Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Mammosphere Formation analys från Human bröstcancer vävnader och cellinjer

Published: March 22, 2015 doi: 10.3791/52671
* These authors contributed equally

Abstract

Liknar friska vävnader, många blod och solida maligniteter nu tros vara organiserad hierarkiskt, med en delmängd av stamceller liknande cancerceller som själv förnyar samtidigt ge upphov till mer differentierad avkomma. Förståelse och inriktning dessa cancerstamceller i bröstcancer, vilket kan besitter förbättrad kemo- och radioresistens jämfört med den icke-stammen tumör bulk, har blivit ett viktigt forskningsområde. Markörer inklusive CD44, CD24, och ALDH aktivitet kan bedömas med hjälp av fluorescens aktiverad cellsortering (FACS) för att prospektivt isolera celler som uppvisar ökad tumorigenicitet när implanteras i nedsatt immunförsvar möss: den mammosphere analysen har också blivit allmänt används för sin förmåga att i efterhand identifiera sphere- bildande celler som utvecklas från enstaka stamcellsliknande kloner. Här redogör vi för metoder för lämplig odling av mammospheres från cellinjer eller primära patientprover, deras aging, och beräkningar för att uppskatta sfär forming effektivitet (SFE). Först diskuterar vi viktiga överväganden och fallgropar i lämplig planering och tolkning av mammosphere experiment.

Introduction

Förekomsten av tumörcells härstamningar leds av stamceller liknande cancerstamceller har i hög grad lagt till vår förståelse av tumör heterogenitet. Medan vissa fenotypisk mångfald i tumörer uppstår från den klon utväxt av genetiskt distinkta kloner, visas en betydande komponent bero på epigenetiska skillnader: cancerceller kan övergången (ibland reversibelt) mellan stam, stamfader, och differentierade stater via aktivering eller repression av specifik gen uttrycks program 1 - 3. Detta kan återspegla cell inneboende eller yttre faktorer, vilket återspeglar genuttryck program som just nu uttrycks i en cell med dess resulte Autokrin tillsammans med parakrint signalering från grann cancer, stromal eller immunceller som levererar modulerande faktorer, och microenviromental förhållanden såsom graden av hypoxi 2,4,5.

Även innovativa härstamning spåra tillvägagångssättavancerar vår förmåga att studera förmodade cancerstamceller i deras in vivo nisch 6-8, sfärbildande analyser förbli en populär och bekväm metod för att uppskatta bröstcancerceller potential att bete sig som stamceller, åtminstone under analysförhållanden som används. Det används ofta tillsammans med retrospektiva metoder för rening av cancerstamceller, genom deras uttryck av membranmarkörer CD44 och CD24 9, och aktivitetsnivåer av enzymet ALDH (aldehyddehydrogenas) 10, markörer som har föreslagits för att motsvara mer mesenchymal- och epitel -liknande cancerstamceller respektive 11. Klotet bildning tillvägagångssätt utvecklades först som neurosphere analysen, som möjliggör tillväxt av förmodade stamceller från enstaka kloner i icke-vidhäftande, serumfria förhållanden med tillägg av epitelial tillväxtfaktor (EGF) 12, senare tillämpas med fördel till det normala och cancer bröstvävnad.

ben fide stamceller, trodde att vila i G0 fasen kommer inte uppleva den exakta kombinationen av faktorer som skulle gynna aktivering in vivo. Den mammosphere analysen möjliggör istället tillväxten av celler antingen redo för mitotiska division eller redan delande 13. Dessa stamfäder, även om inte en verkligt vilande cell, kan vara den cellstadiet som prolifererar med EGF och basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) mitogener används i analysen. Ändå de innehålla en rad aktiverad stamcellsassocierade signalvägar 14. Dessutom graden av deras bildning avser tumorigenicitet av vävnaden de togs ur, mätt med sin potens i begränsade utspädningsanalyser i mus xenotransplantat 2,15,16 </ Sup>.

Här ger vi detaljerade protokoll för att isolera enskilda celler och genererar primära mammospheres från både mänskliga bröstcancercellinjer och kliniska prover av brösttumörer. Vi beskriver också hur man utför seriella passager av primära mammospheres att bedöma självförnyelse, och hur man kan beräkna sfär bildande effektivitet som gör att jämförelser mellan olika seedning densitet (se schema i figur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Procedurerna nedan har etiskt godkända av Imperial College i London.

1. Generation av primära Mammospheres från Human bröstcancercellinjer

OBS: Utför följande steg i en steril kultur huva.

  1. Förbered Mammosphere Medier som innehåller DMEM / F12 kompletterat med 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 U / ml streptomycin. Förbered komplett media omedelbart före användning genom att lägga 20 ng / ml rekombinant human epidermal tillväxtfaktor (EGF; Sigma), 10 ng / ml rekombinant humant basfibroblasttillväxtfaktor (bFGF; FoU Systems) och 1x B27 tillskott.
  2. Aspirera media från kolv innehållande vidhäftande MCF-7 eller MDA-MB-231-celler (eller en bröstcancer cellinje som du väljer, 70-80% sammanflödet), tvätta två gånger i 1x PBS, och trypsinize celler.
  3. Centrifugera cellerna vid 200 xg vid rumstemperatur under 5 min. Decant supernatanten och återsuspendera celler i 1-5 ml mammosphere medier. Pipettupp och ner, och vid behov använda en 40 ìm cell sil lock filter för att få encelliga suspension. Använd en hemocytometer för att säkerställa en enda cellsuspension har bildats (om inte, använd en 25 G nål för att spruta cellsuspensionen upp till 3 gånger).
  4. Vid behov isolat CD44 + CD24- cellulär delmängd via FACS användning av anti-CD24-fykoerytrin (PE) och anti-CD44-fluorescein (FITC) monoklonala antikroppar 9. Alternativt, isolera sådan befolkningen som använder en magnetisk aktiverad cellsortering (MACS) systemet med anti-CD44 och anti-CD24-biotin kombinerade mikropärlor som enligt tillverkarens instruktioner. Utför positiv selektion använder LS kolumner och negativa val med LD kolonner och bekräfta fenotyper av alla isolerade celler med flödescytometri 17.
  5. Beräkna antalet viabla celler per ml med användning av trypanblått.
    OBS: Cellviabilitet beräknas som antalet livskraftiga celler dividerat med det totala antalet celler i gallren på hemocytometer. Celler som tar upp trypanblått betraktas som icke-viabla. Följande procedur används för att exakt fastställa andelen livsdugliga celler.
    1. Bered en 0,4% lösning av trypanblått i PBS. Lägg 0,1 ml trypanblått stamlösning till 1 ml celler. Ladda en hemocytometer och undersöka omedelbart under ett mikroskop vid låg förstoring. Räkna antalet totala celler och antalet blåa färgningsceller.
      Levande celler = [1,00 - (Antal blå celler ÷ Antal totala celler)] x 100.
    2. För att beräkna antalet livskraftiga celler per ml av kultur, använd formeln nedan. Kom ihåg att korrigera för utspädningsfaktorn.
      Antal viabla celler x 10 4 × 1,1 = celler / ml odlings
  6. Resuspendera en förutbestämd mängd av celler i 2 ml komplett mammosphere media i varje brunn i en 6-brunnars ultralåg vidhäftande platta. Den såddtäthet är normalt 500-4,000 celler / cm 2 cell per brunn. Eventuellt användning low fäst 24-brunnars plattor, medan sådd celler vid samma densitet i 0,5 ml medium.
    OBS: Vi rekommenderar optimering av sådd täthet och tid för kultur för varje cellinjer av intresse.
  7. Inkubera ultra låg fäst 6-brunnsplattor vid 37 ° C och 5% CO2 i 5-10 dagar (beroende på cellinje och storleken på mammospheres) utan att störa plattorna, särskilt under tillväxtfasen av de första fem dagarna .

2. Generation av primära Mammospheres från Human Breast Cancer kliniska prover

OBS: Human bröstcancervävnad kan erhållas från patienter som genomgår kirurgi för avlägsnande av brösttumörer. Butiks vävnad på is i upp till 24 h i 50 ml sterila rör i odlingsmedia innehållande 100 U / ml penicillin och 100 U / ml streptomycin. Utför följande steg enligt en steril kultur huva.

  1. Överför provet i en 100 mm vävnadspetriskål med en liten volym av media. Avtagbare den fettvävnad med steril sax, scapel och pincett.
  2. Lägg 2-3 ml DMEM / F12 och finhacka provet i 1 mm 3 bitar med en steril scapel eller rakblad tills inga stora bitar kvar.
  3. Resuspendera vävnaden bitar i förvärmda 10 ml DMEM innehållande proteolytiska enzymer (3000 U / ml kollagenas och 1000 U / ml hyaluronidas) och inkubera vid 37 ° C i en roterande skakanordning tills alla vävnadsfragment spjälkas. Vanligtvis fullständig nedbrytning tar 1-3 tim. Justera koktiden enligt patologiska tecken på tumörer. (Till exempel bröstadenokarcinom är oftast svårare att smälta jämfört med mucinöst cancer som är mer ömtålig och behöver kortare koktiden). Bedöma graden av matsmältningen varje halvtimme genom att observera 20 pl suspensionen under hemocytometer.
  4. Låt fragmenten sedimentera under 5 minuter, sedan överföra supernatanten i en 15 ml koniskt polypropenrör och centrifugera vid 200 xg under 10 min vid rums TEMtemperatur. Dekantera försiktigt bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 1-5 ml mammosphere media.
  5. Följ stegen 1.1-1.4 beskrivs ovan för cellinjer att erhålla och plåt enkelcellsuspensioner. Passera celler genom 25 G spruta högst 2 gånger om det behövs för att begränsa skadliga celler.

3. Mammosphere Forming Effektivitet (%) Beräkning

  1. Efter odlingsperioden, räkna mammospheres (större än 40 pm) diameter under ett mikroskop vid 40X förstoring. Digitalt bild 5 slump fält med en digitalkamera på ett ljusmikroskop och bestämma mammospheres storlek med förvärv programvara. Använd någon bildanalys Software.
  2. Beräkna Mammosphere Forming Effektivitet (MFE%) med hjälp av följande ekvation:
    MFE (%) = (# av mammospheres per brunn) / (# av celler sådda per brunn) x 100

4. seriepassage av Mammospheres för Bedömning av självförnyelse

  1. Kassera supernatanten och suspendera pelleten i 500 l av förvärmda 0,5% trypsin / 0,2% EDTA. Inkubera under 2-3 minuter.
  2. Lägg 500 pl av FCS för att neutralisera trypsin. Centrifugera vid 500 xg under 5 minuter. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 100 | il mammospheres media, pipettera upp och ner för att disaggregera sfärer.
  3. Räkna celler med hemocytometer och avgöra om cellerna är i enkelcellsuspension. Om inte passera genom en 25 G spruta upp till 3 gånger för att få enskilda celler. Seed cellerna i en ny ultra låg fastsättning 6-brunnar vid samma densitet som används i den primära generationen.
  4. Efter 5-10 dagar, räkna sfärer> 40 pm och beräkna sfär bildande effektiviteten med hjälp av formeln redovisas före.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Olika prover eller de som utsätts för olika behandlingar kan variera i antalet mammospheres> 40 nm som bildar efter normalisering för initiala celler seedade. Beräkna mammosphere bildande effektivitet (MFE) för varje behandling ökat trefaldigt. Detta möjliggör experiment med olika seeding densiteter som skall jämföras. Data visas bäst på ett stapeldiagram, helst med positiva och negativa kontroller, och visning av standardavvikelse över triplikatbrunnar. Konsekvent överföra vidhäftande celler till icke-vidhäftande plattor till mellan 60-80% sammanflödet. Noggrann cellräkning är viktigt att exakt kvantifiera effekterna av behandlingarna. Uppskatta graden av variabilitet att detta avgörande steg bidrar till dina resultat genom att förbereda flera suspensioner separat från samma behandling väl. Om cellkoncentrationen mäts skiljer sig avsevärt från samma brunn, överväga att förfina ditt räkningsmetoden (Figur 2).


Figur 1: Behandling av primär bröstcancer och cellinjen prover för att erhålla mammosphere kulturer Prover enzymatiskt digere, valideras som enskilda celler, och ströks ut på icke-vidhäftande plattor i serumfritt mammosphere medium med tillväxtfaktorer.. Plattor bör inte hanteras under tillväxtfasen för att undvika sfär fusion. Bilden till höger visar representativa MCF-7 sfärer fotograferade efter 5 dagar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2: Representativa resultat av mammospheres bildade från en epitelial östrogen positiv (MCF-7), och en mesenkymal trippel negative (MDA-MB-231) cellinje. Minimal cellfusion / aggregation uppnåddes inom låg plätering densitet, här vid 500 celler / cm 2 för MCF-7, och 1000 celler / cm 2 för MDA-MB-231.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Framgångsrik bedömning av primära och sekundära mammospheres förlitar sig på celler som pläterade vid tillräckligt låga tätheter som mammospheres form från enstaka kloner, med minimal sfär aggregering. Men vid densiteter som är för låg kan för få mammospheres bilda att särskilja effekterna av behandlingarna statist. Seedning densitet bör optimeras för varje cellinje som används eftersom de kan variera avsevärt i deras sfär bildande effektivitet (de som uttrycker låga E-cadherin kan bilda mindre stabila och kortare sikt mammosphere kulturer 18). Denna optimering skede bör säkerställa flesta primära och sekundära sfär bildnings resultat från klon tillväxten av enskilda celler. Bordläggningen en cell per brunn är det enda sättet att helt garantera klon mammosphere bildning, och kan rekommenderas för att kvantifiera självförnyelse / differentierings andelen färsk härledda prover 13. Men detta synsätt lider också av komplicerande faktorer: a mammosphere bildandeeffektiviteten av en% kommer att ge endast en enda mammosphere per 96-brunnars platta, och effektiviteten kan vara underskattad med färre mammospheres som formas i frånvaro av parakrin tillväxtfaktor signalering mellan suspenderade celler. Slutligen kan frekvensen av sekundära sfärer efter passage uppskatta nivåer av självförnyelse, och bör förväntas högre effektivitet av sekundär än primär sfär bildning om verkligt val för celler med cancer stamcellsegenskaper. Återaggregering är ett särskilt problem när härledning sekundära sfärer och celltyp lämpliga mycket låga celltätheter bör optimeras mot.

Den tid det tar för mammospheres att växa till> 40 pm kommer också att variera, och mammospheres från kliniska prover kan behöva räknas mellan 5-12 dagar beroende på sfär tillväxthastighet. Sammanläggning och fusion av sfärer sker oundvikligen pga inneboende förflyttning av celler runt media, men processen verkar vara betydligt förbättras genom experimenters flyttar plattorna under tillväxtfasen 19, något därför undvikas.

Medan stora sfärer rutinmässigt tros komma från stamceller med högre långsiktigt replikationsförmåga detta antagande bör behandlas med försiktighet. Större sfärer kan spegla proliferativ kapacitet progenitorceller, lyhördheten inför tillväxtfaktorer, eller vara en produkt av aggregering eller fusion. Både stamceller och deras transitförstärkande dotterceller är kapabla att ge upphov till mammospheres 20, även om den kombinerade frekvensen av båda celltyper kan fortfarande spegla tumorigenicitet av källvävnaden.

Den mammosphere analysen begränsas av ett misslyckande att fånga komplexiteten i cancerstamcellsbildning och beteende i deras in vivo nisch. För att verkligen bedöma långsiktiga in vitro och in vivo självförnyelse och differentiering av prospektivt isolerade bröstcancerstamceller, mammosphere analyser bör därför helst ske i samband med härstamning spårning och xenotransplantation experiment. Medan härstamning spårning bygger på markörer som korrekt återspeglar den cancerstamcells delmängd, gynnas de stor nytta av att behålla de vivo förhållanden som bidrar till den dynamiska bildandet av "bone fide" cancerstamceller. Bedöma tumörbildning i xenograft experiment immunsupprimerade möss kommer också att ge många nisch saknade komponenter från mammosphere analyser, samtidigt saknar mänskliga immun och stromala komponenter 21. Även mer tekniskt krävande, bör dessa tekniker prövas för en mer komplett och informativ bild av bröstcancer fastigheter stamcells och tumorigenicitet.

Den mammosphere analysen gör ger en informativ och praktiskt verktyg, förutsatt att den utförs noggrant och ovanstående begränsningar anses: ja som vår kunskap om in vivo conditioner som upplevs av cancerstamceller förskott, kan mammosphere analyser införliva ett ökande utbud av molekylära och miljöfaktorer. Använda den metod som beskrivs ovan, sfär-bildningshastigheter motsvarar tumörinvigningspriser i xenografter 2,15,16, och självförnyelse av sfärer gör ökning mer aggressiva bröstcancer 22 och följande stamcellshöjande insatser såsom kemoterapi 23. Samtidigt sfärerna själva kan ge en värdefull resurs som man kan studera uttrycksskillnader och nya faktorer inblandade i stamcells genuttryck arkitektur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av kejserliga BRC, Institutet för hälsa forskar, och åtgärder mot cancer med särskilt omnämnande till Hilary Craft och Sir Douglas Myers.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 Lonza CC-3151
2 mM L-glutamine Sigma Aldrich G8540
100 U/ml Penicillin & Streptomycin Sigma Aldrich P4083
20 ng/ml Recombinant human epidermal growth factor (EGF) Sigma Aldrich E9644
20 ng/ml Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) R&D systems 233-FB-025
1x B27 supplement Invitrogen 17504-044
Phosphate buffered saline (PBS) Thermo Scientific 12399902
0.5% trypsin/0.2% EDTA Sigma Aldrich 59418C
Fetal calf serum First Link UK 02-00-850
Trypan blue Sigma Aldrich 93595
Low attachment 6-well plates Corning CLS3814
Collagenase type 1A Sigma Aldrich C9891
Hyaluronidase Sigma Aldrich H3506
Sterile razor blades Fisher Scientific 12443170
Sterile scalpel Fisher Scientific 11758353
Sterile micro-dissecting scissors Sigma Aldrich S3146

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Iliopoulos, D., Hirsch, H. a, Struhl, K. An epigenetic switch involving NF-kappaB, Lin28, Let-7 MicroRNA, and IL6. Cell. 139 (4), 693-706 (2009).
  2. Iliopoulos, D., Hirsch, H. a, Wang, G., Struhl, K. Inducible formation of breast cancer stem cells and their dynamic equilibrium with non-stem cancer cells via IL6 secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (4), 1397-1402 (2011).
  3. Visvader, J. E., Lindeman, G. J. Cancer stem cells: current status and evolving complexities. Cell stem cell. 10 (6), 717-728 (2012).
  4. Rosen, J. M., Jordan, C. T. The increasing complexity of the cancer stem cell paradigm. Science. 324 (5935), 1670-1673 (2009).
  5. Rokavec, M., Wu, W., Luo, J. -L. IL6-mediated suppression of miR-200c directs constitutive activation of inflammatory signaling circuit driving transformation and tumorigenesis. Mol Cell. 45 (6), 777-789 (2012).
  6. Chen, J., Li, Y., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
  7. Driessens, G., Beck, B., Caauwe, A., Simons, B. D., Blanpain, C. Defining the mode of tumour growth by clonal analysis. Nature. 488 (7412), 527-530 (2012).
  8. Schepers, A. G., Snippert, H. J., et al. Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas. Science. 337 (6095), 730-735 (2012).
  9. Sheridan, C., Kishimoto, H., et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast cancer research: BCR. 8 (5), R59 (2006).
  10. Ginestier, C., Hur, M. H., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell stem cell. 1 (5), 555-567 (2007).
  11. Liu, S., Cong, Y., et al. Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts. Stem cell reports. 2 (1), 78-91 (2014).
  12. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1553558 1707-1710 (1992).
  13. Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8 (5), 486-498 (2011).
  14. Dontu, G., Abdallah, W. M., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem / progenitor cells. Genes Dev. , 1253-1270 (2003).
  15. Ponti, D., Costa, A., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Res. 65 (13), 5506-5011 (2005).
  16. Grimshaw, M. J., Cooper, L., et al. Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells. Breast Cancer Res. 10 (3), R52 (2008).
  17. Pham, P. V., Phan, N. L. C., et al. Differentiation of breast cancer stem cells by knockdown of CD44: promising differentiation therapy. J Transl Med. 9 (1), 209 (2011).
  18. Manuel Iglesias, J., Beloqui, I., et al. Mammosphere formation in breast carcinoma cell lines depends upon expression of E-cadherin. PloS one. 8 (10), e77281 (2013).
  19. Coles-Takabe, B. L. K., Brain, I., et al. Don’t look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).
  20. Stingl, J. Detection and analysis of mammary gland stem cells. J Pathol. 217 (2), 229-241 (2009).
  21. Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell stem cell. 14 (3), 275-291 (2014).
  22. Al-Hajj, M., Clarke, M. F. Self-renewal and solid tumor stem cells. Oncogene. 23 (43), 7274-7282 (2004).
  23. Yu, F., Yao, H., et al. let-7 regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells. Cell. 131 (6), 1109-1123 (2007).

Tags

Medicin bröstcancer cancer stamcells CSC BCSC tumorsphere mammosphere tumörbildning självförnyelse.
Mammosphere Formation analys från Human bröstcancer vävnader och cellinjer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lombardo, Y., de Giorgio, A.,More

Lombardo, Y., de Giorgio, A., Coombes, C. R., Stebbing, J., Castellano, L. Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines. J. Vis. Exp. (97), e52671, doi:10.3791/52671 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter