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Medicine

Un Published: June 30, 2015 doi: 10.3791/52672

Introduction

Le cellule tumorali del seno metastatizzano al midollo osseo prima che la malattia è rilevabile 1, non appena i piccoli tumori si sviluppano vasi sanguigni 2,3. Il processo metastatico è rapido ma inefficiente. Le cellule entrano i nuovi vasi sanguigni rapidamente a milioni al giorno 4 ma pochi sopravvivono il viaggio in organi distanti 5. Tuttavia, alcuni sopravvivono micrometastasi nel midollo e può essere trovato come cellule singole o piccoli grumi di cellule in aspirati di midollo osseo da pazienti di nuova diagnosi 1. Queste cellule resistono chemioterapia adiuvante, che viene somministrato per lo scopo di eliminarli 6. Questa resistenza è dotato, sostanzialmente, dalla sopravvivenza segnalazione avviata da interazioni con il midollo microambiente osseo 7,8. Micrometastasi possono essere trovati in circa un terzo delle donne con carcinoma mammario localizzato e rappresentano un indicatore indipendente di sopravvivenza quando analizzato da analisi univariata 9. Alcuni micrometastases sono la crescita iniziata, ma i modelli di ricorrenza dipendono dal tipo di cellulare. I pazienti con carcinoma mammario triplo negativo tendono a ripresentarsi tra 1 a 4 anni, suggerendo scarso controllo sullo stato dormiente. Altri tipi di cellule, tra cui ER / PR + cellule, possono rimanere dormienti per un massimo di 20 anni, con un costante, continuo tasso di recidiva 10. Mentre le differenze di dormienza firme espressione genica tra ER- linee di cellule del seno e tumori ER + e riflettono diversi potenziali dormienza 11, le interazioni con il midollo osseo stroma probabilmente rappresentano un contributo significativo alla dormienza.

Lo studio di dormienza in vivo è estremamente difficile perché micrometastasi sono rari e vengono oltrepassati dalle cellule ematopoietiche di oltre 10 6 -fold. Quindi, i modelli interessati devono essere generati che forniscono dati in vitro che possono suggerire meccanismi e generare ipotesi verificabili in vivo. Un certo numero di modelli dormienza, compreso mathemodelli matico 12,13, modelli in vitro 7,8,14,15, modelli in vivo di xenotrapianto 16, combinazioni di in vitro e modelli di xenotrapianto 17,18 e tumorali e metastasi spontanee modelli 19, hanno dato qualche informazione in dormienza cellula tumorale 20 . Ognuno di questi modelli hanno i loro limiti e sono di se stessi in primo luogo utile per generare ipotesi per quanto riguarda la segnalazione molecolare e interazioni che governano dormienza da testare in modelli più biologicamente rilevanti.

Con l'obiettivo generale di definire i meccanismi molecolari di dormienza, le interazioni con il microambiente che si traduce in arresto del ciclo, ridifferenziazione e resistenza terapeutica e dei meccanismi che provocano recidiva + cellule ER, abbiamo sviluppato un modello in vitro che fornisce selezionato elementi rilevanti del stromale microambiente 7. Questo modello, mentre relativamente scarsa nella sua componenti, è sufficientemente robusto per permettere agli investigatori di ricavare i meccanismi molecolari specifici che influenzano le funzioni significative di dormienza. Questi esperimenti generano ipotesi che possono essere testati direttamente in vivo. Il modello si basa su alcuni elementi chiave che abbiamo dimostrato di essere rilevanti in dormienza. Essi comprendono l'uso di cellule di carcinoma mammario estrogeno-dipendenti, coltura di cellule ad una densità clonogenico dove loro interazione è principalmente con il substrato e componenti solubili del mezzo, un substrato fibronectina e la presenza del fattore di crescita basico dei fibroblasti (FGF-2) nel mezzo.

Abbiamo caratterizzato i meccanismi che regolano il sistema in vitro, compresa l'induzione di arresto del ciclo cellulare da FGF-2 21, mediata attraverso TGFβ 22, la sopravvivenza di segnalazione attraverso PI3 chinasi e ERK 7,8 8 e differenziazione morfogenica ad un fenotipo epiteliale, che dipendeva inattivazione RhoA, integrina45; 5β1 upregulation e legatura dei stromale fibronectina per la sopravvivenza 7,15 (Figura 1). Gli effetti in vitro del ciclo cellulare di FGF-2 in cellule MCF-7 cominciano a concentrazioni almeno un log inferiore a 10 ng / ml 21,23. Il razionale era basato sul controllo temporale del FGF-2 governa mammaria morfogenesi duttale, espansione ciclica e recessione in un certo numero di sistemi di mammifero 24-27. Abbiamo dimostrato che FGF-2 induce la differenziazione, tra cui morfogenesi duttale in coltura 3D 28, e che l'espressione di FGF-2 sono generalmente perso con trasformazione maligna dei tumori umani 29. L'espressione di FGR1 rimasto intatto nei carcinomi mammari intervistati 29 e MCF-7 cellule continuare ad esprimere tutte le 4 recettori FGF 30. Nel contesto di dormienza, FGF-2 è esportato da e pesantemente depositato sul midollo osseo stroma 31,32 dove funziona nella conservazione di cellule staminali ematopoietiche 33. Noi demonstrated che FGF-2 induce uno stato dormiente in ER + di cancro al seno cellule coltivate su substrati di fibronectina, anche abbondanti nel midollo, dove induce la differenziazione morfogenica 7. Nel modello, le cellule del cancro al seno sono la crescita inibita, inattivare Rho A attraverso la RhoGap GRAF, ridifferenziare ad un fenotipo epiteliale e ri-express integrine α5β1 lost con la progressione maligna. Si legano fibronectina attraverso l'integrina α5β1 e attivano la sopravvivenza segnalando che rendono resistenti alla terapia citotossica 7,8,15 (Figura 1). L'inibizione della Rho GTPasi classe è stato dimostrato in precedenza per indurre un fenotipo dormiente 34.

Qui ci illustrerà le procedure specifiche che permetteranno ai ricercatori di stabilire il modello e studiare i meccanismi molecolari e cellulari specifiche che disciplinano dormienza di cellule ER + di cancro al seno. Negli esperimenti qui presentati per illustrare l'utilizzo del modello, Abbiamo mirato il percorso PI3K (Figura 1B) con un inibitore di Akt e un inibitore della PI3K e tutti i membri della famiglia Rho (Figura 1B) con un inibitore pan-Rho e Rho chinasi (ROCK) inibitore.

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Protocol

1. clonogenica

  1. Preparare una singola sospensioni di cellule di linee cellulari di cancro al seno estrogeno-dipendenti MCF-7 e T47D cellule utilizzando la procedura descritta di seguito
    1. Aspirare il mezzo di coltura (DMEM / 10% di calore inattivato siero fetale bovino / glutammina e pen / strep) da un tessuto piatto le colture 10 cm, non confluenti superiore al 50% con MCF-7 o cellule T-47D. Risciacquare con PBS. Incubare con tripsina / EDTA 0,25% 2,21 mM disciolto in DMEM alto glucosio a 37 ° C per 1-4 min.
    2. Controllare cellule a intervalli di 1 minuto sotto un microscopio a contrasto di fase per garantire una distribuzione singola cellula. Risospendere le cellule con una pipetta 2 ml pipettando su e giù parecchie volte per interrompere il contatto cellula-cellula per ottenere un, lo stato della cella singola quasi invariabile.
    3. Continuare a incubare cellule in tripsina a 37 ° C per un massimo di 4 minuti se si osserva grumi di cellule dopo soli 2 minuti di incubazione. Non utilizzare queste cellule per studi clonogeniche se rimangono aderenti alla postaach altro dopo 4 minuti di tripsinizzazione perché sarà introdotto errore nella resa numero di colonia.
      NOTA: Se le cellule sono raggruppate, il numero di colonie formate rifletterà il prodotto di un minor numero di cellule rispetto al numero incubata. Se le cellule sono eccessivamente tripsinizzate, il loro potenziale clonogenico può essere ridotta.
    4. Preparare una sospensione di cellule singole di 1500 cellule / ml terreno di coltura per 24 pozzetti, o meno, (+ 500 cellule / ml, a seconda del tipo di cellula o numero di passaggio), per diluizioni seriali in un tubo master contenente l'intero volume necessario per tutte le variabili nell'esperimento.
      NOTA: L'obiettivo è una densità cellulare finale di 800 cellule / cm 2 (gamma di circa 500 a 1.100 cellule / cm 2). L'obiettivo è di produrre circa 100 + 50 colonie, che permette relativamente facile conteggio, impedisce affollamento e permette colonie sufficienti per portare a differenze statistiche significative quando le colonie sono aumentati o diminuiti di perturba sperimentalezioni.
  2. Incubare le cellule a clonogenica densità con procedura descritta di seguito
    1. Incubare le cellule in pozzetti quadruplice su 24 piastre fibronectina rivestite pozzetti ad una densità di 1.500 clonogenica cellule / pozzetto da un master singolo tubo sospensione cellulare di 1500 cellule / ml. Triturare il terreno contenente celle con una pipetta da 5 ml mediante l'elaborazione di 3 ml e l'erogazione di 1 ml di mezzo in ognuna delle 2 pozzi.
      NOTA: fibronectina rivestite piastre devono essere acquistati già rivestito da un fornitore commerciale. Piastre rivestimento esterno di una qualità controllata, risultati processo automatizzato in una superficie irregolare inadatto per questo dosaggio.
    2. Mescolare la sospensione pipettando su e giù con una pipetta da 5 ml, elabora 3 ml di sospensione cellulare e riempire 2 pozzi con 1 ml ciascuno. Riempire solo 2 pozzetti alla volta da una pipetta. Restituisce il volume rimanente nella pipetta alla sospensione cellulare nel tubo principale, risospendere le cellule ancora pipettando su e giù e redige un altro 3 ml per riempire altri 2 wells con 1 ml ciascuno.
      NOTA: La continua miscelazione del tubo principale è necessario perché le cellule saranno continuamente sedimentare. Elaborazione di volume sufficiente per riempire solo 2 pozzetti è necessario aggiungere il numero di cellule simili a ciascun pozzetto perché cellule sedimentare nella pipetta pure.
    3. Lavorare rapidamente per distribuire i grandi volumi di cellule perché le cellule che consentono di sedersi in sospensione a temperatura ambiente e la concentrazione di CO 2 si modula loro clonogeniche potenziali (osservazioni non pubblicate).
    4. Ottimizzare la distribuzione spaziale delle cellule durante l'atto della loro pipettando nei pozzetti per saggi colonia. Farlo lentamente pipettando la sospensione contenente la concentrazione cellulare finale nel mezzo del pozzo. Non sottoporre il piatto per favorire il movimento prima di cellule si depositano sul fondo. Non agitare la piastra perché miscelazione circolare efficacemente centrifugare le cellule al perimetro delle ben creando alte densità di cellulari e colonie confluenti innumerevoli a 6 giorni.
      NOTA: Non mescolare se non necessario in quanto questo è meno desiderabile di alcuna miscelazione a tutti dopo l'introduzione del volume con le cellule in sospensione. Se è necessario miscelare cellule, farlo spostando la piastra posteriore e indietro in direzioni perpendicolari mentre poggia su una superficie piana.
    5. Incubare le cellule a 37 ° C 5% di CO 2 senza cambiamento dei media per 6 giorni. Il piccolo numero di cellule in un pozzo dopo 6 giorni non influisce significativamente la composizione nutritiva o citochina né il pH del mezzo originale.
    6. Progettare il decorso del test nel modo seguente: incubare celle su fibronectina rivestite substrati del giorno 1. Sostituire medio esistente con 1 ml di media fresco o mezzo fresco contenente 10 ng / ml il giorno 0. cellule macchia il giorno 6, come di seguito 2 FGF- in 1.4). Condurre eventuali perturbazioni sperimentali il giorno 3, come di seguito al punto 1.3).
  3. Perturbazioni set up sperimentale di molecolare di segnalazione o di Adesione Molecole
    1. Il giorno 3, aggiungere 10056; l di una soluzione contenente 10 volte della concentrazione finale previsto dell'agente perturbante al mezzo 1 ml nei pozzetti. Non mescolare. Continuare ad incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 per altri 3 giorni.
      NOTA: Agenti perturbante può includere una varietà di inibitori e agenti di blocco delle molecole di adesione, recettori o altre proteine ​​di superficie, gli inibitori di vie intracellulari di segnalazione, molecole, fattori, cofattori o proteine ​​strutturali, che possono svolgere un ruolo nel sostenere lo stato dormiente.
    2. Colonie Stain il giorno 6, come segue.
  4. Colonie Stain
    1. Cellule Macchia dopo 6 giorni in coltura con un fresco 0,1% viola cristallo nel 2% di etanolo / 10 mM borato di sodio (pH 9,0) soluzione. Aspirare e aggiungere la soluzione al cristalvioletto uno ml a ciascun pozzetto per 20 min.
    2. Lavare le piastre immergendole con le aperture e rivolti verso il basso con un angolo acuto in un secchio di ghiaccio traboccante di rubinetto in esecuzione continuadell'acqua nel lavandino. Inclinare la piastra per un angolo orizzontale, una volta sott'acqua, bene l'apertura verso il basso, e poi inclinare indietro ad angolo acuto quando si toglie in un unico movimento fluido delicato.
    3. Ripetere l'immersione 2 o 3 volte fino a quando l'acqua sul fondo dei pozzetti non è blu. Lavaggi vigorosi possono rimuovere le cellule o colonie che sono meno aderente causa di intervento sperimentale, che aumenta notevolmente l'errore nel conteggio e dati.
    4. Lastre secche durante la notte mettendo a testa in giù sul asciugamani sul banco accanto ai loro corrispondenti coperture etichettati.
  5. Conta Colonie
    1. Contare il numero di crescita e dormienti colonie in ogni bene dopo 6 giorni di incubazione, colorazione e asciugatura. Contare le colonie in modo ottimale a 40X con lo zoom in un microscopio a contrasto di fase invertito. Contare colonie di> 30 cellule come cresce e colonie di 12 o meno celle, con l'aspetto morfologico di dimensioni molto grandi rispetto alle cellule in crescita, grande Expacitoplasma nded con ampio citoplasma al nucleo rapporti, mostrati in figura 1 7,15.
      NOTA: Gruppi di 13-29 cellule non sono normalmente considerati come non sono molto frequenti nei saggi di dormienza semplici. Essi possono essere conteggiati se perturbazioni spostano il potenziale di crescita sia cellule in crescita o dormienti. Questi risultati saranno poi bisogno di essere correlato con significato biologico.

2. clonogenica Incubazione per immunofluorescenza Studies

  1. Regolare il numero di cellule a circa 7,500-8,000 cellule / pozzetto in 6 pozzetti, per corrispondere alla cella i numeri / superficie analoga a 24 esperimenti così.
  2. Posizionare un giro, sterile, fibronectina rivestite fodera in ogni base ben di 6 piatti e per studi di imaging prima dell'aggiunta delle cellule. Cellule Pipettare in 3 ml di volume in ciascun pozzetto 2 pozzetti alla volta a concentrazioni delineati, come descritto per gli esperimenti clonogeniche sopra in 1.2).
  3. Incubare le celluleper 6 giorni, come sopra in 1.2.4 e 1.2.5. Aggiungere fattori perturbanti il ​​giorno 3 a 10x concentrazioni in 300 volumi microlitri, come descritto nelle procedure di saggio colonia in 1.3).
  4. Cellule Stain il giorno 6 con anticorpi per cellulare molecole di adesione come integrine α4, α5, α6, β1, β3, per esempio, di adesione focale molecole complesse FAK, paxillina e vinculina, per esempio, proteine ​​coinvolte nella motilità quali α-tubulina, per esempio, di segnalazione membri pathway come fosfo-Akt, fosfo-ERK, fosfo-p38, fosfo-JNK, per esempio, o qualsiasi altra proteina che è la destinazione di ricerca per il suo ruolo in dormienza, utilizzando tecniche standard per la diretta o indiretta immunofluorescenza.
    1. Rimuovere i vetrini con una pinza giorno 6. Fissare in acetone / metanolo 1: 1 a -20 ° C per 20 min e aria secca. Un fissativo alternativa, ad esempio paraformaldeide, possono essere utilizzati, se necessario. Cellule permeabilize con 0,1% Triton X-100, 0,1% di citrato di sodio per 2 min fo il rilevamento di antigeni intracellulari. Lavare le cellule con PBS.
    2. Per la colorazione immunofluorecence indiretta, scivoli blocco per 1 ora a temperatura ambiente con il 5% BSA o con 10% di siero preimmune dalla specie in cui si genera l'anticorpo secondario.
    3. Incubare per una notte a 4 ° C con anticorpi primari a cellula molecole di adesione, molecole complesse focali, segnalando membri pathway o qualsiasi altra proteina che è l'obiettivo di ricerca per il suo ruolo in dormienza diluito per diluizioni specifiche consigliate dal produttore in PBS 0,1% TRITON X -100.
    4. Lavare 3 volte con PBS. Incubare coprioggetto con anticorpi fluoroforo-coniugato a temperatura ambiente per 2 ore. Come esempio, Alexa Fluor 488 asino anti-topo IgG anticorpo può essere utilizzato per rilevare anticorpi primari monoclonali murini. Mount coprioggetto lato della cella verso il basso su vetrini utilizzando un agente antifade con Dapi. Sigillare i perimetri con smalto.
    5. Per immunofluorescenza diretta, effettuare la BSAil blocco di cui sopra al punto 2.4.2), incubare con anticorpo primario fluoroforo coniugato notte a 4 ° C. Lavare 3 volte con PBS. Incubare i vetrini con un agente antifade e Dapi e sigillare con smalto.
    6. Vassoi diapositive Coprire con un foglio di alluminio e conservare a 4 ° C per l'imaging e la fotografia in qualsiasi momento fino a diverse settimane più tardi. Visualizzare e fotografia cellule utilizzando qualsiasi sistema di imaging microscopici fluorescenza dotato di una fotocamera a 1,000x ingrandimenti.
    7. Per fibrillare actina colorazione, i vetrini blocco in 1% di albumina di siero bovino (BSA) per 30 min e incubare in BODIPY FL-Phallacidin (verde) o Rodamina phalloidin (rosso) a temperatura ambiente per 20 min. Aggiungi un agente antifade e sigillare come sopra.

3. clonogenica incubazione per studi molecolari

  1. Western Blot
    1. Incubare ER + di cancro al seno cellule MCF-7 o T47D a densità clonogenici di 20.000 cellule / 60 mm Piastra e 50.000 cellule mm piastra / 100 su fibronecstagnato piastre a 37 ° C in 5% CO 2.
    2. Incubare le cellule a densità leggermente superiori di 75.000 cellule / 100 millimetri piatto per studi molecolari richiedono quantità mg per le proteine ​​da lisati. Usa fino a dieci targhe per punto sperimentale per raccogliere sufficienti proteine ​​per studi molecolari con macchie occidentali o per l'isolamento di RNA per Northern blot.
    3. Numero delle cellule in gel a base di carico è un complemento necessario per confrontare l'espressione della proteina in cellule di crescita e dormienti molto diverse dimensioni. Raccogliere le cellule per trypsinizing e contare una aliquota in un emocitometro nello 0,2% Trypan Blue per la preparazione di lisati per Western blot invece di raschiare via le cellule con una sola lama bordo.
    4. Cellule centrifuga a 10.000 xg per 2 minuti, togliere i media per aspirazione, aggiungere 200 microlitri tampone di lisi, sonicazione le cellule in tampone di lisi e determinare la concentrazione di proteine.
    5. Calcolare la quantità di proteina per cellula dividendo la resa di proteine ​​per il numero di celluleche hanno generato tale importo. Caricare il lisato in ogni pozzetto di gel di poliacrilammide separati che rappresenta sia) quantità equivalenti di proteine ​​e b) le quantità di proteine ​​che rappresentano il numero di cellule equivalenti. Almeno 25 ug di proteine ​​deve essere caricato in ciascun pozzetto.
      NOTA: Questo permetterà il confronto tra crescita e dormienti cellule, che sono significativamente differenti in termini di dimensioni e di proteine ​​(Figura 1).
  2. Citometria A Flusso
    1. Raccogliere le cellule da 100 lastre mm da tripsinizzazione, come in 3.1 e analizzare con la fluorescenza delle cellule attivi standard (FACS) i protocolli utilizzando primaria o secondaria colorazione immunofluorescenza per antigeni intracellulari o extracellulari, come indicato in 2.4.
      NOTA: Rimozione cellule da piastre di coltura tissutale mediante tripsinizzazione non influenza la concentrazione di proteine ​​di membrana come determinato mediante etichettatura anticorpo.

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Representative Results

Gli esperimenti sono stati condotti per ricapitolare il test. L'andamento temporale dell'esperimento è mostrato in Figura 2A. Le cellule vengono incubate a densità clonogenica giorno -1, si aggiunge FGF-2 in un mezzo fresco al giorno 0 e le cellule sono coltivate fino al giorno 6, quando sono macchiati e le colonie sono contate. Eventuali perturbazioni al sistema vengono somministrati il giorno 3 in 100 volumi microlitri a 10x concentrazioni finali desiderato. Figura 2B mostra l'aspetto tipico di crescita e dormiente colonie. Colonie Growing contengono> 30 celle e colonie dormienti contengono 12 o meno cellule che sono molte volte più grande di crescita delle cellule con rapporti citoplasma / nucleo di grandi dimensioni. Figura 2C mostra un tipico risultato sperimentale condotto in quadruplicato. La distribuzione predominante di cellule senza aggiunta di FGF-2 è rappresentato da cloni crescono mentre, in presenza di FGF-2, la stragrande maggioranza dei cloni sono inoperosi.

ontent "> Figura 3 è un esempio di un esperimento in cui gli agenti perturbanti sono stati aggiunti al giorno 3. La figura rappresenta l'inibizione dose-dipendente di cloni dormienti per inibizione della famiglia Rho GTPasi di da un pan-Rho inibitore C3 transferasi e Rho chinasi (ROCK) inibitore Y27632. Il dosaggio può valutare la ED 50 di inibitori aggiunti su cloni dormienti e cloni in crescita. In questo esperimento, l'effetto sulla crescita cloni non è stato determinato, da quando è stato presentato solo per illustrare la metodologia.

Le figure 4 e 5 mostrano che il saggio può essere utilizzato per valutare gli effetti combinati di inibitori sulla sopravvivenza di cloni dormienti. I nostri studi precedenti hanno dimostrato che il percorso PI3K subisce un'attivazione sostenuta cellule dormienti in questo modello e l'inibizione di entrambi PI3K e Akt inibisce parzialmente la sopravvivenza di cloni dormienti 7. Qui, osservazioni preliminari, ha dimostrato tcappello l'inibizione non specifica della famiglia Rho delle piccole GTPasi anche inibisce parzialmente la sopravvivenza di cloni dormienti. I dati presentati nelle figure 4 e 5 mostrano che la combinazione di inibizione della PI3K e uno dei suoi effettori a valle, AKT, con l'inibizione della famiglia Rho con C3 transferasi e un inibitore ROCK può eliminare quasi completamente la sopravvivenza di cloni dormienti in alcune circostanze. Abbiamo già dimostrato che i cloni dormienti sopravvivere l'inibizione di PI3K, ma non di Akt sono costituiti da cellule che presentano più il fenotipo dormiente, ma piuttosto appaiono mesenchimali e angosciato 7. Le cellule in cloni dormienti in cui la famiglia di Rho è stato ampiamente inibito da C3 transferasi e l'inibitore ROCK anche perdere l'aspetto tipico dormiente, assumere le apparenze fibrolastoid e membrane arruffate e anche apparire afflitto (Figura 6). Questi esperimenti dimostrano un modello che può essere interrogato in un broad modo per ottenere una comprensione degli elementi che governano dormienza e resistenza alla terapia.

Figura 1
Figura 1: meccanismi che governano il nostro modello di dormienza in vitro (A) crescente e dormienti MCF-7 cloni dopo 6 giorni di incubazione a densità clonogenica su piastre fibronectina rivestite con o senza FGF2 10 ng / ml 7 (ingrandimento 100X).. Schema (B) Sintesi delinea i dati che FGFR e integrina α5β1 segnalazione stato stabile in parallelo è necessario per attivare e mantenere dormienza 7. FGF-2 upregulates inibitori della chinasi ciclina dipendenti con conseguente arresto G1 21, attiva ERK 8 e PI3 chinasi 7 che initiatesurvival segnalazione e upregulate integrina α5β1 7, che raggiunge lo stato stazionario dopo alcuni giorni. Throug doppia segnalazioneh FGFR attraverso PI3K e indipendente attraverso la legatura di integrina α5β1 da fibronectina sono necessari per l'attivazione di FAK e localizzazione di membrana e l'attivazione della RhoA GAP GRAF 15. Ciò si traduce in inattivazione di RhoA e uno stato stazionario permissiva per riassetto corticale di F-actina (microfotografia falloidina macchiati), epiteliale re-differenziazione e dormienza 15. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2: Elementi del dosaggio dormienza in vitro (A) Schema dei componenti temporali del dosaggio dormienza.. Le cellule sono incubate su fibronectina rivestite tessuto piastre di coltura in densità clonogeniche, ad una densità massima di 1500 cellule / pozzetto di una piastra da 24 in un incubator a 37 ° C e 5% CO 2 il giorno 1. Il supporto viene sostituito al giorno 0 con mezzo fresco o terreno fresco contenente FGF-2 10 ng / ml e le cellule vengono incubate. Le cellule sono colorate con cristalvioletto soluzione, come descritto, il giorno 6. Eventuali inibitori o agenti perturbativi vengono aggiunti il giorno 3 in 100 volumi microlitri a 10x concentrazioni desiderate e le cellule vengono incubate fino al giorno 6. (B) La comparsa di macchiato crescita e dormienti MCF-7 colonie. Colonie Growing contengono> 30 celle e colonie dormienti contengono 12 o meno celle. Cellule dormienti sono a forma di frittella, molte volte più grandi di crescita delle cellule con rapporti citoplasma / nucleo di grandi dimensioni. (Ingrandimento 100X). (C) Grafico dimostrando il potenziale clonogenico di 1.500 MCF-7 cellule di cancro al seno umano incubate con e senza FGF-2 10 ng / ml a 24 pozzetti fibronectina rivestite. Senza FGF-2, la distribuzione predominante di cellule è rappresentato da cloni crescono mentre in presenza di FGF- 2 la stragrande maggioranza dei cloni sono dormienti. Gli esperimenti sono stati fatti in quattro esemplari. (Barre di errore sono + SD)

Figura 3
Figura 3: inibizione dose-dipendente di cloni dormienti di pan-Rho famiglia inibitori C3 transferasi e Y27632 inibitore ROCK cellule T-47D sono state incubate a densità clonogenica di 1000 cellule per pozzetto in piastre da 24 pozzetti fibronectina rivestite con FGF-2. 10 ng / ml per 6 giorni. Media, C3 transferasi 3 o 5 mcg / ml, e l'inibitore ROCK Y27632 0,1, 1 o 10 mcg / ml erano il giorno 3 e cloni dormienti vennero contate giorno 6. Il grafico dimostra una inibizione dose-dipendente di cloni dormienti macchiati su giorno 6. La ED 50 di C3 era circa 3 mg / ml mentre quello dell'inibitore ROCK era fra 1 e 10 mM in questo saggio. Gli esperimenti sono stati fatti in quattro esemplari. (Barre di errore sono + SD)

jove_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Figura 4
Figura 4:. Combinato effetti di pan-Rho inibitore famiglia C3 con un inibitore Akt o con un inibitore della chinasi PI3 sulla sopravvivenza di dormienti cloni T-47D cellule T-47D sono state incubate a densità clonogenica di 1.000 cellule per bene su 24 ben fibronectina piastre Rivestiti con FGF-2 10 ng / ml per 6 giorni. Media, C3 transferasi 5 mcg / ml, Akt inibitore di 25 micron e LY294002 20 micron sono stati aggiunti singolarmente o in combinazione il giorno 3 e cloni dormienti sono stati contati il ​​giorno 6. Gli effetti combinati della C3 e l'inibitore AKT sembrano essere additivi a questi concentrazioni ma gli effetti combinati di C3 e l'inibitore PI3K sembrano essere sinergico in questi esperimenti sulla inibizione della sopravvivenza clone dormiente. Gli esperimenti sono stati fatti in quattro esemplari. (Barre di errore sono + SD)

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Figura 5:. Combinato effetti di inibitore ROCK Y27632 con un inibitore Akt o con un inibitore della chinasi PI3 sulla sopravvivenza di dormienti cloni T-47D cellule T-47D sono state incubate a densità clonogenica di 1.000 cellule per pozzetto di 24 piatti ben fibronectina rivestite con FGF-2 10 ng / ml per 6 giorni. Media, inibitore ROCK Y27632 3 mcg / ml, Akt Inhibitor 25 micron e LY294002 20 micron sono stati aggiunti singolarmente o in combinazione il giorno 3 e cloni dormienti sono stati contati il ​​giorno 6. Gli effetti combinati della Y27632 e l'inibitore AKT non sembrano essere additivo a queste concentrazioni ma gli effetti combinati di Y27632 e l'inibitore PI3K sembrano essere più che additivo in questi esperimenti sulla inibizione della sopravvivenza clone dormiente. Gli esperimenti sono stati fatti in quattro esemplari. (Barre di errore sono + SD)

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Figura 6:. L'aspetto di sopravvivere dormienti cloni T-47D dopo trattamento con C3 transferasi e inibitore ROCK Y27632 saggi Colony sono stati stabiliti in quadruplicato in 24 piastre di coltura tissutale e fibronectina rivestite a 1000 cellule / pozzetto con FGF-2, come descritto, inibitori sono stati aggiunti il ​​giorno 3, alle concentrazioni indicate, le cellule sono state colorate e fotografati il ​​giorno 6. Le cellule trattate con inibitori della famiglia pan-Rho perso il loro aspetto diffusione, si è fatto piccolo, dendritica e sembrava in difficoltà. (Ingrandimento 100X).

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Discussion

Il nostro modello è composto da diversi elementi chiave della dormienza nel midollo osseo. Consiste di estrogeni cellule sensibili, che sono del tipo destinato a rimanere sospeso nel osseo per prolungati periodi 10, si compone di fibronectina, un elemento strutturale chiave del midollo, FGF-2, un fattore di crescita abbondantemente sintetizzato dal stroma del midollo osseo e pesantemente depositato nella matrice extracellulare del midollo osseo 31,32 e l'incubazione delle cellule con densità del clonogenica dove le loro interazioni sono principalmente con il substrato. Mentre il midollo microambiente osseo è molto più complesso, questo semplice sistema può essere costruito con complessità tanto aggiunto come necessario per chiedere specifiche domande meccanicistici.

Il modello può essere utilizzato per confrontare in sospeso con crescente cellule in vari modi, tra cui cellulari tecniche biologiche, tecniche molecolari e nelle tecniche vivo. Fenotipi cellulari possono essere analizzati da ri-clonazione, la motilitàe l'invasione studia 35, tumore non aderente avviando formazione spherule 36 o da studi funzionali per l'interazione con il microambiente utilizzando anticorpi bloccanti specifici o peptidi 7.

L'uscita principale del clonogenica è un conteggio numerico colonie, in crescita o dormiente, che si traduce al potenziale clonogenico crescente o dormienti delle cellule. Come descritto in precedenza, un gran numero di variabili hanno il potenziale di pregiudicare questo risultato, ognuno dei quali deve essere controllata come rigorosamente possibile per ottenere risultati riproducibili. Questi includono la fonte di cellule, numero complessivo di passaggio, tecnica crioconservazione e la qualità delle colture cellulari che erano crioconservati, il numero di passaggi da scongelamento, la confluenza di culture da cui sono state ottenute le preparazioni cellulari singoli, la fonte e la qualità del siero fetale di vitello, le durate di tripsinizzazione e loro riproducibilità, la duratadi cellule lasciati a temperatura ambiente, la destrezza di pipettaggio numero di cellule equivalenti in ogni pozzetto, la destrezza o distribuendo uniformemente le celle su tutta la superficie di un pozzo, il numero di volte che una piastra viene rimosso dal termostato per l'osservazione, tra decine di altri. Oltre a rappresentare controlli di qualità di coltura tissutale generalmente accettati, queste variabili influenzano il potenziale clonogenico dormiente da esperimento a esperimento. La variabilità intra-sperimentale è in genere inferiore a 8-10%, tuttavia, causando variazioni percentuali da esperimento a esperimento che sono altamente riproducibili. Tipicamente, la varianza dei dati comincia a diminuire con una correlazione diretta di maggiore esperienza sperimentatore con il sistema e il tempo trascorso conducendo questo test.

L'espressione genica in cellule dormienti e crescita può essere valutata mediante RT PCR, Northern blot, Western Blot, immunoprecipitazione / Western e funzionale complesso precipitazione / Western, Immunofluorescenza o immunoistochimica, multiplexing per microfluidica, spettroscopia Raman, citometria a flusso e altre tecniche. Queste tecniche possono essere utilizzate per determinare il ruolo dei recettori specifici, altre proteine ​​di membrana, percorsi di segnalazione, fattori di trascrizione, modificatori degli istoni, organelli e proteine ​​mitocondriali, vie metaboliche e utilizzo di energia, la tensione e la forza e l'interazione con il microambiente in innumerevoli modi sul ruolo della dormienza.

I nostri studi precedenti hanno dimostrato un ruolo significativo per le vie di PI3K nella sopravvivenza di cloni dormienti 7, nonché nel mantenimento del fenotipo dormiente con la distribuzione epiteliale di actina corticale 15. Abbiamo inoltre dimostrato che RhoA specificamente, deve essere inibita in modo che il fenotipo dormiente da attivare. Questo è in contrasto con i dati presentati qui, dove l'inattivazione della famiglia Rho con pan-inibitori diminuisce sopravvivenza di cloni dormienti. Tle sue sottolineature il pericolo di usare inibitori chimici per sezionare i meccanismi e la necessità per l'utilizzo di approcci genetici per inibire o attivare specifici percorsi. A tal fine, il metodo si presta alla manipolazione genetica delle cellule, mediante trasfezione permanente o trasduzione o trasfezione transiente 15, siRNA o nanoparticelle. Dal momento che il test è di 6 giorni di durata, l'espressione genica transitoria o interferenza con esso si tradurrà in significativi effetti fenotipici in sei giorni che possono essere misurati.

Riconoscendo il suo potenziale per lo studio dei meccanismi di entrare, così come l'uscita di dormienza, stiamo studiando i meccanismi di queste cellule di sfuggire dormienza. Durante l'immissione dormienza è poco conosciuta, la comprensione dei meccanismi che regolano l'uscita dallo stato latente è ancora più sfuggente. Abbiamo riportato osservazioni preliminari che le risposte infiammatorie di stroma danneggiato può contribuire al risveglio di dorMant cellule MCF-7 con questo modello 37. Il modello può essere applicato a T-47 cellule così, un'altra linea di cellule di cancro al seno ER +. Mentre le cellule ER- non diventano dormienti in risposta alla FGF-2, può essere possibile adattare la metodologia ad altri tipi di cellule di cancro con diversi agenti di differenziazione nelle indagini future.

Pur essendo una tecnica molto utile per identificare meccanismo chiave coinvolti in dormienza, rimane un modello in vitro. Tuttavia, le cellule che hanno subito dormienza o manipolazioni in vitro possono essere testati per tumore xenotrapianto capacità di formatura. Il principale vantaggio potenziale del sistema, tuttavia, è l'identificazione di meccanismi che consentano lo sviluppo di una ipotesi che può essere testato in modelli dormienza altamente complessi in vivo.

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Disclosures

Supportato dal Dipartimento della Difesa Grants DAMD17-01-C-0343 e DAMD17-03-1-0524, la Commissione di Stato del New Jersey su Cancer Research 02-1140-CCR-E0 e Ruth Estrin Goldberg Memorial per la Ricerca sul Cancro (RW)

Acknowledgments

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MCF-7 cells ATCC HTB-22
T47D cells  ATCC HTB-123
BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate Corning 354411
BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes Corning 354403
BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes Corning 354451
BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin Corning 354088
6 Well tissue culture plate CellTreat 229106
Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder Corning Life Sciences 50-013-PB
Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum Serum Source International FB02-500HI
0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA Corning 25-053-CI
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X Corning 30-002-CI
L-Glutamine, 100x, Liquid Corning 25-005-CI
Recombinant Human FGF basic R&D Systems 234-FSE-025
Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate) CalBiochem 124005
LY294002  CalBiochem 19-142 Chenical PI3K inhibitor
C3 transferase  Cytoskeleton CTO3 Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1
Y-27632 dihydrochloride  Santa Cruz Biotechnology 129830-28-2
BODIPY FL-Phallacidin (green)  Molecular Probes B607 Fluorochrome for fibrillar actin staining
BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red)  Molecular Probes R415 Fluorochrome for fibrillar actin staining
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent  Molecular Probes R37114
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI  Molecular Probes P-36931

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References

  1. Braun, S., et al. Cytokeratin-positive cells in the bone marrow and survival of patients with stage I, II, or III breast cancer. N Engl J Med. 342 (8), 525-533 (2000).
  2. Benoy, I. H., et al. Relative microvessel area of the primary tumour, and not lymph node status, predicts the presence of bone marrow micrometastases detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction in patients with clinically non-metastatic breast cancer. Breast Cancer Res. 7 (2), R210-R219 (1186).
  3. Wapnir, I. L., Barnard, N., Wartenberg, D., Greco, R. S. The inverse relationship between microvessel counts and tumor volume in breast cancer. Breast J. 7 (3), 184-188 (2001).
  4. Wyckoff, J. B., et al. A critical step in metastasis: in vivo analysis of intravasation at the primary tumor. Cancer Res. 60 (9), 2504-2511 (2000).
  5. Phadke, P. A., et al. Kinetics of metastatic breast cancer cell trafficking in bone. Clin Cancer Res. 12 (5), 1431-1440 (2006).
  6. Braun, S., et al. Lack of an effect of adjuvant chemotherapy on the elimination of single dormant tumor cells in bone marrow of high risk breast cancer patients. J Clin Onc. 18 (1), 80-86 (2000).
  7. Korah, R., Boots, M., Wieder, R. Integrin α5β1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer Res. 64 (13), 4514-4522 (2004).
  8. Najmi, S., Korah, R., Chandra, R., Abdellatif, M., Wieder, R. Flavopiridol blocks integrin-mediated survival in dormant breast cancer cells. Clin Cancer Res. 11 (5), 2038-2046 (2005).
  9. Braun, S., et al. A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer. N England J Med. 353 (8), 793-802 (2005).
  10. Dent, R., et al. Triple-negative breast cancer: clinical features and patterns of recurrence. Clin Cancer Res. 13 (15 Part 1), 4429-4434 (2007).
  11. Kim, R. S., et al. Dormancy signatures and metastasis in estrogen receptor positive and negative breast cancer. PLoS One. 7 (4), e35569 (2012).
  12. Hanin, L. Seeing the invisible: how mathematical models uncover tumor dormancy, reconstruct the natural history of cancer, and assess the effects of treatment. Adv in Exp Med & Biol. 734, 261-282 (2013).
  13. Wilkie, K. P. A review of mathematical models of cancer-immune interactions in the context of tumor dormancy. Adv in Exp Med & Biol. 734, 201-234 (2013).
  14. Barkan, D., Green, J. E. An in vitro system to study tumor dormancy and the switch to metastatic growth. J Vis Exp. (54), e2914 (2011).
  15. Barrios, J., Wieder, R. Dual FGF-2 and intergrin α5β1 signaling mediate GRAF-induced RhoA inactivation in a model of breast cancer dormancy. Cancer Microenvironment. 2 (1), 33-47 (2009).
  16. Ganapathy, V., et al. Luminal breast cancer metastasis is dependent on estrogen signaling. Clin & Exp Metastasis. 29 (5), 493-509 (2012).
  17. Barkan, D., et al. Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton. Cancer Res. 68 (15), 6241-6250 (2008).
  18. Ghajar, C. M., et al. The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nat Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).
  19. Marshall, J. C., et al. Effect of inhibition of the lysophosphatidic acid receptor 1 on metastasis and metastatic dormancy in breast cancer. J Nat Cancer Inst. 104 (17), 1306-1319 (2012).
  20. Almog, N. Genes and regulatory pathways involved in persistence of dormant micro-tumors. Adv in Exp Med & Biol. 734, 3-17 (2013).
  21. Wang, H., et al. Basic FGF causes growth arrest in MCF-7 human breast cancer cells while inducing both mitogenic and inhibitory G1 events. Cancer Res. 57 (9), 1750-1757 (1997).
  22. Fenig, E., et al. Role of transforming growth factor beta in the growth inhibition of human breast cancer cells by basic fibroblast growth factor. Breast Cancer Res Treat. 70 (1), 27-37 (2001).
  23. Fenig, E., et al. Basic fibroblast growth factor confers growth inhibition and Mitogen-activated Protein Kinase activation in human breast cancer cells. Clinical Cancer Research. 3 (1), 135-142 (1997).
  24. Coleman-Krnacik, S., Rosen, J. M. Differential temporal and spatial gene expression of fibroblast growth factor family members during mouse mammary gland development. Molecular Endocrinology. 8 (2), 218-229 (1994).
  25. Plath, A., et al. Expression and localization of members of the fibroblast growth factor family in the bovine mammary gland. J Dairy Science. 81 (10), 2604-2613 (1998).
  26. Lavandero, S., Chappuzeau, A., Sapag-Hagar, M., Oka, T. In vivo and in vitro evidence of basic fibroblast growth factor action in mouse mammary gland development. FEBS letters. 439 (3), 351-356 (1998).
  27. Sinowatz, F., Schams, D., Plath, A., Kolle, S. Expression and localization of growth factors during mammary gland development. Adv in Exp Med & Biol. 480, 19-27 (2000).
  28. Korah, R., Sysounthone, V., Scheff, E., Wieder, R. Intracellular FGF-2 promotes differentiation in T47-D breast cancer cells. Biochem Biophys Res Comm. 277 (1), 255-260 (2000).
  29. Korah, R., Das, K., Lindy, M. E., Hameed, M., Wieder, R. Co-ordinate loss of FGF-2 and laminin 5 expression during neoplastic progression of mammary duct epithelium. Human Pathology. 38 (1), 154-160 (2007).
  30. Wieder, R., et al. Overexpression of basic fibroblast growth factor in MCF-7 human breast cancer cells: lack of correlation between inhibition of cell growth and MAP kinase activation. J. Cellular Physiology. 177, 411-425 (1998).
  31. Brunner, G., Gabrilove, J., Rifkin, D. B., Wilson, E. L. Phospholipase C release of basic fibroblast growth factor from human bone marrow cultures as a biologically active complex with a phosphatidylinositol-anchored heparan sulfate proteoglycan. J Cell Biol. 114 (6), 1275-1283 (1991).
  32. Wilson, E. L., Rifkin, D. B., Kelly, F., Hannocks, M. J., Gabrilove, J. L. Basic fibroblast growth factor stimulates myelopoiesis in long-term human bone marrow cultures. Blood. 77 (5), 954-960 (1991).
  33. Gupta, P., McCarthy, J. B., Verfaillie, C. M. Stromal fibroblast heparan sulfate is required for cytokine-mediated ex vivo maintenance of human long-term culture-initiating cells. Blood. 87 (8), 3229-3236 (1996).
  34. Chatterjee, M., van Golen, K. L. Farnesyl transferase inhibitor treatment of breast cancer cells leads to altered RhoA and RhoC GTPase activity and induces a dormant phenotype. Int J Cancer. 129 (1), 61-69 (2011).
  35. Korah, R., Sysounthone, V., Golowa, Y., Wieder, R. Basic fibroblast growth factor confers a more differentiated phenotype in MDA-MB-231 human breast cancer cells. Cancer Res. 60 (3), 733-740 (2000).
  36. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  37. Tivari, S., Lu, H., Dasgupta, T., Wieder, R. Reactivation of dormant estrogen-dependent breast cancer micrometastases by bone marrow stromal injury in an in vitro model of dormancy. Proceedings of the 105th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research. , AACR. San Diego, CA. Philadelphia (PA). (2014).

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Medicina emissione 100 dormienza stroma del midollo osseo FGF-2 fibronectina cancro al seno test Colony
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Tivari, S., Korah, R., Lindy, M., Wieder, R. An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation. J. Vis. Exp. (100), e52672, doi:10.3791/52672 (2015).

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