Abstract
Net als bij gezonde weefsels, veel bloed en solide tumoren zijn nu gedacht aan hiërarchisch georganiseerd worden, met een subset van stamcellen-achtige kankercellen die zichzelf te vernieuwen, terwijl die aanleiding geven tot meer gedifferentieerde nageslacht. Het begrijpen en zich richten op deze kankerstamcellen bij borstkanker, die verbeterde chemo- en radio-weerstand ten opzichte van de niet-stam tumor bulk kunnen bezitten, is uitgegroeid tot een belangrijk onderzoeksgebied. Markers zoals CD44, CD24 en ALDH activiteit kan beoordeeld worden met fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) om prospectief isoleren cellen die verbeterde tumorigeniciteit weergegeven wanneer geïmplanteerd in immunodeficiënte muizen: de mammosphere test ook worden veel gebruikt voor zijn vermogen om achteraf identificeren sphere- vormende cellen die zich ontwikkelen uit enkele stamcel-achtige klonen. Hier schetsen we benaderingen voor de juiste kweken van mammospheres uit cellijnen of primaire monsters van patiënten, hun passage, en berekeningen te schatten bol forming efficiëntie (SFE). Eerst bespreken we de belangrijkste overwegingen en valkuilen in de juiste planning en interpretatie van mammosphere experimenten.
Introduction
Het bestaan van de tumor cellijnen onder leiding van de stam-achtige kanker stamcellen is sterk toegevoegd aan ons begrip van de tumor heterogeniteit. Terwijl sommige fenotypische diversiteit in tumoren komt voort uit de klonale uitgroei van genetisch verschillende klonen, verschijnt er een substantieel onderdeel te vloeien uit epigenetische verschillen: kankercellen kan (soms reversibel) overgang tussen stam, stamvader, en gedifferentieerde staten via activering of onderdrukking van specifiek gen expressie programma's 1-3. Dit kan cel intrinsieke of extrinsieke factoren weerspiegelen, die de genexpressie programma dat momenteel wordt uitgedrukt in een cel met de resulterende autocriene signalering in samenhang met paracrienen van naburige kanker, stromale of immuuncellen leveren modulerende factoren en microenviromental omstandigheden zoals de mate van hypoxie 2,4,5.
Hoewel innovatieve lineage tracing benaderingenrukken ons vermogen om vermeende kanker stamcellen bestuderen in hun in vivo niche 6-8, bol vorming assays steeds een populaire en handige op mogelijke borstkankercellen 'schatten gedragen als stamcellen, althans onder de assay omstandigheden. Het wordt vaak gebruikt naast achteraf werkwijzen voor het zuiveren van kanker stamcellen, hun expressie van membraan merkers CD44 en CD24 9 en activiteit van het enzym ALDH (aldehyde dehydrogenase) 10 markers die zijn voorgesteld overeenkwam met meer mesenchymal- en epitheliale -achtige kanker stamcellen respectievelijk 11. De bol vorming benadering werd eerst ontwikkeld als neurosphere assay, waardoor de groei van putatieve stamcellen uit één klonen in niet-hechtende, serumvrije omstandigheden met de toevoeging van epitheliale groeifactor (EGF) 12, later wordt nuttig toegepast om de normale en kankerachtige borstweefsel.
bot fide stamcellen, dacht te rusten in G0 fase, zal niet de ervaring van de precieze combinatie van factoren die activering in vivo zou bevoordelen. De mammosphere test plaats maakt de groei van cellen ofwel klaar voor mitotische deling of reeds verdelen 13. Deze progenitors, hoewel niet echt rustende cel, kan de cel stadium dat proliferates met EGF en basische fibroblast groeifactor (bFGF) mitogenen in de assay. Niettemin, ze bevatten een reeks van geactiveerde stamcellen geassocieerde signaaltransductiewegne 14. Bovendien is de snelheid van hun vorming betreft de tumorigeniciteit van het weefsel van opname van, gemeten door hun vermogen in beperkte verdunning assays muis xenotransplantaten 2,15,16 </ Sup>.
Hier geven we gedetailleerde protocollen enkele cellen isoleren en te kweken primaire mammospheres zowel humane borstkankercellijnen en klinische monsters van borsttumoren. We beschrijven ook hoe seriële passages van primaire mammospheres voeren om zelf-vernieuwing te beoordelen, en hoe te berekenen bol vormen efficiëntie die vergelijking over verschillende zaaien dichtheden (zie schema in figuur 1) mogelijk maakt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De onderstaande procedures zijn ethisch goedgekeurd door het Imperial College in Londen.
1. Generatie van Primaire Mammospheres van Human Breast Cancer Cell Lines
OPMERKING: Voer de volgende stappen onder een steriele cultuur kap.
- Bereid Mammosphere media DMEM / F12 aangevuld met 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 U / ml streptomycine. Bereid compleet medium onmiddellijk vóór gebruik door toevoegen van 20 ng / ml recombinant humane epidermale groeifactor (EGF; Sigma), 10 ng / ml humaan recombinant basische fibroblast groeifactor (bFGF; R & D Systems) en 1 x B27 supplement.
- Zuig media van kolf met aanhangend MCF-7 of MDA-MB-231 cellen (of een borstkanker cellijn van uw keuze; 70-80% samenvloeiing), was twee keer in 1x PBS, en trypsinize cellen.
- Centrifugeer cellen bij 200 xg bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Giet supernatant en resuspendeer cellen in 1-5 ml mammosphere media. Pipetop en neer en gebruik zo nodig een 40 micrometer cel zeefdop filter om eencellige suspensie te verkrijgen. Gebruik een hemocytometer te zorgen voor een enkele cel suspensie gevormd (niet genummerd, gebruik een 25 G naald aan de celsuspensie spuit tot 3 maal).
- Indien nodig, CD44 + CD24- cellen deelverzameling via FACS met anti-CD24-fycoerythrine (PE) en anti-CD44-fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) monoklonale antilichamen 9. Alternatief, isoleren dergelijke populatie met een magnetische-geactiveerde celsortering (MACS) systeem met anti-CD44 en anti-CD24-biotine gecombineerde microbolletjes volgens de instructies van de fabrikant. Voeren positieve selectie met behulp van LS kolommen, en negatieve selectie met behulp van LD kolommen en bevestig de fenotypes van alle geïsoleerde cellen door flowcytometrie 17.
- Bereken het aantal levensvatbare cellen per ml met trypan blauw.
OPMERKING: Cellevensvatbaarheid wordt berekend als het aantal levensvatbare cellen gedeeld door het totale aantal cellen in de roosters op de hemocyTometer. Cellen die nemen trypaanblauw worden beschouwd als niet-levensvatbaar zijn. De volgende procedure wordt toegepast voor percentage levensvatbare cellen nauwkeurig bepalen.- Bereid een oplossing van trypan blauw in PBS 0,4%. Voeg 0,1 ml van trypan blue voorraadoplossing tot 1 ml cellen. Plaats een hemocytometer en onmiddellijk te onderzoeken onder een microscoop bij een lage vergroting. Tel het totale aantal cellen en het aantal blauwe kleuring cellen.
Levensvatbare cellen = [1,00 - (Aantal blauwe cellen ÷ Aantal totaal cellen)] × 100. - Om het aantal levensvatbare cellen per ml van de cultuur te berekenen, gebruik dan de onderstaande formule. Vergeet niet om te corrigeren voor de verdunningsfactor.
Aantal levensvatbare cellen × 10 4 × 1,1 = cellen / ml cultuur
- Bereid een oplossing van trypan blauw in PBS 0,4%. Voeg 0,1 ml van trypan blue voorraadoplossing tot 1 ml cellen. Plaats een hemocytometer en onmiddellijk te onderzoeken onder een microscoop bij een lage vergroting. Tel het totale aantal cellen en het aantal blauwe kleuring cellen.
- Resuspendeer een vooraf bepaalde hoeveelheid cellen in 2 ml compleet mammosphere medium in elk putje van een 6-well ultralage hechtende plaat. Het zaaien dichtheid is normaal gesproken 500-4,000 cellen / cm 2 cel per putje. Eventueel gebruik low attachment 24 putjes terwijl enten cellen bij dezelfde dichtheid in 0,5 ml medium.
OPMERKING: Wij raden aan de optimalisatie van het zaaien dichtheid en de tijd van de cultuur voor elke cellijnen van belang. - Incubeer ultra low-attachment 6-well platen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 5-10 dagen (afhankelijk van de cellijn en de omvang van mammospheres) zonder de platen, vooral tijdens de groeifase van de eerste 5 dagen .
2. Generation of Primary Mammospheres van menselijke borstkanker klinische monsters
OPMERKING: Menselijke borstkanker weefsel kan worden verkregen van patiënten die een chirurgische ingreep voor de verwijdering van borsttumoren. WINKEL weefsel op ijs gedurende 24 uur in 50 ml steriele buizen in kweekmedium bevattende 100 U / ml penicilline en 100 U / ml streptomycine. Voer de volgende stappen onder een steriele cultuur kap.
- Breng het monster in een 100 mm petrischaal tissue met een klein volume media. Afneeme het vetweefsel met behulp van een steriele schaar, Scapel en pincet.
- Voeg 2-3 ml DMEM / F12 en gehakt van het monster in 1 mm 3 stuks met een steriele scapel of scheermesje tot er geen grote stukken blijven.
- Resuspendeer de weefselstukken in voorverwarmde 10 ml DMEM dat proteolytische enzymen (3000 U / ml collagenase en 1000 U / ml hyaluronidase) en incubeer bij 37 ° C in een roterende schudder totdat alle weefsel fragmenten worden gedigereerd. Meestal volledige vertering duurt 1-3 uur. Pas de spijsvertering tijd volgens pathologische tekens van tumoren. (Bijvoorbeeld borstadenocarcinoomcellijn is meestal moeilijker te verteren in vergelijking met mucineus carcinoom dat is meer kwetsbaar en moet korter spijsvertering tijd). Beoordeel de mate van vertering elk half uur door het observeren van 20 ui schorsing onder hemocytometer.
- Laat de fragmenten te sedimenteren gedurende 5 minuten, breng de bovenstaande vloeistof in een 15 ml conische polypropyleen buis en centrifugeer bij 200 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur temtuur. Decanteren voorzichtig de supernatant en resuspendeer cellen in 1-5 ml mammosphere media.
- Volg de stappen 1.1-1.4 hierboven beschreven cellijnen te verkrijgen en plaat enkelvoudige celsuspensies. Passeren cellen door de 25 G maximaal 2 keer spuit indien nodig te beschadigen cellen te beperken.
3. Mammosphere Forming Efficiency (%) Berekening
- Na de kweekperiode, tel de mammospheres (groter dan 40 micrometer) diameter onder een microscoop bij een vergroting van 40x. Beeld digitaal 5 willekeurige velden met behulp van een digitale camera op een lichtmicroscoop en bepalen de mammospheres maat aan de hand van de acquisitie software. Gebruik geen software voor beeldanalyse.
- Bereken Mammosphere Vormen Rendement (MFE%) met de volgende vergelijking:
MFE (%) = (# van mammospheres per putje) / (# cellen per well) x 100
4. Serial passage van de Mammospheres voor de Beoordeling van Self-verlenging
- Verwijder supernatant en resuspendeer de pellet in 500 ul voorverwarmde 0,5% trypsine / 0,2% EDTA. Incubeer gedurende 2-3 min.
- Voeg 500 ul van FCS trypsine te neutraliseren. Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten. Gooi supernatant en resuspendeer pellet in 100 ul mammospheres media, pipetteren op en neer om sferen disaggregeren.
- Tellen cellen met hemocytometer en bepalen of cellen in enkele celsuspensie. Indien niet door een 25 G spuit tot 3 keer om enkele cellen te verkrijgen. Zaad de cellen in een nieuwe ultra low-attachment 6-well plaat bij dezelfde dichtheid die bij de eerste generatie.
- Na 5-10 dagen, te tellen sferen> 40 micrometer en bereken bol vormen efficiency met behulp van de formule vóór gemeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Verschillende monsters of die aan verschillende behandelingen kunnen variëren in het aantal mammospheres> 40 urn die ontstaan na normaliseren initiële cellen gezaaid. Bereken mammosphere vormende efficiëntie (MFE) voor elke behandeling gekweekt in drievoud. Dit maakt experimenten met verschillende dichtheden zaaien te vergelijken. Gegevens best weergegeven op een staafdiagram, idealiter met positieve en negatieve controles, en tonen de standaardafwijking over de drievoudige putjes. Consequent overdracht hechtende cellen in niet-hechtende platen bij 60-80% confluentie. Zorgvuldige celtelling is essentieel voor het nauwkeurig kwantificeren van de effecten van de behandelingen. Schat de mate van variabiliteit dat deze belangrijke stap is bij te dragen aan uw resultaten door het opstellen van meerdere schorsingen afzonderlijk van dezelfde behandeling ook. Indien de celconcentratie, gemeten aanzienlijk afwijkt van dezelfde put, overwegen het verfijnen tellen benadering (figuur 2).
Figuur 1: Verwerking van primaire borstkanker en cellijn monsters mammosphere culturen Monsters worden enzymatisch verteerd, gevalideerd als enkele cellen en uitgeplaat op niet-hechtende platen in serumvrij medium mammosphere met groeifactoren.. De platen moeten niet worden behandeld tijdens de groeifase bol fusie vermijden. De foto rechts toont vertegenwoordiger MCF-7 bollen gefotografeerd na 5 dagen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Representatieve resultaten van mammospheres gevormd uit een epitheliale oestrogeen positieve (MCF-7), en een mesenchymale triple negative (MDA-MB-231) cellijn. Minimale celfusie / aggregatie werd bereikt met lage dichtheid plateren, hier 500 cellen / cm2 voor MCF-7, en 1.000 cellen / cm2 voor MDA-MB-231.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Succesvolle evaluatie van de primaire en secundaire mammospheres vertrouwt op cellen worden uitgeplaat bij voldoende lage dichtheden die vorm mammospheres van enkele klonen, met minimale bol aggregatie. Maar op dichtheid te laag zijn, te weinig mammospheres kunnen vormen om de effecten van behandelingen statistisch onderscheiden. Zaaien dichtheid moet worden geoptimaliseerd voor elke cellijn gebruikt omdat ze aanzienlijk in hun bol vormen efficiëntie kan variëren (die uitdrukken lage E-cadherine kan minder stabiel en kortere termijn mammosphere culturen 18 te vormen). Deze optimalisatie fase moet zorgen voor de meeste primaire en secundaire bol vorming resultaten van de klonale groei van enkele cellen. Plating één cel per putje is de enige manier om volledig te verzekeren klonale mammosphere vorming, en kan worden aanbevolen voor het kwantificeren van de zelf-vernieuwing / differentiatie tarieven van vers verkregen monsters 13. Toch is deze aanpak ook last van complicerende factoren: een mammosphere vormenrendement van 1% slechts één mammosphere per 96-well plaat opleveren en efficiency kan worden onderschat minder mammospheres gevormd in afwezigheid van paracriene groeifactor signalering tussen gesuspendeerde cellen. Ten slotte kan de frequentie van de secundaire bollen na passage niveaus van zelf-vernieuwing te schatten, en een hogere efficiëntie van de secundaire dan primaire bol vorming moet worden verwacht als echt te selecteren voor cellen met kanker stamcellen eigenschappen. Reaggregation is vooral een probleem bij het afleiden van secundaire bollen en celtype geschikte zeer lage cel dichtheden moet worden geoptimaliseerd richting.
De tijd die mammospheres groeien tot> 40 urn zal ook variëren, en mammospheres uit klinische monsters moet worden geteld 5-12 dagen afhankelijk bol groeisnelheid. Aggregatie en fusie van bolletjes onvermijdelijk optreedt als gevolg van inherente voortbeweging van cellen aan de media, maar het proces lijkt aanzienlijk te verhogen door experimenters bewegen de platen tijdens de groeifase 19, wat derhalve worden vermeden.
Terwijl grote bollen routinematig worden gedacht uit stamcellen om te komen met een hogere lange replicatievermogen deze veronderstelling moet met voorzichtigheid worden behandeld. Grotere bollen kan de proliferatieve capaciteit van voorouders, de respons van groeifactoren te wijzen, of zijn een product van samenvoeging of fusie. Zowel stamcellen en hun transit versterkend dochter cellen in staat zijn die aanleiding geven tot mammospheres 20, hoewel de gecombineerde frequentie van beide celtypen kunnen nog steeds weerspiegelen de tumorigeniciteit van de bron weefsel.
De mammosphere assay wordt beperkt door het ontbreken van de complexiteit van kanker stamcellen vorming en hun in vivo niche vangen. Om de lange termijn in vitro en in vivo zelfvernieuwing en differentiatie van prospectief geïsoleerd borstkanker stamcellen, mammo echt beoordelenbol assays moet daarom idealiter worden uitgevoerd in combinatie met lineage tracing en xenotransplantatie experimenten. Terwijl lineage tracing voert markers die nauwkeurig de kankerstamcel subset profiteren zij sterk van de in vivo omstandigheden die bijdragen tot de dynamische vorming van "bonafide" kanker stamcellen behouden. Het beoordelen van tumorvorming in xenograft experimenten bij immuungecompromitteerde muizen zal ook veel niche onderdelen ontbreken in mammosphere assays, terwijl nog ontbreekt menselijke immuunsysteem en stromale componenten 21. Hoewel technisch veeleisender moeten deze technieken geprobeerd een vollediger en informatieve weergave van borstkanker stamcellen eigenschappen en tumorgeniciteit.
De mammosphere test geeft wel een informatieve en handige tool, mits zorgvuldig uitgevoerd en de bovenstaande beperkingen beschouwd: inderdaad als onze kennis van de in vivo Condities ervaren door kanker stamcellen vooruitgang kunnen mammosphere assays een groeiend scala aan moleculaire en omgevingsfactoren op te nemen. Met behulp van de hierboven beschreven aanpak, bol-formatie prijzen stemmen overeen met tumor-initiatie tarieven in xenograften 2,15,16, en zelf-vernieuwing van sferen doet toename van meer agressieve borstkanker 22 en volgende stamcellen toenemende interventies zoals chemotherapie 23. Ondertussen bollen zelf kan een waardevolle bron waarmee expressie verschillen en nieuwe factoren betrokken bij het stamcel genexpressie architectuur onderzoek te verrichten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door de Keizerlijke BRC, het National Institute for Health Research, en kankerbestrijding met speciale vermelding voor Hilary Craft en Sir Douglas Myers.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Lonza | CC-3151 | |
| 2 mM L-glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | |
| 100 U/ml Penicillin & Streptomycin | Sigma Aldrich | P4083 | |
| 20 ng/ml Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| 20 ng/ml Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | R&D systems | 233-FB-025 | |
| 1x B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Scientific | 12399902 | |
| 0.5% trypsin/0.2% EDTA | Sigma Aldrich | 59418C | |
| Fetal calf serum | First Link UK | 02-00-850 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Low attachment 6-well plates | Corning | CLS3814 | |
| Collagenase type 1A | Sigma Aldrich | C9891 | |
| Hyaluronidase | Sigma Aldrich | H3506 | |
| Sterile razor blades | Fisher Scientific | 12443170 | |
| Sterile scalpel | Fisher Scientific | 11758353 | |
| Sterile micro-dissecting scissors | Sigma Aldrich | S3146 |
References
- Iliopoulos, D., Hirsch, H. a, Struhl, K. An epigenetic switch involving NF-kappaB, Lin28, Let-7 MicroRNA, and IL6. Cell. 139 (4), 693-706 (2009).
- Iliopoulos, D., Hirsch, H. a, Wang, G., Struhl, K. Inducible formation of breast cancer stem cells and their dynamic equilibrium with non-stem cancer cells via IL6 secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (4), 1397-1402 (2011).
- Visvader, J. E., Lindeman, G. J. Cancer stem cells: current status and evolving complexities. Cell stem cell. 10 (6), 717-728 (2012).
- Rosen, J. M., Jordan, C. T. The increasing complexity of the cancer stem cell paradigm. Science. 324 (5935), 1670-1673 (2009).
- Rokavec, M., Wu, W., Luo, J. -L. IL6-mediated suppression of miR-200c directs constitutive activation of inflammatory signaling circuit driving transformation and tumorigenesis. Mol Cell. 45 (6), 777-789 (2012).
- Chen, J., Li, Y., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
- Driessens, G., Beck, B., Caauwe, A., Simons, B. D., Blanpain, C. Defining the mode of tumour growth by clonal analysis. Nature. 488 (7412), 527-530 (2012).
- Schepers, A. G., Snippert, H. J., et al. Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas. Science. 337 (6095), 730-735 (2012).
- Sheridan, C., Kishimoto, H., et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast cancer research: BCR. 8 (5), R59 (2006).
- Ginestier, C., Hur, M. H., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell stem cell. 1 (5), 555-567 (2007).
- Liu, S., Cong, Y., et al. Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts. Stem cell reports. 2 (1), 78-91 (2014).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1553558 1707-1710 (1992).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8 (5), 486-498 (2011).
- Dontu, G., Abdallah, W. M., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem / progenitor cells. Genes Dev. , 1253-1270 (2003).
- Ponti, D., Costa, A., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Res. 65 (13), 5506-5011 (2005).
- Grimshaw, M. J., Cooper, L., et al. Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells. Breast Cancer Res. 10 (3), R52 (2008).
- Pham, P. V., Phan, N. L. C., et al. Differentiation of breast cancer stem cells by knockdown of CD44: promising differentiation therapy. J Transl Med. 9 (1), 209 (2011).
- Manuel Iglesias, J., Beloqui, I., et al. Mammosphere formation in breast carcinoma cell lines depends upon expression of E-cadherin. PloS one. 8 (10), e77281 (2013).
- Coles-Takabe, B. L. K., Brain, I., et al. Don’t look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).
- Stingl, J. Detection and analysis of mammary gland stem cells. J Pathol. 217 (2), 229-241 (2009).
- Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell stem cell. 14 (3), 275-291 (2014).
- Al-Hajj, M., Clarke, M. F. Self-renewal and solid tumor stem cells. Oncogene. 23 (43), 7274-7282 (2004).
- Yu, F., Yao, H., et al. let-7 regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells. Cell. 131 (6), 1109-1123 (2007).
