Introduction
des cellules de cancer du sein à métastases de la moelle osseuse avant que la maladie est détectable 1, dès que les tumeurs se développent de petits vaisseaux sanguins 2,3. Le processus métastatique est rapide, mais inefficaces. Cellules entrent dans les nouveaux vaisseaux sanguins rapidement, à des millions par jour 4 mais peu survivent au voyage à des organes éloignés 5. Néanmoins, certains micrométastases survivre dans l'os et peuvent être trouvés comme des cellules individuelles ou de petits amas de cellules dans les ponctions de moelle osseuse de patients nouvellement diagnostiqués 1. Ces cellules résistent à la chimiothérapie adjuvante, qui est administré par l'objet même de les éliminer 6. Cette résistance est dotée, sensiblement, par la survie de signalisation initiée par les interactions avec le microenvironnement de la moelle osseuse 7,8. Micrométastases peuvent être trouvés dans environ un tiers des femmes atteintes du cancer du sein localisé et représentent un indicateur indépendant de survie lorsqu'il est analysé par analyse univariée 9. Certains micrometastases sont la croissance amorcée, mais les schémas de récidive dépendent du type de cellule. Les patients atteints de cancer du sein triple négatif ont tendance à réapparaître entre 1 à 4 ans, ce qui suggère un mauvais contrôle de l'état de dormance. Autres types de cellules, y compris ER / PR + cellules, peuvent rester en dormance pendant jusqu'à 20 ans, avec un taux stable et continu de récidive 10. Alors que les différences de dormance signatures d'expression génique entre ER + et RE- lignes et les tumeurs des cellules mammaires reflètent différents potentiels de dormance 11, les interactions avec le stroma de la moelle osseuse représentent probablement une contribution significative à la dormance.
L'étude de dormance in vivo est exceptionnellement difficile parce micrométastases sont rares et sont plus nombreux que les cellules hématopoïétiques de plus de 10 6 -fois. Par conséquent, les modèles concernés doivent être générés qui fournissent des données in vitro qui peuvent proposer des mécanismes et générer des hypothèses testables in vivo. Un certain nombre de modèles de dormance, y compris mathe12,13 matiques modèles, des modèles in vitro, in vivo 7,8,14,15 modèles de xénogreffe, des combinaisons de 16 in vitro et des modèles de xénogreffes 17,18 et modèles spontanés de métastases tumorales et 19, ont donné un aperçu de la dormance des cellules cancéreuses 20 . Chacun de ces modèles ont leurs propres limites et sont d'eux-mêmes principalement utile pour générer des hypothèses en ce qui concerne la signalisation moléculaire et interactions qui régissent la dormance à tester dans des modèles plus biologiquement pertinentes.
Avec l'objectif général de définir les mécanismes moléculaires de la dormance, les interactions avec le microenvironnement qui se traduit par l'arrêt du cycle, redifférentiation et de résistance et mécanismes thérapeutique qui résultent de la récidive dans ER + cellules, nous avons développé un modèle in vitro qui fournit sélectionné les éléments pertinents de la microenvironnement stromal 7. Ce modèle, bien que relativement rares dans sa composants, est suffisamment robuste pour permettre aux enquêteurs de déterminer des mécanismes moléculaires spécifiques qui affectent les fonctions importantes de dormance. Ces expériences génèrent des hypothèses qui peuvent être directement testés in vivo. Le modèle repose sur quelques éléments clés que nous avons démontré pour être pertinent dans la dormance. Elles comprennent l'utilisation de cellules de cancer du sein oestrogéno-dépendants, la culture de cellules à une densité clonogénique où leur interaction est principalement avec le substrat et les composants solubles du milieu, un substrat de la fibronectine et de la présence de facteur de croissance basique des fibroblastes (FGF-2) dans le milieu.
Nous avons caractérisé les mécanismes qui régissent le système in vitro, y compris l'induction de l'arrêt du cycle cellulaire par le FGF-2 21, à médiation par 22 le TGFß, la survie par l'intermédiaire de signalisation PI3 kinase ERK 7,8 et 8 et de la différenciation morphogénétique à un phénotype épithélial, qui dépendait RhoA inactivation, l'intégrine45; 5β1 régulation à la hausse et la ligature de stroma pour la survie de la fibronectine 7,15 (Figure 1). Les effets du cycle cellulaire in vitro de FGF-2 sur les cellules MCF-7 commencent à des concentrations d'au moins un log-dessous de 10 ng / ml 21,23. Le raisonnement était basé sur le contrôle temporel de FGF-2 expression régissant mammaire morphogenèse canalaire, l'expansion cyclique et la récession dans un certain nombre de systèmes de mammifères 24-27. Nous avons démontré que le FGF-2 induit la différenciation, y compris la morphogenèse canalaire in culture 3D 28, et que le FGF-2 expression sont généralement perdue avec la transformation maligne des tumeurs humaines 29. L'expression de FGR1 resté intact dans les carcinomes mammaires interrogés 29 et MCF-7 cellules continuer à exprimer les 4 récepteurs FGF 30. Dans le contexte de la dormance, FGF-2 est exportée par et fortement déposée sur stroma de moelle osseuse 31,32 où il fonctionne dans le maintien de cellules souches hématopoïétiques 33. Nous demtré que le FGF-2 induit un état de dormance dans ER + cancer du sein cellules cultivées sur la fibronectine substrats, également abondants dans la moelle osseuse, où il induit la différenciation morphogénétique 7. Dans le modèle, les cellules de cancer du sein sont la croissance inhibée, Rho A à inactiver le RhoGAP GRAF, pour redifférencier un phénotype épithélial et ré-exprimer des intégrines lost avec la progression maligne. Ils se lient à travers la fibronectine intégrine α5β1 et d'activer la survie de signalisation qui les rendent résistantes à la thérapie cytotoxique 7,8,15 (figure 1). Inhibition de GTPases Rho de classe a été démontré précédemment pour induire un phénotype dormant 34.
Ici, nous allons décrire les procédures spécifiques qui permettront aux enquêteurs d'établir le modèle et étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires spécifiques régissant la dormance des cellules ER + cancer du sein. Dans les expériences présentées ici pour illustrer l'utilisation du modèle, Nous avons ciblé la voie de la PI3K (figure 1B) avec un inhibiteur de l'Akt et un inhibiteur de la PI3K et de tous les membres de la famille Rho (figure 1B) avec un inhibiteur pan-Rho et un Rho kinase (ROCK) inhibiteur.
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Protocol
1. Test clonogénique
- Préparer un seul suspensions de cellules de lignées de cellules de cancer du sein oestrogène-dépendante des cellules MCF-7 et T47D en suivant les étapes décrites ci-dessous
- Aspirer le milieu de culture (DMEM / 10% inactivé par la chaleur sérum de veau foetal / glutamine et pen / strep) à partir d'une boîte de culture tissulaire de 10 cm qui est non confluentes de cellules MCF-7 ou les cellules T-47D plus de 50%. Rincer avec du PBS. Incuber avec de la trypsine 0,25% / 2,21 mM EDTA dissout dans du DMEM riche en glucose à 37 ° C pendant 1-4 min.
- Voir les cellules à des intervalles de 1 min sous un microscope à contraste de phase pour garantir une répartition de la cellule unique. Remettre les cellules avec une pipette de 2 ml par aspiration et à plusieurs reprises de perturber contact cellule-cellule pour obtenir un statut de cellules presque invariable, unique.
- Continuer à incuber les cellules dans la trypsine à 37 ° C pendant 4 min si vous observez des amas de cellules après seulement 2 min d'incubation. Ne pas utiliser ces cellules pour des études clonogènes si elles restent adhérentes à l'each autre bout de 4 min de la trypsine parce que l'erreur sera introduit dans le rendement de nombre de colonie.
NOTE: Si les cellules sont agglutinées, le nombre de colonies formées reflétera le produit de moins de cellules que le nombre incubés. Si les cellules sont trop trypsinisées, leur potentiel clonogénique peut être diminuée. - Préparer une suspension cellulaire unique de 1.500 cellules / ml de milieu de culture pour les plaques à 24 puits, ou moins, (+ 500 cellules / ml, en fonction du type cellulaire ou du nombre de passage), par des dilutions en série dans un tube principal contenant la totalité du volume nécessaire pour toutes les variables dans l'expérience.
NOTE: L'objectif est une densité cellulaire finale de 800 cellules / cm 2 (gamme d'environ 500 à 1100 cellules / cm 2). L'objectif est de produire environ 100 + 50 colonies, qui permet le comptage relativement facile, empêche l'encombrement et permet colonies suffisantes pour entraîner des différences statistiques significatives lorsque les colonies sont augmenté ou diminué de perturba expérimentaletions.
- Incuber les cellules à clonogénique densité en utilisant les étapes décrites ci-dessous
- Incuber les cellules dans des puits quadruples sur 24 plaques revêtues de fibronectine puits à une densité clonogénique de 1500 cellules / puits à partir d'un seul tube de suspension de cellules de maître de 1500 cellules / ml. Triturer le milieu contenant des cellules avec une pipette de 5 ml en dressant 3 ml et 1 ml de milieu de distribution dans chacun des 2 puits.
NOTE: fibronectine plaques doivent être achetés pré-revêtu d'un fournisseur commercial. des plaques de revêtement à l'extérieur d'un contrôle de qualité, des résultats de processus automatisés dans une surface inégale inadapté pour ce dosage. - Mélanger la suspension par pipetage de haut en bas avec une pipette de 5 ml, dresser 3 ml de suspension cellulaire et remplir 2 puits avec 1 ml chacun. Remplissez seulement 2 puits à tout moment d'une pipette. Retour le volume restant dans la pipette à la suspension de cellules dans le tube de maître, remettre les cellules à nouveau par aspiration et refoulement et d'élaborer un autre 3 ml pour remplir une autre 2 wells avec 1 ml chacune.
NOTE: Le mélange continu du tube de maître est nécessaire parce que les cellules seront en permanence sédimenter. Rédaction volume suffisant pour remplir seulement 2 puits est nécessaire d'ajouter le nombre de cellules semblables à chaque puits parce que les cellules sédimentent dans la pipette ainsi. - Travaillez rapidement pour distribuer les grands volumes de cellules parce que les cellules permettant de siéger en suspension à la température ambiante et de la concentration de CO 2 va moduler leurs potentiels (observations non publiées) clonogéniques.
- Optimiser la distribution spatiale des cellules pendant l'acte d'entre eux pipetage dans des puits pour des essais de la colonie. Faire par pipetage lentement la suspension contenant la concentration cellulaire finale dans le milieu du puits. Ne pas soumettre la plaque pour faire avancer le mouvement avant que les cellules se déposent au fond. Ne pas agiter la plaque parce mélange circulaire sera effectivement centrifuger les cellules à la périphérie du puits créant de fortes densités cellulaires et colonies confluentes innombrables à 6 jours.
NOTE: Ne pas mélanger moins nécessaire car cela est moins souhaitable que pas de mélange du tout après l'introduction du volume avec les cellules en suspension. Si il est nécessaire de mélanger des cellules, le faire en déplaçant la plaque avant et en arrière dans des directions perpendiculaires alors qu'il repose sur une surface plane. - Incuber les cellules à 37 ° C 5% de CO 2, sans changement de support pour 6 jours. Le petit nombre de cellules dans un puits après six jours ne sera pas un impact significatif sur la composition en nutriments ou cytokine ni le pH du milieu d'origine.
- Concevoir le cours du temps de l'analyse comme suit: incuber les cellules sur la fibronectine revêtu substrats le jour 1. Remplacer support existant avec 1 ml de milieu frais ou milieu frais contenant le FGF-2 10 ng / ml au jour 0. cellules tache sur la journée 6 ci-dessous en 1.4). Mener des perturbations expérimentales au jour 3, comme ci-dessous au point 1.3).
- Incuber les cellules dans des puits quadruples sur 24 plaques revêtues de fibronectine puits à une densité clonogénique de 1500 cellules / puits à partir d'un seul tube de suspension de cellules de maître de 1500 cellules / ml. Triturer le milieu contenant des cellules avec une pipette de 5 ml en dressant 3 ml et 1 ml de milieu de distribution dans chacun des 2 puits.
- Set Up perturbations expérimentales de signalisation moléculaire ou molécules d'adhésion
- Au jour 3, ajouter 10056; l d'une solution contenant de 10 fois la concentration finale voulue de l'agent perturbateur au moyen de 1 ml dans les puits. Ne pas mélanger. Continuer à incuber les cellules à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 3 jours.
NOTE: les agents Perturber peut inclure une variété d'inhibiteurs et des agents de blocage de molécules d'adhésion, des récepteurs ou d'autres protéines de surface, des inhibiteurs de voies intracellulaires de signalisation, des molécules, des facteurs, des cofacteurs ou des protéines structurelles, qui peuvent jouer un rôle dans le soutien de l'état de dormance. - colonies de tache sur 6 jours, comme suit.
- Au jour 3, ajouter 10056; l d'une solution contenant de 10 fois la concentration finale voulue de l'agent perturbateur au moyen de 1 ml dans les puits. Ne pas mélanger. Continuer à incuber les cellules à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 3 jours.
- Colonies de Stain
- les taches cellules après 6 jours de culture avec un cristal violette fraîchement préparé 0,1% dans l'éthanol à 2% / borate de sodium 10 mM (pH 9,0) solution. Aspirer médias et ajouter une solution de cristal violet à une ml à chaque puits pendant 20 min.
- Lavez assiettes en les immergeant avec les ouvertures de puits orientés vers le bas à un angle aigu dans un seau à glace débordant de robinet en continul'eau dans l'évier. Inclinez la plaque à un angle horizontal une fois sous l'eau, et l'ouverture vers le bas, puis inclinez revenir à un angle aigu lors du retrait dans un mouvement fluide douce.
- Répéter l'immersion deux ou trois fois jusqu'à ce que l'eau au fond des puits est plus bleue. Lavages vigoureux peuvent éliminer les cellules ou colonies qui sont moins adhérentes due à l'intervention expérimentale, ajoutant de manière significative à l'erreur dans le comptage et les données.
- Plaques sécher pendant la nuit en les plaçant à l'envers sur des serviettes sur la paillasse à côté de leurs couvertures marqué correspondant.
- Compter les colonies
- Comptez le nombre de colonies croissance et de dormance dans chaque puits après 6 jours d'incubation, la coloration et le séchage. Compter les colonies de façon optimale à 40X dans un inversé microscope à contraste de phase. Compter les colonies de> 30 cellules en culture et des colonies de 12 cellules ou moins, avec l'aspect morphologique de très grande taille par rapport à la croissance de cellules, grande expacytoplasme DEMVSO avec grande cytoplasme au noyau rapports, présentés dans la figure 1 7,15.
NOTE: Des grappes de 13-29 cellules ne sont pas normalement considérés comme ils ne sont pas très fréquents dans les essais de dormance simples. Ils peuvent être comptés si les perturbations se déplacent le potentiel de croissance ou soit des cellules dormantes croissance. Ces résultats devront ensuite être corrélé avec une signification biologique.
- Comptez le nombre de colonies croissance et de dormance dans chaque puits après 6 jours d'incubation, la coloration et le séchage. Compter les colonies de façon optimale à 40X dans un inversé microscope à contraste de phase. Compter les colonies de> 30 cellules en culture et des colonies de 12 cellules ou moins, avec l'aspect morphologique de très grande taille par rapport à la croissance de cellules, grande expacytoplasme DEMVSO avec grande cytoplasme au noyau rapports, présentés dans la figure 1 7,15.
2. clonogénique incubation d'études immunofluorescence
- Ajuster le nombre de cellules à environ 7,500-8,000 cellules / puits dans des plaques à 6 puits, à correspondre à la cellule numéros / aire de surface analogue à des expériences 24 puits.
- Placez un rond, stérile, lamelle de fibronectine dans chaque base ainsi des plaques de 6 puits pour les études d'imagerie avant l'addition de la cellule. Pipet cellules dans 3 ml volumes dans chaque puits 2 puits à la fois à des concentrations décrites, comme décrit pour les expériences clonogènes ci-dessus en 1.2).
- Incuber les cellulespendant 6 jours, comme ci-dessus en 1.2.4 et 1.2.5. Ajouter facteurs perturbateurs sur trois jours à des concentrations de 10 x 300 pi de volumes, comme décrit dans les procédures d'essai de colonie à 1,3).
- cellules tache sur la journée 6 avec des anticorps à la cellule des molécules d'adhésion comme les intégrines α4, α5, α6, β1, β3, par exemple, l'adhésion focale molécules complexes FAK, paxillin et vinculine, par exemple, des protéines impliquées dans la motilité tels que α-tubuline, par exemple, de signalisation éléments de voie tels que la phospho-Akt, phospho-ERK, phospho-p38, phospho-JNK, par exemple, ou toute autre protéine qui est la cible d'une enquête pour son rôle dans la dormance, en utilisant des techniques standard pour direct ou indirect immunofluorescence.
- Retirer les lames avec une pince jour 6. Fix dans l'acétone / méthanol 1: 1 à -20 ° C pendant 20 min et l'air sec. Un fixateur de remplacement, tel que le paraformaldehyde, peuvent être utilisés, si nécessaire. Perméabiliser les cellules avec 0,1% de Triton X-100, le citrate de sodium à 0,1% pendant 2 min fou la détection d'antigènes intracellulaires. Laver les cellules avec du PBS.
- Pour la coloration de immunofluorecence indirect, les lames de bloc pendant 1 heure à température ambiante avec 5% de BSA ou avec 10% de sérum pré-immun de l'espèce dans laquelle l'anticorps secondaire a été généré.
- Incuber une nuit à 4 ° C avec des anticorps primaires à la cellule des molécules d'adhésion, des molécules complexes focaux, signalisation membres de la voie ou de toute autre protéine qui est la cible d'une enquête pour son rôle dans la dormance dilué à dilutions spécifiques recommandées par le fabricant dans du PBS 0,1% de Triton X -100.
- Laver 3 fois avec du PBS. Incuber lamelles avec des anticorps de fluorophore conjugué à la température ambiante pendant 2 heures. A titre d'exemple, Alexa Fluor 488 âne anti-IgG de souris d'anticorps peut être utilisé pour détecter des anticorps primaires monoclonaux de souris. Mont lamelles de côté cellule vers le bas sur des lames de verre à l'aide d'un agent de antifade avec Dapi. Sceller les périmètres avec du vernis à ongles.
- Pour immunofluorescence directe, effectuer la BSAbloquant comme ci-dessus au paragraphe 2.4.2), incuber avec l'anticorps primaire fluorophore conjugué nuit à 4 ° C. Laver 3 fois avec du PBS. Incuber les lames avec un agent de antifade et Dapi et joint avec du vernis à ongles.
- Couverture plateaux coulissants avec une feuille d'aluminium et conserver à 4 ° C pour l'imagerie et la photographie à tout moment jusqu'à plusieurs semaines plus tard. Voir et photographie cellules en utilisant des systèmes d'imagerie microscopique fluorescence équipés d'une caméra à 1,000x grossissement.
- Pour la coloration de l'actine fibrillaire, les lames de blocs dans 1% d'albumine de sérum bovin (BSA) pendant 30 minutes et on incube dans BODIPY FL-phallacidine (vert) ou la rhodamine phalloïdine (rouge) à la température ambiante pendant 20 min. Ajouter un agent de antifade et sceller comme ci-dessus.
3. clonogénique incubation pour les études moléculaires
- Western Blot
- Incuber ER + cancer du sein cellules MCF-7 ou T47D à des densités clonogéniques de 20.000 cellules / plaque de 60 mm et de 50 000 cellules / plaque de 100 mm sur fibronecrevêtu d'étain plaques à 37 ° C dans 5% de CO2.
- Incuber les cellules à des densités légèrement plus élevés de 75 000 cellules / plaque de 100 mm pour les études moléculaires nécessitant des quantités mg de protéines à partir de lysats. Utilisez jusqu'à dix plaques par point expérimental pour recueillir suffisamment de protéines pour les études moléculaires en utilisant des empreintes occidentaux ou pour l'isolation de l'ARN pour des transferts de Northern.
- Le nombre de cellules gel à base de chargement est un complément nécessaire pour comparer l'expression des protéines dans les cellules de croissance et de dormance très différentes taille. Recueillir des cellules par trypsinisation et compter une aliquote dans un hémocytomètre dans 0,2% Trypan Bleu pour la préparation de lysats pour des transferts de Western lieu de racler les cellules avec une seule lame de bord.
- Centrifuger les cellules à 10.000 g pendant 2 min, retirez les médias par aspiration, ajouter 200 tampon de lyse, soniquer les cellules dans un tampon de lyse et de déterminer la concentration en protéines.
- Calculer la quantité de protéine par cellule en divisant le rendement de la protéine par le nombre de cellulesqui a généré ce montant. Charger le lysat dans chaque puits de gels de polyacrylamide séparées qui représente à la fois a) des quantités équivalentes de la protéine et b) des quantités de protéines représentant des nombres équivalents de cellules. Au moins 25 pg de protéine doit être chargé dans chaque puits.
NOTE: Ce sera de permettre des comparaisons entre croissance et de dormance des cellules, qui sont significativement différents en taille et en teneur en protéines (figure 1).
- Cytométrie en flux
- Recueillir des cellules de plaques de 100 mm par trypsinisation, comme en 3.1 et d'analyser par cellulaire activé par fluorescence tri standard (FACS) en utilisant des protocoles coloration par immunofluorescence primaire ou secondaire pour des antigènes intracellulaires ou extracellulaires, comme indiqué dans 2.4.
REMARQUE: Retrait de cellules à partir de plaques de culture tissulaire par traitement à la trypsine n'a pas d'incidence sur la concentration des protéines membranaires, comme déterminé par marquage de l'anticorps.
- Recueillir des cellules de plaques de 100 mm par trypsinisation, comme en 3.1 et d'analyser par cellulaire activé par fluorescence tri standard (FACS) en utilisant des protocoles coloration par immunofluorescence primaire ou secondaire pour des antigènes intracellulaires ou extracellulaires, comme indiqué dans 2.4.
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Representative Results
Des expériences ont été menées afin de récapituler l'essai. L'évolution dans le temps de l'expérience est représenté sur la figure 2A. Les cellules sont incubées à une densité clonogénique le jour -1, FGF-2 dans un milieu frais est ajouté au jour 0 et les cellules sont cultivées jusqu'au jour 6 quand ils sont colorés et les colonies sont comptées. Tous les perturbations du système sont administrés au jour 3 dans des volumes de 100 pi à 10x concentrations finales souhaitée. Figure 2B montre l'aspect typique des colonies croissance et de dormance. Colonies en croissance contiennent> 30 cellules dormantes et les colonies contiennent 12 ou moins de cellules, qui sont beaucoup plus grandes que les cellules croissante auprès des grands ratios cytoplasme / noyau. Figure 2C montre un résultat expérimental typique menée en quatre exemplaires. La distribution prédominante des cellules sans addition de FGF-2 est représenté par les clones en croissance tandis que, en présence de FGF-2, la grande majorité des clones sont en sommeil.
ontenu "> Figure 3 est un exemple d'une expérience dans laquelle des agents perturbateurs ont été ajoutés le jour 3. La figure représente l'inhibition dose-dépendante de clones dormants par inhibition de la famille Rho GTPases par un inhibiteur pan-Rho C3 transférase et un Rho kinase (ROCK) inhibiteur Y27632. Le test peut évaluer l'ED 50 d'inhibiteurs ajoutés sur clones dormantes ainsi que des clones en croissance. Dans cette expérience, l'effet sur les clones de croissance n'a pas été déterminée, car il n'a été présenté pour illustrer la méthodologie.Les figures 4 et 5 montrent que le test peut être utilisé pour évaluer les effets combinés des inhibiteurs sur la survie des clones dormants. Nos études antérieures ont démontré que la voie PI3K est soumis à une activation soutenue de cellules dormantes dans ce modèle et l'inhibition à la fois de la PI3K et Akt inhibe partiellement la survie de clones dormants 7. Ici, les observations préliminaires, démontré tchapeau inhibition non spécifique de la famille Rho des petites GTPases inhibe également partiellement la survie de clones inactifs. Les données présentées dans les figures 4 et 5 montrent que la combinaison de l'inhibition de PI3K et une de ses effecteurs en aval, AKT, à l'inhibition de la famille Rho avec C3-transférase et un inhibiteur de ROCK peut éliminer presque totalement la survie de clones dormants dans certaines circonstances. Nous avons déjà démontré que les clones dormants survivre à l'inhibition de PI3K, mais pas de Akt sont composé de cellules qui ne présentent plus le phénotype dormant, mais plutôt apparaître mésenchymateuses et en détresse 7. Les cellules en clones dormants dans laquelle la famille Rho a été largement inhibée par C3 transférase et l'inhibiteur de ROCK aussi perdre l'aspect typique de dormance, assumer apparences fibrolastoid et membranes ébouriffées et aussi semblent affligés (figure 6). Ces expériences démontrent un modèle qui peut être interrogé dans une très largeOAD manière à obtenir une compréhension des éléments qui régissent la dormance et la résistance à la thérapie.
Figure 1: Les mécanismes régissant notre modèle in vitro de dormance (A) croissance et de dormance MCF-7 clones après une incubation de 6 jours à une densité clonogénique sur des plaques revêtues de fibronectine avec et sans FGF2 10 ng / ml 7 (100X).. (B) Résumé schéma décrivant les données que FGFR et intégrine α5β1 signalisation de l'état d'équilibre parallèle est nécessaire pour activer et maintenir la dormance 7. FGF-2 régule inhibiteurs de kinases cycline-dépendantes résultant dans G1 arrestation 21, active ERK kinase PI3 8 et 7 que initiatesurvival signalisation et régulation positive intégrine α5β1 7, qui atteint l'état d'équilibre après plusieurs jours. Double throug de signalisationh FGFR par PI3K et indépendamment par ligation de l'intégrine α5β1 par la fibronectine sont requis pour l'activation de FAK et la localisation de la membrane et l'activation de la RhoA 15 GRAF GAP. Cela se traduit par l'inactivation de RhoA et un état d'équilibre permissive pour réarrangement cortical de F-actine (de microphotographie phalloidin teinté), épithéliale re-différenciation et la dormance 15. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Les éléments du dosage in vitro de dormance (A) Schéma des composantes temporelles de l'essai de dormance.. Les cellules sont incubées sur de la fibronectine revêtu des plaques de culture tissulaire à la densité clonogénique, à une densité maximum de 1.500 cellules / puits d'une plaque à 24 puits dans un incubator à 37 ° C et 5% de CO 2 au jour 1. Le milieu est remplacé au jour 0 avec du milieu frais ou un milieu frais contenant le FGF-2 10 ng / ml et les cellules sont incubées de nouveau. Les cellules sont colorées avec une solution de cristal violet, tel que décrit, le jour 6. Les inhibiteurs ou des agents de perturbation sont ajoutés au jour 3 dans 100 volumes ul à 10x concentrations désirées et les cellules sont ré-incubées jusqu'au jour 6. (B) L'apparition de taché croissance et de dormance MCF-7 colonies. Colonies en croissance contiennent> 30 cellules dormantes et les colonies contiennent 12 ou moins de cellules. Cellules dormantes sont en forme de crêpes, de nombreuses fois plus grande que la croissance de cellules avec de grands rapports cytoplasme / noyau. (100X). (C) Graphique montrant le potentiel clonogénique de 1.500 cellules MCF-7 de cancer du sein humaines incubées avec et sans FGF-2 10 ng / ml sur des plaques à 24 puits revêtues de fibronectine. Sans FGF-2, la distribution de cellules prédominant est représenté par les clones en croissance tandis que, en présence de FGF- 2 la grande majorité des clones sont en sommeil. Des expériences ont été réalisées en quatre exemplaires. (Barres d'erreur sont + SD)
Figure 3: l'inhibition dose-dépendante de clones dormants par pan-Rho famille inhibiteurs de C3-transférase et la Y27632 inhibiteur de ROCK cellules T-47D ont été incubées à la densité clonogénique de 1000 cellules par puits sur des plaques à 24 puits fibronectine avec le FGF-2. 10 ng / ml pendant 6 jours. Media, C3 transférase 3 ou 5 ug / ml, et l'inhibiteur de ROCK Y27632 0,1, 1 ou 10 pg / ml ont été le jour 3 et les clones inactifs ont été comptées le jour 6. Le graphique démontre une inhibition dose-dépendante de clones inactifs colorés sur jour 6. L'ED 50 de C3 était d'environ 3 ug / ml tandis que celle de l'inhibiteur de ROCK est comprise entre 1 et 10 pM dans ce dosage. Des expériences ont été réalisées en quatre exemplaires. (Barres d'erreur sont + SD)
Figure 4:. Effet combiné de la pan-Rho inhibiteur de la famille C3 avec un inhibiteur de l'Akt ou avec un inhibiteur de PI3 kinase sur la survie des dormants clones T-47D cellules T-47D ont été incubées à la densité clonogénique de 1000 cellules par puits sur 24 ainsi fibronectine des plaques revêtues d'avec le FGF-2 10 ng / ml pendant 6 jours. Médias, C3 transférase 5 ug / ml, Akt inhibiteur de 25 pM et LY294002 20 um ont été ajoutés individuellement ou en combinaison le jour 3 et clones dormants ont été comptés le jour 6. Les effets combinés de C3 et l'inhibiteur de l'AKT, semblent être additifs à ceux-ci Les concentrations mais les effets combinés de C3 et l'inhibiteur de PI3K semblent être synergique dans ces expériences sur l'inhibition de la survie de clones de dormance. Des expériences ont été réalisées en quatre exemplaires. (Barres d'erreur sont + SD)
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Figure 5:. Combiné effets de l'inhibiteur de ROCK Y27632 avec un inhibiteur de l'Akt ou avec un inhibiteur de PI3 kinase sur la survie des dormants clones T-47D cellules T-47D ont été incubées à la densité clonogénique de 1000 cellules par puits sur des plaques à 24 puits fibronectine revêtues avec FGF-2 10 ng / ml pendant 6 jours. Médias, Y27632 3 pg / ml, Akt Inhibitor 25 um et LY294002 20 um ont été ajoutés individuellement ou en combinaison le jour 3 et clones dormants inhibiteur de ROCK ont été comptés le jour 6. Les effets combinés de Y27632 et l'inhibiteur de l'AKT, ne semble pas être additif à ces concentrations, mais les effets combinés de la Y27632 et l'inhibiteur de PI3K semblent être plus qu'additif dans ces expériences sur l'inhibition de la survie de clones de dormance. Des expériences ont été réalisées en quatre exemplaires. (Barres d'erreur sont + SD)
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Figure 6:. L'apparition de survivant dormants clones T-47D après traitement avec C3-transférase et l'inhibiteur de ROCK Y27632 dosages de colonies ont été établies en quatre exemplaires dans bien fibronectine revêtues 24 des plaques de culture tissulaire à 1000 cellules / puits avec du FGF-2, tel que décrit, les inhibiteurs ont été ajoutés au jour 3 aux concentrations indiquées, les cellules ont été colorées et photographié le jour 6. Les cellules traitées avec des inhibiteurs de la famille pan-Rho perdu leur apparence de propagation, est devenu petit, dendritique et semblait en détresse. (100X).
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Discussion
Notre modèle se compose de plusieurs éléments essentiels de dormance dans la moelle osseuse. Il se compose d'oestrogènes des cellules sensibles, qui sont du type susceptible de rester en sommeil dans la moelle pendant des périodes prolongées 10, il se compose de la fibronectine, un élément structurel clé de la moelle, le FGF-2, un facteur de croissance abondamment synthétisée par le stroma de la moelle osseuse et fortement déposé dans la matrice extracellulaire de la moelle osseuse et 31,32 incubation des cellules à densité clonogénique où leurs interactions sont principalement avec le substrat. Alors que le microenvironnement de la moelle osseuse est beaucoup plus complexe, ce système simple peut être construit avec la complexité autant ajouté que nécessaire pour poser des questions spécifiques mécanistes.
Le modèle peut être utilisé pour comparer avec des cellules dormantes croissante dans un certain nombre de façons, y compris les cellules techniques biologiques, techniques moléculaires et en techniques in vivo. Phénotypes cellulaires peuvent être dosés par re-clonage, la motilitéet étudie invasion 35, tumeur non adhérente initier la formation de sphérules ou 36 par des études fonctionnelles pour l'interaction avec le micro-environnement en utilisant des anticorps ou des peptides spécifiques de blocage 7.
Le résultat principal de l'essai clonogénique est un comptage numérique des colonies, soit en croissance ou en sommeil, qui se traduit par le potentiel clonogénique croissance ou de dormance des cellules. Comme le laisse entendre ci-dessus, un grand nombre de variables ont le potentiel d'affecter ce résultat, qui doit être contrôlé de manière aussi rigoureuse que possible pour obtenir des résultats reproductibles. Ceux-ci comprennent la source de cellules, le nombre global de passage, la technique de cryoconservation et la qualité des cultures de cellules qui ont été cryoconservés, le nombre de passages depuis la décongélation, la confluence des cultures à partir de laquelle on a obtenu les préparations de cellules uniques, la source et la qualité de la de sérum de veau foetal, les durées de traitement à la trypsine et leur reproductibilité, la duréede cellules laissées à la température ambiante, la dextérité de pipetage nombre de cellules équivalentes dans chaque puits, la dextérité ou la distribution des cellules sur toute la surface d'un puits de façon égale, le nombre de fois où une plaque est retirée de l'incubateur pour l'observation, parmi des dizaines de autres. En plus de représenter généralement reconnus des contrôles de qualité de la culture de tissus, ces variables influent sur le potentiel clonogénique en sommeil d'une expérience à. Variabilité intra-expérimental est typiquement inférieure à 8-10%, cependant, ce qui entraîne des variations en pourcentage d'une expérience à qui sont hautement reproductibles. Typiquement, la variance des données commence à décroître avec une corrélation directe de l'augmentation de l'expérience de l'expérimentateur avec le système et le temps passé à la réalisation de cette analyse.
L'expression des gènes dans les cellules dormantes et de croissance peut être évaluée par RT-PCR, Northern blot, Western blot, immunoprécipitation / Ouest et fonctionnel complexe précipitations / Western, Immunofluorescence ou immunohistochimie, multiplexage par la microfluidique, la spectroscopie Raman, la cytométrie en flux et d'autres techniques. Ces techniques peuvent être utilisées pour déterminer les rôles des récepteurs spécifiques, d'autres protéines membranaires, voies de signalisation, des facteurs de transcription, des modificateurs de histones, des organelles et protéines mitochondriales, les voies métaboliques et de l'utilisation de l'énergie, la tension et la force et l'interaction avec le microenvironnement dans d'innombrables façons sur le rôle de la dormance.
Nos études antérieures ont démontré un rôle important pour les PI3K dans la survie des clones dormants 7 ainsi que dans le maintien du phénotype dormant avec la distribution épithélial de l'actine corticale 15. Nous avons également démontré que RhoA spécifiquement, doit être inhibée pour que le phénotype dormant à être activé. Ceci est en contraste avec les données présentées ici, où l'inactivation de la famille Rho avec pan-inhibiteurs diminue la survie des clones dormants. Tses soulignement le danger d'utiliser des inhibiteurs chimiques de disséquer les mécanismes et la nécessité d'utiliser des approches génétiques pour inhiber ou activer des voies spécifiques. A cette fin, la méthode se prête à la manipulation génétique des cellules, soit par transfection ou transduction permanent ou par 15 transfection transitoire, l'ARNsi ou des nanoparticules. Etant donné que le dosage est d'une durée de six jours, l'expression transitoire de gènes ou d'interférence avec elle entraînera des effets phénotypiques significatives à 6 jours qui peuvent être mesurés.
Reconnaissant son potentiel pour l'étude des mécanismes de l'entrée ainsi que la sortie de dormance, nous sommes actuellement les mécanismes de ces cellules d'échapper à la dormance enquêtons. En entrant dans la dormance est mal comprise, la compréhension des mécanismes qui régissent la sortie de l'état de dormance est encore plus insaisissable. Nous avons rapporté des observations préliminaires que les réponses inflammatoires par stroma blessée peuvent contribuer au réveil des dormant cellules MCF-7 à l'aide de ce modèle 37. Le modèle peut être appliqué à des cellules T-47 ainsi, une autre lignée de cellules de cancer du sein ER +. Alors que les cellules ER- ne deviennent pas en sommeil en réponse à FGF-2, il peut être possible d'adapter la méthodologie à d'autres types de cellules cancéreuses avec différents agents de différenciation dans les enquêtes futures.
En dépit d'être une technique très utile pour identifier le mécanisme clé impliquée dans la dormance, il reste un modèle in vitro. Cependant, les cellules qui ont subi une manipulation en dormance ou in vitro peuvent être testés pour la capacité à former une xénogreffe tumorale. Le principal avantage potentiel du système, cependant, est l'identification des mécanismes qui permettront le développement d'une hypothèse qui peut être testé dans les modèles de dormance très complexes in vivo.
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Disclosures
Soutenu par le ministère de la Défense subventions DAMD17-01-C-0343 et DAMD17-03-1-0524, la Commission d'État du New Jersey sur la recherche sur le cancer 02-1140-CCR-E0 et le Mémorial Goldberg Ruth Estrin for Cancer Research (RW)
Acknowledgments
Les auteurs ont rien à révéler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF-7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| T47D cells | ATCC | HTB-123 | |
| BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate | Corning | 354411 | |
| BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes | Corning | 354403 | |
| BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes | Corning | 354451 | |
| BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin | Corning | 354088 | |
| 6 Well tissue culture plate | CellTreat | 229106 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder | Corning Life Sciences | 50-013-PB | |
| Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum | Serum Source International | FB02-500HI | |
| 0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-CI | |
| L-Glutamine, 100x, Liquid | Corning | 25-005-CI | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate) | CalBiochem | 124005 | |
| LY294002 | CalBiochem | 19-142 | Chenical PI3K inhibitor |
| C3 transferase | Cytoskeleton | CTO3 | Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1 |
| Y-27632 dihydrochloride | Santa Cruz Biotechnology | 129830-28-2 | |
| BODIPY FL-Phallacidin (green) | Molecular Probes | B607 | Fluorochrome for fibrillar actin staining |
| BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red) | Molecular Probes | R415 | Fluorochrome for fibrillar actin staining |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent | Molecular Probes | R37114 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Molecular Probes | P-36931 |
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