Introduction
Клетки рака груди метастазы в костном мозге до того, как болезнь обнаруживается 1, как только небольшие опухоли развиваются кровеносные сосуды 2,3. Метастатического процесса является быстрое, но неэффективно. Клетки ввести новые кровеносные сосуды быстро, в миллионы за 4 дня, но немногие выживают поездку в отдаленные органы 5. Тем не менее, некоторые микрометастазы выжить в кости и могут быть найдены в виде отдельных клеток или небольших комков клеток в клетках костного мозга от вновь диагностированных пациентов 1. Эти клетки сопротивляться адъювантной химиотерапии, который находится в ведении именно для устранения их 6. Это сопротивление наделен, по существу, путем выживания сигнализации по инициативе взаимодействия с микросреды костного мозга 7,8. Микрометастазы можно найти примерно в одной трети женщин с локализованным раком молочной железы и представляют собой самостоятельную показатель выживания при анализе одномерного анализа 9. Некоторые micrometastases являются рост инициативе, но узоры рецидивов зависит от типа клеток. Пациенты с тройным негативным раком молочной железы, как правило, повторяются от 1 до 4 лет, предполагая, плохой контроль над неактивном состоянии. Другие типы клеток, в том числе ER / PR + клеток, могут оставаться в состоянии покоя до 20 лет, с постоянным, непрерывным скорости рецидива 10. В то время как различия в неактивности подписей экспрессии генов между ER + и ER-клеточных линий и опухолей молочной железы отражают различные потенциалы покоя 11, взаимодействия с стромы костного мозга, вероятно, представляют собой значительный вклад в покое.
Изучение покоя в естественных условиях исключительно трудно, потому что микрометастазы редки и превосходили гемопоэтических клеток более чем на 10-кратно 6. Следовательно, соответствующие модели должны быть созданы, которые обеспечивают в пробирке данных, которые могут предложить механизмы и генерировать проверяемые гипотезы в естественных условиях. Ряд моделей неактивности, в том числе Matheматическое модели 12,13, в пробирке моделей 7,8,14,15, в естественных условиях модели ксенотрансплантатов 16, комбинации в пробирке и модели ксенотрансплантата 17,18 и спонтанные опухоли и метастазирование модели 19, дали некоторое представление раковых клеток покоя 20 , Каждая из этих моделей имеет свои ограничения и сами по себе, прежде всего, полезен для генерации гипотез относительно молекулярной сигнализации и взаимодействий, которые регулируют покоя, чтобы быть проверены в более биологически соответствующих моделей.
С общей цели определения молекулярных механизмов покоя, взаимодействия с микросреды, что приводит к цикла ареста, повторной дифференцировки и терапевтического сопротивления и механизмов, которые приводят к рецидиву в ER + клеток, мы разработали модель в пробирке, что обеспечивает выбранный соответствующие элементы стромальных микросреда 7. Эта модель, в то время как относительно редкие в его компоненты, достаточно прочный, чтобы разрешить следователям, чтобы получить конкретные молекулярные механизмы, которые влияют на важные функции покоя. Эти эксперименты генерации гипотез, которые могут быть проверены непосредственно в живом организме. Модель опирается на несколько ключевых элементов, которые мы продемонстрировали, что отношение в покое. Они включают в себя использование эстроген-зависимых клеток рака молочной железы, культуры клеток на более клоногенном плотности, где их взаимодействие в первую очередь с субстратом и растворимыми компонентами среды, фибронектином субстрат и при наличии основного фактора роста фибробластов (FGF-2) в среде.
Мы охарактеризовали механизмы, которые регулируют систему в пробирке, в том числе индукции ареста клеточного цикла по FGF-2 21, опосредованного TGF-beta 22, выживание сигналов через PI3 киназы 7,8 и 8 Эрк и морфогенного дифференциации в эпителиальной фенотипа, который зависит от RhoA инактивации, интегрину45; 5β1 регуляция и перевязка стромы фибронектина за выживание 7,15 (Рисунок 1). Эффекты в пробирке клеточного цикла FGF-2 на MCF-7 клетки начинают при концентрации, по меньшей мере одно бревно ниже 10 нг / мл 21,23. Обоснованием была основана на временной контроль FGF-2, регулирующего экспрессию молочной протоков морфогенез, циклический расширение и спад в ряде систем млекопитающих 24-27. Мы показали, что FGF-2, индуцирует дифференциацию, в том числе протоковой морфогенеза в 3D культуры 28, и что FGF-2 экспрессии, как правило, теряется со злокачественной трансформации человеческих опухолей 29. Выражение FGR1 остались нетронутыми в раке груди опрошенных 29 и MCF-7 клетки продолжают выражать все 4 FGF рецепторы 30. В контексте покоя, FGF-2 экспортируется и в значительной степени на хранение на стромы костного мозга 31,32, где она функционирует в сохранении гемопоэтических стволовых клеток 33. Мы демonstrated, что FGF-2 индуцирует состояние покоя в ER + клеток рака молочной железы, культивированных на субстратах, фибронектина и обильной в мозге, где он вызывает морфологическую дифференциацию 7. В модели, клетки рака молочной железы являются рост ингибируется, инактивируют Rho A через RhoGAP Граф, чтобы повторно дифференцировать эпителиального фенотипа, и повторно экспресс интегринов α5β1 lost со злокачественной прогрессии. Они связывают фибронектин через интегринового α5β1 и активировать выживание понять, что делает их устойчивыми к цитотоксической терапии 7,8,15 (рис 1). Ингибирование Rho класса GTPases была продемонстрирована ранее, чтобы побудить покоя фенотипа 34.
Здесь мы будем наметить конкретные процедуры, которые позволят следователям установить модель и изучать конкретные молекулярные и клеточные механизмы, регулирующие дремоту ER + клеток рака молочной железы. В экспериментах, представленных здесь, чтобы проиллюстрировать использование моделиМы ориентировались на PI3K пути (рис 1B) с Akt ингибитора и ингибитора PI3K и всех членов семьи Ро (рис 1B) с ингибитором пан-Ро и (ROCK) ингибитора киназы Rho.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. клоногенности
- Подготовка одноклеточных суспензий из эстроген-зависимых линий клеток рака молочной железы MCF-7 и T47D клетки, используя шаги, описанные ниже
- Аспирируйте культуральную среду (DMEM / 10% тепла инактивированной фетальной телячьей сыворотки / глутамин и ручка / стрептококк) от 10 см культуре ткани блюдо, которое не больше, чем 50% сплошности с MCF-7 или Т-47D клетки. Промыть PBS. Инкубируйте трипсином 0,25% / 2,21 мМ ЭДТА, растворенного в DMEM высокий уровень глюкозы при 37 ° С в течение 1-4 мин.
- Проверьте клеток в 1-минутными интервалами под фазово-контрастного микроскопа, чтобы обеспечить единый распределение клеток. Ресуспендируют клеток с 2 мл пипетки с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз, чтобы сорвать межклеточных контактов для достижения почти неизменным, состояние одной клетки.
- Продолжали инкубировать клеток в трипсина при 37 ° С в течение 4 мин, если соблюдать скопления клеток после только 2-минутной инкубации. Не используйте эти клетки для клоногенных исследований, если они остаются приверженцами электроннойACH друга после 4 мин трипсинизации потому ошибка будет введен в выход номер колонии.
Примечание: Если клетки слипаются, количество колоний, образованных будет отражать продукт меньше клеток, чем количество инкубируют. Если клетки чрезмерно трипсином, их клоны потенциал может быть уменьшена. - Подготовка суспензии отдельных клеток 1500 клеток / мл культуральной среды в течение 24-луночных планшетах, или меньше, (+ 500 клеток / мл, в зависимости от типа клеток или числа пассажей), с помощью серийных разведений в одной мастер-пробирку, содержащую весь объем, необходимый для все переменные в эксперименте.
Примечание: Цель состоит в конечной плотности клеток 800 клеток / см 2 (диапазон приблизительно от 500 до 1100 клеток / см 2). Цель состоит в том, чтобы получить примерно 100 + 50 колоний, что позволяет относительно легко подсчета, предотвращает сгущение и позволяет достаточно колонии, чтобы привести к значительным статистических различий, когда колонии увеличивается или уменьшается на экспериментальной perturbaции.
- Инкубируйте клетки в клоногенных плотности с использованием шагов, описанных ниже
- Инкубируйте клетки в четырех скважин на 24-луночные покрытые фибронектином планшеты при плотности образующих клоны 1500 клеток / лунку с одной мастер-клеточной суспензии трубки 1500 клеток / мл. Растирают среду, содержащую клетки с 5 мл пипетки путем составления 3 мл и дозирования 1 мл среды в каждой из 2 скважин.
Примечание: фибронектин покрытием пластины должны быть приобретены предварительно покрытых с коммерческой поставщика. Лакокрасочные плиты за пределами качества контролируемой, автоматизированные результаты процесса в неровной поверхности непригодными для данного анализа. - Смешайте подвески с помощью пипетки вверх и вниз с 5 мл пипетки, составить 3 мл клеточной суспензии и заполнить 2 скважины с 1 мл каждого. Заполните только 2 скважины в любой момент времени из одного пипетки. Вернуться оставшийся объем в пипетку к клеточной суспензии в основной трубе, ресуспендирования клеток снова с помощью пипетки вверх и вниз и составить еще 3 мл, чтобы заполнить еще 2 WELLs с 1 мл каждого.
Примечание: Непрерывное перемешивание основной трубы необходим, потому что клетки непрерывно осаждаются. Составление достаточный объем, чтобы заполнить только 2 скважины необходимо добавить аналогичные количества клеток в каждую лунку, потому что клетки оседают в пипетку, а также. - Работать быстро, чтобы распространять большие объемы клеток, потому что позволяет клеткам сидят в суспензии при комнатной температуре и концентрации СО 2 будет модулировать их клоны (потенциальных неопубликованные наблюдения).
- Оптимизация пространственного распределения клеток во время акта пипетки их в лунки для колонии анализов. У так медленно пипетки суспензии, содержащей конечную концентрацию клеток в середине скважины. Не подвергайте пластины для дальнейшего движения, прежде чем клетки оседают на дно. Не водоворот пластины, потому что круглая смешивание эффективно центрифуги клетки по периметру хорошо, создающих высокой плотности клеток и бесчисленных сливающихся колоний на 6 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не смешивать, если необходимо, так как это менее желательно, чем без перемешивания вообще после введения объем с клетками в суспензии. Если это необходимо смешать клетки, сделать так, перемещая пластину назад и вперед в перпендикулярных направлениях, пока он опирается на плоской поверхности. - Инкубируйте клетки при 37 ° C 5% CO 2 без изменения медиа в течение 6 дней. Небольшое количество клеток в хорошо после 6 дней не будет существенно влиять на состав питательных веществ или цитокинов, ни рН исходной среды.
- Конструкция временной ход анализа следующим образом: Инкубируют клетки на фибронектина покрытием субстратов на день 1. Заменить существующий среду с 1 мл свежей среды или свежую среду, содержащую FGF-2 10 нг / мл в день 0. Stain клеток, как показано ниже на 6-й день в 1.4). Провести никаких экспериментальных возмущения на 3 день, как показано ниже в 1.3).
- Инкубируйте клетки в четырех скважин на 24-луночные покрытые фибронектином планшеты при плотности образующих клоны 1500 клеток / лунку с одной мастер-клеточной суспензии трубки 1500 клеток / мл. Растирают среду, содержащую клетки с 5 мл пипетки путем составления 3 мл и дозирования 1 мл среды в каждой из 2 скважин.
- Настройка Экспериментальные Возмущения молекулярной сигнализации или адгезионной молекул
- На 3-й день, добавить 10056; л раствора, содержащего 10 раз конечного предполагаемого концентрации возмущающего агента в среде 1 мл в лунки. Не смешивать. Продолжали инкубировать клетки при 37 ° С, 5% СО 2 в течение дополнительных 3 дней.
Примечание: возмущенные агентов могут включать в себя различные ингибиторы и блокирующие агенты молекул адгезии, рецепторы или других поверхностных белков, ингибиторов внутриклеточных сигнальных путей, молекул факторов, кофакторов или структурных белков, которые могут играть роль в поддержании состояния покоя. - Пятно колонии на 6 день, как следует.
- На 3-й день, добавить 10056; л раствора, содержащего 10 раз конечного предполагаемого концентрации возмущающего агента в среде 1 мл в лунки. Не смешивать. Продолжали инкубировать клетки при 37 ° С, 5% СО 2 в течение дополнительных 3 дней.
- Пятно Колонии
- Пятно клетки через 6 дней в культуре с свежеприготовленного 0,1% кристаллическим фиолетовым в 2% этанола / 10 мМ бората натрия (рН 9,0) раствора. Аспирируйте информации и добавить один мл раствора кристаллическим фиолетовым в каждую лунку в течение 20 мин.
- Вымойте тарелки, погружая их отверстия также вниз под острым углом в ведерке со льдом переполнены постоянно работающего кранавода в раковине. Наклоните плиту к горизонтальным углом раз водой, а открытие вниз, а затем наклонить назад, чтобы острым углом при удалении в одной нежной плавного движения.
- Повторите погружения 2 или 3 раза, пока вода на дне лунок уже не синий. Энергичные смывки может удалить клетки или колонии, которые являются менее прилипший-за экспериментальной вмешательства, добавляя значительный вклад в ошибку в подсчете и данных.
- Сухие пластины на ночь, размещая их с ног на голову на полотенцах на скамейке верхней, прилегающей к их соответствующих меченых крышками.
- Граф колонии
- Подсчитайте количество растущих и спящих колоний в каждой лунке после 6 дней инкубации, окрашивания и сушки. Количество колоний оптимально при 40-кратном увеличении в перевернутом фазово-контрастного микроскопа. Граф колонии> 30 клеток, растет и колоний 12 или меньше ячеек, с морфологической появления очень большого размера по сравнению с ростом клеток, большой EXPanded цитоплазма с большим цитоплазме к ядру отношения, показанные на рисунке 1 7,15.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кластеры 13-29 клеток обычно не учитываются, поскольку они не очень часто в простых неактивности анализов. Они могут быть подсчитаны, если возмущения переложить потенциал роста либо растущих или спящих клеток. Эти результаты будут затем должны быть соотнесены с биологической значимости.
- Подсчитайте количество растущих и спящих колоний в каждой лунке после 6 дней инкубации, окрашивания и сушки. Количество колоний оптимально при 40-кратном увеличении в перевернутом фазово-контрастного микроскопа. Граф колонии> 30 клеток, растет и колоний 12 или меньше ячеек, с морфологической появления очень большого размера по сравнению с ростом клеток, большой EXPanded цитоплазма с большим цитоплазме к ядру отношения, показанные на рисунке 1 7,15.
2. клоногенных Инкубационный для иммунофлюоресценции
- Отрегулируйте число клеток примерно 7,500-8,000 клеток / лунку в 6-луночные планшеты, чтобы соответствовать клеток число / площадь поверхности, аналогичный 24 а экспериментов.
- Поставьте раунд, стерильный, фибронектина покрытием покровное в каждую лунку базе 6-луночные планшеты для обработки изображений исследования до того клеток. Внесите клетки в 3 мл объемах в каждую лунку 2 скважины за один раз при концентрации описано, как описано для экспериментов клоногенные выше в 1.2).
- Инкубируйте клеткив течение 6 дней, как указано выше, в 1.2.4 и 1.2.5. Добавить возмущающих факторов на 3 день в 10х концентрации в 300 мкл объемы, как описано в процедурах анализа колоний в 1.3).
- Пятно клетки на 6-й день с антителами к клеточным молекул адгезии, таких как интегрины α4, α5, α6, β1, β3, например, фокусное адгезии сложных молекул, FAK и паксиллина винкулина, например, белки, участвующие в подвижности, такие как α-тубулина, Например, члены сигнализации Pathway такие как фосфо-Akt, фосфо-ERK, фосфо-р38, фосфо-JNK, например, или любой другой белок, который является объектом исследования для его роли в покое, с использованием стандартных методик для прямого или косвенного иммунофлюоресценции окрашивание.
- Удалить слайды с пинцетом день 6. Fix в ацетоне / метанол 1: 1 при температуре -20 ° C в течение 20 мин и сухой воздух. Альтернативный фиксатор, такой как параформальдегид, могут быть использованы, если это необходимо. Проницаемыми клетки с 0,1% тритона Х-100, 0,1% цитрата натрия в течение 2 мин Fили определение внутриклеточных антигенов. Промыть клетки с PBS.
- Для непрямого окрашивания immunofluorecence, блок слайдов в течение 1 часа при комнатной температуре с 5% BSA или с 10% сыворотки преиммунной видов, в которых сформировался вторичное антитело.
- Выдержите в течение ночи при 4 ° С с первичными антителами к клеточным молекул адгезии, координационные сложные молекулы, сигнализируя членов пути или любой другой белок, который мишенью следствия по своей роли в покое, разбавленного до конкретных разведения рекомендованные производителем в PBS 0,1% Тритон Х -100.
- Промыть 3 раза ЗФР. Инкубируйте покровные стекла с флуорофор-конъюгированного антитела при комнатной температуре в течение 2 часов. В качестве примера, Alexa Fluor 488 осел анти-мышь IgG антител может быть использован для обнаружения мышиного моноклонального первичного антитела. Гора покровные сторону клеток вниз на стеклах использованием antifade агента с Dapi. Печать периметров с лаком для ногтей.
- Для прямой иммунофлюоресценции, проводить BSAблокирования, как описано выше в разделе 2.4.2), инкубируют с конъюгированным с флуорофор первичного антитела в течение ночи при 4 ° С. Промыть 3 раза ЗФР. Инкубируйте слайды с antifade агента и Dapi и печатью с маникюром.
- Лотки крышка слайд с алюминиевой фольгой и хранят при температуре 4 ° C для визуализации и фотографии в любое время до нескольких недель. Посмотреть и сфотографировать клетки, используя любые флуоресценции микроскопических систем визуализации оснащен камерой на 1,000x увеличением.
- Для фибриллярного актина окрашивания, блок скользит в 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в течение 30 мин и инкубируют в BODIPY FL-Phallacidin (зеленый) или родамин-фаллоидином (красный) при комнатной температуре в течение 20 мин. Добавить antifade агента и герметизации, как описано выше.
3. клоногенных Инкубационный для молекулярных исследований
- Вестернблоты
- Выдержите ER + клеток рака молочной железы MCF-7 или T47D на клоногенных плотности 20000 клеток / 60 мм пластины и 50000 клеток / 100 мм пластины на fibronecлуженые пластин при 37 ° С в 5% СО 2.
- Инкубируйте клетки при слегка более высокой плотности клеток 75000/100 мм пластины для молекулярных исследований, требующих мг суммы для белка из лизатов. Используйте до десяти пластин в экспериментальной точки для сбора достаточно белка для молекулярных исследований с использованием западных помарки или для выделения РНК для северных пятнами.
- Число клеток на основе геля нагрузка необходимым дополнением для сравнения экспрессии белка в совершенно разных размеров растет и спящих клеток. Собирают клетки trypsinizing и аликвоту рассчитывать с помощью гемоцитометра в 0,2% трипановым синим для приготовления лизатов для вестерн-блоттинга вместо соскабливания клеток с одной режущей кромкой.
- Центрифуга клетки при 10000 х г в течение 2 мин, удалить носитель путем аспирации, добавл ют 200 мкл буфера для лизиса, разрушать ультразвуком клеток в буфере для лизиса и определения концентрации белка.
- Рассчитать количество белка в клетке путем деления выход белка на число клетокчто генерируется эту сумму. Загрузка лизата в каждую лунку отдельных полиакриламидном геле, который представляет собой и) эквивалентных количеств белка и б) белка количествах, представляющих эквивалентные количества клеток. По крайней мере, 25 мкг белка должны быть загружены в каждую лунку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит сравнивать между растущими и спящих клеток, которые значительно отличаются по размеру и содержанию белка (рис 1).
- Проточной Цитометрии
- Сбор клеток из 100 мм пластин трипсинизацией, как в 3.1 и анализировать с помощью стандартного флуоресценции активированного сортировки клеток (FACS), используя протоколы первичную или вторичную иммунофлуоресцентного либо для внутриклеточных или внеклеточных антигенов, как указано в 2.4.
Примечание: Отсоединение клеток из тканевой культуры пластин обработкой трипсином, не влияет на концентрацию мембранных белков, как определено маркировки антител.
- Сбор клеток из 100 мм пластин трипсинизацией, как в 3.1 и анализировать с помощью стандартного флуоресценции активированного сортировки клеток (FACS), используя протоколы первичную или вторичную иммунофлуоресцентного либо для внутриклеточных или внеклеточных антигенов, как указано в 2.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эксперименты проводились резюмировать анализа. Временной ход эксперимента показан на рисунке 2А. Клетки инкубировали при плотности образующих клоны в день -1, FGF-2 в свежей среде добавляют в день 0 и клетки культивируют до 6-й день, когда они окрашивают и колонии подсчитывают. Любые возмущения в системе вводят в день 3 в 100 мкл объемы в 10х конечных концентраций желании. 2В демонстрирует типичный вид растущих колоний и неактивных. Растущие колонии содержат> 30 клеток и спящие колонии содержат 12 или менее клеток, которые во много раз больше, чем растущие клетки с большими коэффициентами цитоплазма / ядра. Рисунок 2C демонстрирует типичный экспериментальный результат проведенного в четырех. Преобладающий распределение клеток без добавления FGF-2 представлена растущих клонов в то время, в присутствии FGF-2, подавляющее большинство клонов находятся в состоянии покоя.
ontent "> Рисунок 3 является примером эксперимента, в котором были добавлены возмущающих агентов на 3 день цифра представляет собой зависимое от дозы ингибирование неактивных клонов путем ингибирования семейства Rho из GTPases по пан-ингибитором Rho С3-трансферазы и Ро-киназы (ROCK) ингибитор Y27632. Анализ может оценить ED 50 добавленных ингибиторов на неактивных клонов, а также растущих клонов. В этом эксперименте, эффект от растущих клонов не определен, так как это было только для иллюстрации методики.Фигуры 4 и 5 показывают, что анализ может быть использован для оценки комбинированных эффектов ингибиторов на выживание неактивных клонов. Наши предыдущие исследования показали, что пути PI3K претерпевает устойчивый активации в покоящихся клеток в этой модели и ингибирование PI3K как и Akt частично ингибирует выживание неактивных клонов 7. Вот предварительные наблюдения, показали, тшляпа неспецифический ингибирование семьи Ро малых GTPases также частично ингибирует выживание спящих клонов. Данные, представленные на фигурах 4 и 5 показывают, что сочетание ингибирования PI3K и один из его последующих эффекторов, AKT, с ингибированием семейства Rho с С3-трансферазы и ингибитора ROCK может почти полностью исключить выживание неактивных клонов, в некоторых обстоятельствах. Ранее мы уже показали, что спящие клонов выживших ингибирование PI3K, но не Akt состоят из клеток, которые уже не проявляют дремлющую фенотип, а появляются мезенхимальные и проблемных 7. Клетки спящих клонов, в которых семья Ро был широко подавляется C3 трансферазы и ингибитор ROCK также теряют типичную покоя внешний вид, предположим, fibrolastoid выступлений и взъерошенные мембраны, а также появляются огорчил (рисунок 6). Эти эксперименты показывают, что модель может быть запрошена в очень ширOAD образом, чтобы достичь понимания элементов, которые управляют покоя и устойчивость к терапии.
Рисунок 1: механизмы, регулирующие нашу в пробирке покоя модели (А) Выращивание и бездействующие MCF-7 после того, как клоны 6 дней инкубации при плотности образующих клоны на фибронектина покрытием пластин с и без FGF2 10 нг / мл 7 (увеличение в 100 раз).. (Б) Основная схема с изложением данных, что FGFR и интегрина α5β1 параллельно устойчивое состояние сигнализации необходимо активировать и поддерживать покоя 7. FGF-2 активирует циклинзависимой ингибиторов киназы в результате чего G1 сердца 21, активирует ERK 8 и PI3 киназы 7, что initiatesurvival сигнализации и активируют интегрин α5β1 7, который достигает устойчивого состояния после нескольких дней. Двойной через в сигнализациич FGFR через PI3K и независимо через перевязки интегринового α5β1 по фибронектина необходимы для активации FAK и локализации мембраны и активации RhoA GAP GRAF 15. Это приводит к инактивации RhoA и разрешительной стационарном состоянии корковой перестройкой F-актина (фаллоидином окрашенных микрофотография), эпителиальной повторного дифференцирования и покоя 15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Элементы в пробирке покоя анализа () Схема височных компонентов покоя анализа.. Клетки инкубируют на фибронектина покрытием тканевых культур пластин в клоногенном плотности, при максимальной плотности 1500 клеток / лунка 24-луночного планшета в Incubator при 37 ° С и 5% СО 2 в день 1. Среду заменили на день 0 свежей средой или свежую среду, содержащую FGF-2 10 нг / мл и клетки повторно инкубировали. Клетки окрашивали кристаллическим фиолетовым раствором, как описано, на день 6. Любой ингибиторы или возмущений агенты добавляют в день 3 в 100 мкл объемах в 10х желаемой концентрации, и клетки не будут повторно инкубировали до 6 день (B) появление окрашенных растет и спящие MCF-7 колонии. Растущие колонии содержат> 30 клеток и спящие колонии содержат 12 или менее ячеек. Спящие клетки блин форме, во много раз больше, чем растущие клетки с большими коэффициентами цитоплазма / ядра. (Увеличение в 100 раз). (С) диаграмму, демонстрирующую клоногенных потенциал 1500 MCF-7 человека раковых клеток молочной железы, инкубированных с и без FGF-2 10 нг / мл фибронектина на покрытых 24-луночных планшетах. Без FGF-2, преобладающий распределение клеток представлена растущих клонов, а в присутствии FGF- 2 Подавляющее большинство клонов находятся в состоянии покоя. Эксперименты проводились в четырех. (Бары ошибках + SD)
Рисунок 3: дозозависимое ингибирование неактивных клонов пан-Rho семейства ингибиторов трансферазы C3 и ингибитор ROCK Y27632 T-47D клетки инкубировали в клоногенном плотности 1000 клеток на лунку на 24-луночные планшеты, покрытые фибронектином с FGF-2. 10 нг / мл в течение 6 дней. Медиа, С3-трансферазы 3 или 5 мкг / мл, и ингибитор ROCK Y27632 0,1, 1 или 10 мкг / мл были на 3-й день и бездействующие клоны рассчитывали на день 6. На графике показывает зависимое от дозы ингибирование окрашенных неактивных клонов на День 6. ED 50 С3 составляла примерно 3 мкг / мл в то время как ингибитора порода между 1 и 10 мкм в этом анализе. Эксперименты проводились в четырех. (Бары ошибках + SD)
Фигура 4:. Комбинированные эффекты пан-Ро ингибитора семейства С3 с Akt ингибитора или с PI3 киназы ингибитора на выживаемость неактивных клонов Т-47D Т-47D клетки инкубировали в клоногенном плотности 1000 клеток на лунку на 24-луночных фибронектин -покрытие пластины с FGF-2 10 нг / мл в течение 6 дней. Медиа, С3-трансферазы 5 мкг / мл, Акт ингибитора 25 мкм и 20 мкм LY294002 были добавлены по отдельности или в комбинации на 3-й день и неактивных клонов были подсчитаны в день 6. Комплексное воздействие C3 и ингибитор AKT-видимому, добавка в них Концентрации но объединенные эффекты C3 и ингибитор PI3K, кажется, синергетический в этих экспериментах на ингибирование покоя выживания клона. Эксперименты проводились в четырех. (Бары ошибках + SD)
= "Рисунок 5" SRC = "/ файлы / ftp_upload / 52672 / 52672fig5.jpg" />
Фигура 5:. Комбинированные эффекты ингибитора ROCK Y27632 с Akt ингибитора или с PI3 киназы ингибитора на выживаемость неактивных клонов Т-47D Т-47D клетки инкубировали в клоногенном плотности 1000 клеток на лунку на 24-луночные планшеты, покрытые фибронектином с FGF-2 10 нг / мл в течение 6 дней. Средства массовой информации, ингибитор ROCK Y27632 3 мкг / мл, Акт ингибитора 25 мкм и 20 мкм LY294002 были добавлены по отдельности или в комбинации на 3-й день и спящих клонов подсчитывали в день 6. Совокупное воздействие Y27632 АКТ и ингибитора не кажутся добавка при этих концентрациях, но объединенных эффектов Y27632 и ингибитора PI3K, кажется, больше, чем добавки в этих экспериментах на ингибирование покоя выживания клона. Эксперименты проводились в четырех. (Бары ошибках + SD)
.jpg "/>
Рис. 6: Внешний вид живых неактивных клонов Т-47D после обработки С3-трансферазы и ингибиторов ROCK Y27632 Colony анализы были установлены в четырех 24 и фибронектин покрытием планшеты для тканевых культур при 1000 клеток / лунку с FGF-2, как описано, ингибиторы были добавлены в день 3 в концентрациях, показанных клетки окрашивали и фотографировали на 6 день клетках, обработанных ингибиторов пан-Rho семьи потеряли их распространение вид, стал мал, дендритные и появились тесно. (Увеличение в 100 раз).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наша модель состоит из нескольких ключевых элементов покоя в костном мозге. Он состоит из эстрогена чувствительные клетки, которые являются тип вероятно, будет оставаться в состоянии покоя в мозге в течение длительных периодов 10, она состоит из фибронектина, ключевой структурный элемент мозга, FGF-2, фактор роста обильно синтезированного стромы костного мозга и в значительной степени на хранение во внеклеточном матриксе костного мозга и 31,32 инкубации клеток в клоногенном плотности, где их взаимодействие в первую очередь с субстратом. В то время как микросреда костного мозга является гораздо более сложным, это простая система может быть построена с максимально добавленной сложности, необходимо задать конкретные вопросы механистические.
Модель может быть использована для сравнения покоя с ростом клеток в ряде способами, в том числе биологические методы клеток, молекулярные методы и в методы естественных условиях. Сотовые фенотипы могут быть проанализированы путем повторного клонирования, подвижностьи вторжение изучает 35, прилипших опухоли начала формирование шарик 36 или функциональные исследования взаимодействия с микросреды с использованием конкретных блокирующие антитела или пептиды 7.
Первичный выход клоногенности является числовым подсчет колоний, либо растет или покоя, который переводит с растущей или неактивном клоногенном потенциала клеток. Как указано выше, большое количество переменных имеют потенциал воздействия на этот результат, все из которых должны контролироваться так строго, как это возможно, чтобы получить воспроизводимые результаты. Они включают источник клеток, общее количество проход, метод криоконсервации и качество клеточных культур, которые были криоконсервированных, количество проходов с момента оттаивания, слияние культур, из которых были получены единичные препараты клеток, источник и качество фетальной телячьей сыворотки, длительности обработки трипсином и их воспроизводимость, длительностьклеток, оставшихся при комнатной температуре, ловкость пипетки эквивалентные количества клеток в каждую лунку, ловкости или равномерно распределяя клетки по всей поверхности хорошо, несколько раз пластина удаляется из инкубатора для наблюдения, среди десятков др. В дополнение к представляющих общепринятые контроль качества тканевой культуры, эти переменные влияют на дремлющую клоногенных потенциал от эксперимента к эксперименту. Intra-экспериментальная вариабельность, как правило, меньше, чем 8-10%, тем не менее, в результате чего процентных изменений от эксперимента к эксперименту, который высокой воспроизводимостью. Как правило, дисперсия данных начинает уменьшаться с прямой корреляции повышенной опыта экспериментатора с системой и времени, затраченного проведении этого анализа.
Экспрессия генов в покоящихся и растущих клеток может быть оценена с помощью ПЦР, Северной блот, Вестерн-блоттинга, иммунопреципитации / Западная и функциональный комплекс осадков / Западной, Иммунофлюоресценции или иммуногистохимического, мультиплексирование по микрофлюидики, спектроскопия комбинационного рассеяния, проточной цитометрии и другие методы. Эти методы могут быть использованы для определения роли специфических рецепторов, других мембранных белков, сигнальных путей, факторы транскрипции, гистонов модификаторов, органелл и митохондриальных белков, метаболических путей и утилизации энергии, напряжения и силы и взаимодействия с микросреде в бесчисленных вариантах на Роль покоя.
Наши предыдущие исследования показали значительную роль для PI3K путей в выживании неактивных клонов 7, а также в сохранении покоя фенотип с эпителиальной распределения кортикального актина 15. Мы также показали, что RhoA частности, должны быть подавлена для того, чтобы в состоянии покоя фенотип должен быть активирован. Это в отличие от данных, представленных здесь, где инактивация семейства Rho с пан-ингибиторов уменьшает выживаемость неактивных клонов. Тего подчеркивания опасности использования химических ингибиторов рассекать механизмы и необходимость использования генетических подходов для ингибирования или активации определенных путей. С этой целью, методология поддается генетической манипуляции клеток, либо путем трансфекции постоянного или трансдукции или путем кратковременной трансфекции 15, миРНК или наночастиц. Так анализ 6 дней в продолжительности, переходных экспрессии генов или вмешательства это приведет к значительным фенотипических эффектов при 6 дней, которые можно измерить.
Признавая потенциал для изучения механизмов ввода, а также выхода из состояния покоя, мы в настоящее время расследует механизмы эти клетки, чтобы избежать покоя. При вводе покоя плохо понимал, понимание механизмов, регулирующих выход из состояния покоя даже более неуловимым. Мы сообщили предварительные наблюдения, воспалительные реакции по травмированной стромы может способствовать пробуждению дорMANT MCF-7 клетки с помощью этой модели 37. Модель может быть применена к Т-47 клеток, а также, другой ER + рак молочной линии раковых клеток. В то время как ER-клетки не становятся пассивными в ответ на FGF-2, это может быть возможным, чтобы адаптировать методологию к другим типам раковых клеток с различными агентами дифференциации в дальнейших исследований.
Несмотря на то, весьма полезным метод выявления ключевой механизм участвует в покое, она остается модель в пробирке. Однако клетки, которые подверглись покоя или в пробирке манипуляции могут быть проверены на опухоли ксенотрансплантата формирование потенциала. Основная потенциальная выгода от системы, однако, является выявление механизмов, которые позволят развитие гипотезы, которые могут быть проверены в очень сложных в естественных условиях модели неактивности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Поддерживаемые Департаментом обороны Гранты DAMD17-01-C-0343 и DAMD17-03-1-0524, Государственная комиссия Нью-Джерси по исследованиям рака 02-1140-CCR-E0 и Рут Гольдберг Эстрин Мемориал по исследованию рака (RW)
Acknowledgments
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF-7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| T47D cells | ATCC | HTB-123 | |
| BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate | Corning | 354411 | |
| BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes | Corning | 354403 | |
| BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes | Corning | 354451 | |
| BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin | Corning | 354088 | |
| 6 Well tissue culture plate | CellTreat | 229106 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder | Corning Life Sciences | 50-013-PB | |
| Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum | Serum Source International | FB02-500HI | |
| 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-CI | |
| L-Glutamine, 100x, Liquid | Corning | 25-005-CI | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate) | CalBiochem | 124005 | |
| LY294002 | CalBiochem | 19-142 | Chenical PI3K inhibitor |
| C3 transferase | Cytoskeleton | CTO3 | Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1 |
| Y-27632 dihydrochloride | Santa Cruz Biotechnology | 129830-28-2 | |
| BODIPY FL-Phallacidin (green) | Molecular Probes | B607 | Fluorochrome for fibrillar actin staining |
| BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red) | Molecular Probes | R415 | Fluorochrome for fibrillar actin staining |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent | Molecular Probes | R37114 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Molecular Probes | P-36931 |
References
- Braun, S., et al. Cytokeratin-positive cells in the bone marrow and survival of patients with stage I, II, or III breast cancer. N Engl J Med. 342 (8), 525-533 (2000).
- Benoy, I. H., et al. Relative microvessel area of the primary tumour, and not lymph node status, predicts the presence of bone marrow micrometastases detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction in patients with clinically non-metastatic breast cancer. Breast Cancer Res. 7 (2), R210-R219 (1186).
- Wapnir, I. L., Barnard, N., Wartenberg, D., Greco, R. S. The inverse relationship between microvessel counts and tumor volume in breast cancer. Breast J. 7 (3), 184-188 (2001).
- Wyckoff, J. B., et al. A critical step in metastasis: in vivo analysis of intravasation at the primary tumor. Cancer Res. 60 (9), 2504-2511 (2000).
- Phadke, P. A., et al. Kinetics of metastatic breast cancer cell trafficking in bone. Clin Cancer Res. 12 (5), 1431-1440 (2006).
- Braun, S., et al. Lack of an effect of adjuvant chemotherapy on the elimination of single dormant tumor cells in bone marrow of high risk breast cancer patients. J Clin Onc. 18 (1), 80-86 (2000).
- Korah, R., Boots, M., Wieder, R. Integrin α5β1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer Res. 64 (13), 4514-4522 (2004).
- Najmi, S., Korah, R., Chandra, R., Abdellatif, M., Wieder, R. Flavopiridol blocks integrin-mediated survival in dormant breast cancer cells. Clin Cancer Res. 11 (5), 2038-2046 (2005).
- Braun, S., et al. A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer. N England J Med. 353 (8), 793-802 (2005).
- Dent, R., et al. Triple-negative breast cancer: clinical features and patterns of recurrence. Clin Cancer Res. 13 (15 Part 1), 4429-4434 (2007).
- Kim, R. S., et al. Dormancy signatures and metastasis in estrogen receptor positive and negative breast cancer. PLoS One. 7 (4), e35569 (2012).
- Hanin, L. Seeing the invisible: how mathematical models uncover tumor dormancy, reconstruct the natural history of cancer, and assess the effects of treatment. Adv in Exp Med & Biol. 734, 261-282 (2013).
- Wilkie, K. P. A review of mathematical models of cancer-immune interactions in the context of tumor dormancy. Adv in Exp Med & Biol. 734, 201-234 (2013).
- Barkan, D., Green, J. E. An in vitro system to study tumor dormancy and the switch to metastatic growth. J Vis Exp. (54), e2914 (2011).
- Barrios, J., Wieder, R. Dual FGF-2 and intergrin α5β1 signaling mediate GRAF-induced RhoA inactivation in a model of breast cancer dormancy. Cancer Microenvironment. 2 (1), 33-47 (2009).
- Ganapathy, V., et al. Luminal breast cancer metastasis is dependent on estrogen signaling. Clin & Exp Metastasis. 29 (5), 493-509 (2012).
- Barkan, D., et al. Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton. Cancer Res. 68 (15), 6241-6250 (2008).
- Ghajar, C. M., et al. The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nat Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).
- Marshall, J. C., et al. Effect of inhibition of the lysophosphatidic acid receptor 1 on metastasis and metastatic dormancy in breast cancer. J Nat Cancer Inst. 104 (17), 1306-1319 (2012).
- Almog, N. Genes and regulatory pathways involved in persistence of dormant micro-tumors. Adv in Exp Med & Biol. 734, 3-17 (2013).
- Wang, H., et al. Basic FGF causes growth arrest in MCF-7 human breast cancer cells while inducing both mitogenic and inhibitory G1 events. Cancer Res. 57 (9), 1750-1757 (1997).
- Fenig, E., et al. Role of transforming growth factor beta in the growth inhibition of human breast cancer cells by basic fibroblast growth factor. Breast Cancer Res Treat. 70 (1), 27-37 (2001).
- Fenig, E., et al. Basic fibroblast growth factor confers growth inhibition and Mitogen-activated Protein Kinase activation in human breast cancer cells. Clinical Cancer Research. 3 (1), 135-142 (1997).
- Coleman-Krnacik, S., Rosen, J. M. Differential temporal and spatial gene expression of fibroblast growth factor family members during mouse mammary gland development. Molecular Endocrinology. 8 (2), 218-229 (1994).
- Plath, A., et al. Expression and localization of members of the fibroblast growth factor family in the bovine mammary gland. J Dairy Science. 81 (10), 2604-2613 (1998).
- Lavandero, S., Chappuzeau, A., Sapag-Hagar, M., Oka, T. In vivo and in vitro evidence of basic fibroblast growth factor action in mouse mammary gland development. FEBS letters. 439 (3), 351-356 (1998).
- Sinowatz, F., Schams, D., Plath, A., Kolle, S. Expression and localization of growth factors during mammary gland development. Adv in Exp Med & Biol. 480, 19-27 (2000).
- Korah, R., Sysounthone, V., Scheff, E., Wieder, R. Intracellular FGF-2 promotes differentiation in T47-D breast cancer cells. Biochem Biophys Res Comm. 277 (1), 255-260 (2000).
- Korah, R., Das, K., Lindy, M. E., Hameed, M., Wieder, R. Co-ordinate loss of FGF-2 and laminin 5 expression during neoplastic progression of mammary duct epithelium. Human Pathology. 38 (1), 154-160 (2007).
- Wieder, R., et al. Overexpression of basic fibroblast growth factor in MCF-7 human breast cancer cells: lack of correlation between inhibition of cell growth and MAP kinase activation. J. Cellular Physiology. 177, 411-425 (1998).
- Brunner, G., Gabrilove, J., Rifkin, D. B., Wilson, E. L. Phospholipase C release of basic fibroblast growth factor from human bone marrow cultures as a biologically active complex with a phosphatidylinositol-anchored heparan sulfate proteoglycan. J Cell Biol. 114 (6), 1275-1283 (1991).
- Wilson, E. L., Rifkin, D. B., Kelly, F., Hannocks, M. J., Gabrilove, J. L. Basic fibroblast growth factor stimulates myelopoiesis in long-term human bone marrow cultures. Blood. 77 (5), 954-960 (1991).
- Gupta, P., McCarthy, J. B., Verfaillie, C. M. Stromal fibroblast heparan sulfate is required for cytokine-mediated ex vivo maintenance of human long-term culture-initiating cells. Blood. 87 (8), 3229-3236 (1996).
- Chatterjee, M., van Golen, K. L. Farnesyl transferase inhibitor treatment of breast cancer cells leads to altered RhoA and RhoC GTPase activity and induces a dormant phenotype. Int J Cancer. 129 (1), 61-69 (2011).
- Korah, R., Sysounthone, V., Golowa, Y., Wieder, R. Basic fibroblast growth factor confers a more differentiated phenotype in MDA-MB-231 human breast cancer cells. Cancer Res. 60 (3), 733-740 (2000).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Tivari, S., Lu, H., Dasgupta, T., Wieder, R. Reactivation of dormant estrogen-dependent breast cancer micrometastases by bone marrow stromal injury in an in vitro model of dormancy. Proceedings of the 105th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research. , AACR. San Diego, CA. Philadelphia (PA). (2014).
