindelse med avstamning sporing og xenotransplantasjon eksperimenter. Mens avstamning tracing er avhengig av markører som nøyaktig gjenspeiler den kreftstamcelle undergruppe, de har stort utbytte av å beholde in vivo forhold som bidrar til den dynamiske dannelsen av 'bein fide' kreftstamceller. Vurdering av svulstdannelse i xenograft eksperimenter i immunkompromittert mus vil også gi mange nisje komponenter mangler fra mammosphere analyser, mens de fortsatt mangler menneskelige immun og stromal komponenter ^21. Selv om mer teknisk krevende, bør disse teknikkene bli forsøkt for en mer komplett og informativ visning av brystkreftstamcelleegenskaper og tumorigenisitet.

Den mammosphere analysen gjør gi en informativ og praktisk verktøy, forutsatt at det er utført nøye og begrensningene ovenfor vurderes: faktisk som vår kunnskap om in vivo condisjoner oppleves av kreft stamceller fremskritt, kan mammosphere analyser innlemme et økende utvalg av molekylære og miljøfaktorer. Bruke tilnærming skissert ovenfor, sfære-dannelse Satsene tilsvarer tumor-initiering priser i xenografts ^2,15,16, og selvfornyelse av kuler gjør økning i mer aggressiv brystkreft ²² og følgende stamcelle økende intervensjoner som kjemoterapi ^23. I mellomtiden kulene selv kan gi en verdifull ressurs som å studere uttrykk forskjeller og nye faktorer involvert i stamcelle genuttrykk arkitektur.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Lonza	CC-3151
2 mM L-glutamine	Sigma Aldrich	G8540
100 U/ml Penicillin & Streptomycin	Sigma Aldrich	P4083
20 ng/ml Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	Sigma Aldrich	E9644
20 ng/ml Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF)	R&D systems	233-FB-025
1x B27 supplement	Invitrogen	17504-044
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Scientific	12399902
0.5% trypsin/0.2% EDTA	Sigma Aldrich	59418C
Fetal calf serum	First Link UK	02-00-850
Trypan blue	Sigma Aldrich	93595
Low attachment 6-well plates	Corning	CLS3814
Collagenase type 1A	Sigma Aldrich	C9891
Hyaluronidase	Sigma Aldrich	H3506
Sterile razor blades	Fisher Scientific	12443170
Sterile scalpel	Fisher Scientific	11758353
Sterile micro-dissecting scissors	Sigma Aldrich	S3146