Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Um Published: June 30, 2015 doi: 10.3791/52672

Introduction

Células de cancro da mama metastizar para a medula óssea antes de a doença é detectável 1, assim que os tumores se desenvolvem pequenos vasos sanguíneos 2,3. O processo metastático é rápida, mas ineficiente. Células entram os novos vasos sanguíneos rapidamente, a milhões por dia 4, mas poucos sobrevivem a viagem para órgãos distantes 5. No entanto, algumas micrometástases sobreviver no osso e pode ser encontrado como células individuais ou pequenos aglomerados de células nos aspirados de medula óssea de pacientes recentemente diagnosticados 1. Estas células resistem à quimioterapia adjuvante, que é administrado pela própria finalidade de eliminá-los 6. Esta resistência é dotado, substancialmente, por sobrevivência sinalização iniciada por interacções com o microambiente da medula óssea 7,8. Micrometástases pode ser encontrado em cerca de um terço das mulheres com câncer de mama localizado e representam um indicador independente de sobrevida quando analisados ​​por análise univariada 9. Alguns micrometástases são o crescimento iniciado, mas padrões de retorno depende do tipo de célula. Pacientes com câncer de mama triplo negativo tendem a recorrer entre 1 a 4 anos, sugerindo pobre controle sobre o estado de dormência. Outros tipos de células, incluindo ER / PR +, células podem permanecer dormentes por até 20 anos, com uma taxa constante e contínuo de recorrência 10. Embora as diferenças em dormência assinaturas de expressão gênica entre ER- linhas de células de mama e tumores ER + e refletem diferentes potenciais de dormência 11, interacções com estroma da medula óssea provavelmente representam um contributo significativo para a dormência.

O estudo de dormência in vivo é excepcionalmente difícil porque micrometástases são raros e estão em desvantagem por células hematopoiéticas em mais de 10 vezes de 6. Assim, os modelos relevantes devem ser gerados que fornecem dados in vitro que pode sugerir mecanismos e gerar hipóteses testáveis ​​in vivo. Uma série de modelos de dormência, incluindo mathemodelos matical 12,13, modelos in vitro, in vivo 7,8,14,15 modelos de xenotransplante de 16, combinações de in vitro e modelos de xenotransplante de 17,18 e tumorais e metástases modelos espontâneos 19, têm rendido alguns insights sobre a dormência célula cancerosa 20 . Cada um desses modelos têm as suas próprias limitações e são em si principalmente útil para gerar hipóteses sobre a sinalização molecular e interações que regem a dormência a ser testada em modelos mais biologicamente relevantes.

Com o objetivo geral de definir os mecanismos moleculares de dormência, as interações com o microambiente que resulta na paragem do ciclo, rediferenciação e resistência e os mecanismos terapêuticos que resultam em recorrência em células ER +, desenvolvemos um modelo in vitro que fornece selecionado elementos relevantes da estromal microambiente 7. Este modelo, embora relativamente escassa em seu componentes, é suficientemente robusto para permitir investigadores para derivar mecanismos moleculares específicos que afectam funções significativas de dormência. Estas experiências gerar hipóteses que podem ser directamente testados in vivo. O modelo baseia-se em alguns elementos-chave que demonstraram ser relevante em dormência. Eles incluem a utilização de células de cancro da mama dependentes de estrogénio, a cultura de células a uma densidade clonogénico onde a sua interacção é principalmente com o substrato e os componentes solúveis do meio, um substrato fibronectina e a presença do factor de crescimento básico de fibroblastos (FGF-2) no meio.

Foram caracterizados os mecanismos que governam o sistema in vitro, incluindo a indução de paragem do ciclo celular por FGF-2 21, mediada através de TGFp 22, a sobrevivência a sinalização através de PI3-quinase ERK 7,8 e 8 e diferenciação morfogénica para um fenótipo epitelial, que dependia RhoA inactivação, integrina45; 5β1 regulação positiva e ligadura de fibronectina do estroma para a sobrevivência 7,15 (Figura 1). Os efeitos do ciclo celular in vitro de FGF-2 em células MCF-7 em concentrações começam pelo menos um log inferior a 10 ng / mL 21,23. A lógica baseou-se no controlo temporal da expressão de FGF-2 que regula a morfogénese ductal da mama, de expansão cíclica e recessão em um certo número de sistemas de mamíferos 24-27. Nós demonstramos que o FGF-2 induz a diferenciação, incluindo morfogénese ductal in cultura 3D 28, e que a expressão de FGF-2 são geralmente perdido com a transformação maligna de tumores humanos 29. A expressão de FGR1 permaneceu intacto em carcinomas da mama examinados 29 e MCF-7 de células continuam a expressar todos os quatro receptores de FGF 30. No contexto da dormência, o FGF-2 é exportada por e fortemente depositado em estroma de medula óssea 31,32 onde funciona na preservação de células-tronco hematopoiéticas 33. Nós demmonstrado que o FGF-2 induz um estado dormente em ER + do câncer de mama células cultivadas em substratos fibronectina, também abundantes na medula, onde induz a diferenciação morphogenic 7. No modelo, as células de cancro da mama são crescimento inibido, inactivar Rho A através do RhoGap Graf, redifferentiate a um fenótipo epitelial e re-express integrinas α5β1 lost com a progressão maligna. Ligam-se fibronectina através integrina α5β1 e activar a sobrevivência de sinalização que torná-las resistentes à terapia citotóxica 7,8,15 (Figura 1). A inibição de Rho GTPases classe tem sido demonstrado anteriormente para induzir um fenótipo dormente 34.

Aqui vamos delinear os procedimentos específicos que permitam aos investigadores estabelecer o modelo e estudar os mecanismos moleculares e celulares específicas que regulam a dormência das células ER + do câncer de mama. Nas experiências aqui apresentadas para ilustrar o uso do modelo, Que orientada via PI3K (Figura 1B) com um inibidor Akt e um inibidor de PI3K e todos os membros da família Rho (Figura 1B) com um inibidor da pan-Rho e Rho cinase um (ROCK) inibidor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Ensaio clonogénico

  1. Preparar um único suspensões de células de linhas celulares do cancro da mama dependentes de estrogénio de células MCF-7 e T47D utilizando os passos descritos abaixo
    1. Aspirar o meio de cultura (DMEM / 10% inactivado pelo calor soro fetal de vitelo / glutamina e Pen / Strep) a partir de 10 cm do tecido placa de cultura, que é não confluentes mais de 50% com células T-47D MCF-7 ou. Lavar com PBS. Incubar com tripsina a 0,25% / EDTA 2,21 mM dissolvido em DMEM de alto teor de glucose a 37 ° C durante 1-4 min.
    2. Confira as células em um mínimo de intervalos sob um microscópio de contraste de fase para garantir uma distribuição única célula. Volte a suspender as células com uma pipeta 2 ml por pipetagem cima e para baixo várias vezes para interromper contato célula-célula para atingir, um status de única célula quase invariável.
    3. Continue a incubar células em tripsina a 37 ° C por até 4 min, se você observar aglomerados de células depois de apenas 2 min de incubação. Não use essas células para estudos clonogénicos se eles permanecem aderentes ao each outro após 4 min de tripsinização porque o erro será introduzido no rendimento número colônia.
      NOTA: Se as células são aglutinados, o número de colônias formadas irá reflectir o produto de menos células do que o número incubadas. Se as células são tratadas com tripsina excessivamente, o seu potencial clonogénico pode ser diminuída.
    4. Prepara-se uma suspensão de células única de 1500 células / ml de meio de cultura para placas de 24 cavidades, ou menos, de (+ 500 células / ml, dependendo do tipo de célula ou o número de passagem), através de diluições em série em um tubo principal que contém todo o volume necessário para a todas as variáveis ​​no experimento.
      NOTA: O objectivo é uma densidade final de células de 800 células / cm2 (gama de aproximadamente 500 a 1100 células / cm2). O objectivo é produzir aproximadamente 100 + 50 colónias, que permite a contagem relativamente fácil, impede aglomeração e permite colónias suficientes para resultar em diferenças estatisticamente significativas quando as colónias são aumentadas ou diminuídas por perturba experimentalções.
  2. Incube as células a clonogénico de densidade usando etapas descritas abaixo
    1. Incubar as células em poços em quadruplicado em 24 placas revestidas com fibronectina a uma densidade de 1500 células clonogénicas / poço a partir de um tubo de suspensão de células individuais mestre de 1500 células / ml. Triturar o meio contendo células com uma pipeta 5 ml através da elaboração de 3 ml e 1 ml de meio de distribuição em cada um dos dois poços.
      NOTA: A fibronectina revestido placas devem ser compradas pré-revestido a partir de um fornecedor comercial. Placas de revestimento fora de uma qualidade controlada, processo resulta automatizados em uma superfície irregular inadequada para este ensaio.
    2. Misture a suspensão por pipetagem cima e para baixo com uma pipeta de 5 ml, 3 ml elaborar de suspensão de células e preencher 2 poços com 1 ml cada. Encha apenas dois poços de uma só vez a partir de uma pipeta. Retorne o volume restante na pipeta à suspensão de células no tubo principal, voltar a suspender as células novamente pipetando cima e para baixo e elaborar outros 3 ml para encher outro 2 welsl com 1 ml cada.
      NOTA: mistura contínua do tubo principal é necessário porque as células irão sedimentar continuamente. Desenhando-se um volume suficiente para encher apenas dois poços é necessário adicionar o número de células semelhantes a cada poço, porque as células sedimentar na pipeta bem.
    3. Trabalhar rapidamente para distribuir as grandes volumes de células porque as células que permitem a sentar-se em suspensão à temperatura ambiente e concentração de CO 2 vai modulam suas potenciais (observações não publicadas) clonogénicos.
    4. Otimizar a distribuição espacial das células durante o ato de pipetar-los em poços para ensaios de colónias. Fazê-lo pipetando lentamente a suspensão contendo a concentração final de células no meio do poço. Não sujeite a placa para promover o movimento antes que as células se depositam no fundo. Não rodar a placa circular porque mistura irá eficazmente centrifugar as células para o perímetro das densidades celulares elevadas e assim criando colónias confluentes incontáveis ​​a 6 dias.
      NOTA: Não misture a menos que necessário uma vez que este é menos desejável que nenhuma mistura em tudo depois de introduzir o volume com as células em suspensão. Se é necessário para misturar as células, fazê-lo em movimento a placa para trás e para a frente em direcções perpendiculares, enquanto que repousa sobre uma superfície plana.
    5. Incubar as células a 37 ° C, 5% de CO 2, sem mudança de meio, durante 6 dias. O pequeno número de células em um poço após 6 dias não vai ter impacto significativo na composição de nutrientes ou de citoquinas nem o pH do meio original.
    6. Design o decurso de tempo do ensaio do seguinte modo: Incubar as células em fibronectina substratos revestidos no dia 1. Substitua meio existente, com 1 ml de meio fresco ou meio fresco contendo 10 ng / ml no dia 0. As células mancha no dia 6 como abaixo de 2 FGF- em 1.4). Realizar quaisquer perturbações experimentais no dia 3, como abaixo de 1.3).
  3. Configurar Perturbations experimentais de sinalização molecular ou Moléculas de Adesão
    1. No dia 3, adicionar 10056; l de uma solução contendo 10x da concentração final pretendida do agente perturbador para a forma de 1 ml nos poços. Não misture. Continue-se a incubar as células a 37 ° C, 5% de CO 2 por 3 dias adicionais.
      NOTA: agentes Perturbando pode incluir uma variedade de agentes bloqueadores e inibidores de moléculas de adesão, receptores ou outras proteínas de superfície, os inibidores de vias de sinalização intracelulares, moléculas, factores, co-factores ou proteínas estruturais, que podem desempenhar um papel no apoio ao estado dormente.
    2. Colónias mancha no dia 6, como segue.
  4. Colônias Mancha
    1. Células mancha após 6 dias em cultura com um recém-feitos 0,1% violeta de cristal em 2% de etanol / 10 mM borato de sódio solução (pH 9,0). Meios Aspirar e adicionar uma solução de violeta de cristal ml a cada poço durante 20 minutos.
    2. Lavar as placas por imersão com as aberturas de poços virados para baixo em um ângulo agudo em um balde de gelo repleto de execução contínua da torneiraágua na pia. Incline a placa em um ângulo horizontal, uma vez debaixo de água, bem abrindo para baixo, e em seguida, incline para trás a um ângulo agudo ao remover em um movimento que flui suave.
    3. Repetir a imersão 2 ou 3 vezes até que a água no fundo dos poços não é mais azul. Lavagens vigorosa pode remover as células ou as colónias que são menos aderente devido à intervenção experimental, adicionando significativamente ao erro na contagem e os dados.
    4. Chapas secas durante a noite, colocando-os de cabeça para baixo em toalhas na bancada adjacente às suas correspondentes tampas marcadas.
  5. Contagem de colónias
    1. Contar o número de colónias em crescimento e latentes em cada poço após 6 dias de incubação, a coloração e secagem. Contagem das colónias optimamente a 40X em um microscópio de contraste de fase invertida. Contagem de colônias de> 30 células como crescer e colônias de 12 ou menos células, com o aspecto morfológico de tamanho muito grande em comparação com células em crescimento, grande Expacitoplasma NDED com grande citoplasma para núcleo rácios, mostrado na Figura 1 7,15.
      NOTA: Conjuntos de 13-29 células normalmente não são contados como eles não são muito frequentes em ensaios de dormência simples. Eles podem ser contadas se perturbações deslocar o potencial de crescimento da utilização de células em crescimento ou dormentes. Estes resultados terão então de ser correlacionado com significado biológico.

2. clonogénico Incubação de Estudos de imunofluorescência

  1. Ajustar o número de células de aproximadamente 7,500-8,000 células / poço em placas de 6 cavidades, para corresponder à célula números de área de superfície / análogo a 24 experiências bem.
  2. Coloque uma rodada, estéril, tampa de deslizamento revestido de fibronectina em cada base poço de placas de 6 poços para estudos de imagem antes da adição de células. Pipetar as células em volumes de 3 mL em cada poço 2 poços de uma vez em concentrações descritas, tal como descrito para as experiências clonogénicas acima em 1.2).
  3. Incubar as célulasdurante 6 dias, como acima em 1.2.4 e 1.2.5. Adicionar factores perturbadores no dia 3 a 10X a concentração em volumes de 300 ul, tal como descrito nos procedimentos de ensaio de colónia em 1.3).
  4. Células mancha no dia 6, com anticorpos para moléculas de adesão celular tais como as integrinas α4, α5, α6, β1, β3, por exemplo, moléculas de adesão focal complexos FAK, paxilina e vinculina, por exemplo, proteínas envolvidas na motilidade, tais como α-tubulina, por exemplo, membros da via de sinalização, tal como fosfo-Akt, fosfo-ERK, fosfo-p38, fosfo-JNK, por exemplo, ou qualquer outra proteína que é o alvo de investigação para o seu papel em dormência, utilizando técnicas padrão para directa ou indirecta imunofluorescência.
    1. Retirar as lâminas com uma pinça dia 6. Fix em acetona / metanol 1: 1 a -20 ° C durante 20 min e o ar seco. Um fixador alternativo, tal como paraformaldeído, pode ser utilizado, se necessário. Permeabilizar as células com 0,1% de Triton X-100, 0,1% de citrato de sódio durante 2 min fou detecção de antigénios intracelulares. Lavar as células com PBS.
    2. Para a coloração indirecta immunofluorecence, bloco desliza durante 1 h à temperatura ambiente com BSA a 5% ou com 10% de soro pré-imune das espécies em que o anticorpo secundário foi gerado.
    3. Incubar durante a noite a 4 ° C com os anticorpos primários para a célula moléculas de adesão, moléculas complexas focais, a sinalização da via de membros ou qualquer outra proteína que é o alvo de investigação para o seu papel em dormência diluído para as diluições específicas recomendadas pelo fabricante em PBS 0,1% de Triton X -100.
    4. Lavar 3 vezes com PBS. Incubar lamelas com anticorpos conjugados com fluoróforo à temperatura ambiente durante 2 h. Como um exemplo, Alexa Fluor 488 de burro anti-IgG de ratinho de anticorpos podem ser utilizados para detectar anticorpos primários monoclonais de murino. Mount lamelas lado célula para baixo em lâminas de vidro, utilizando um agente antifade com DAPI. Selar os perímetros com unha polonês.
    5. Para imunofluorescência direta, realizar a BSAbloqueio como acima no ponto 2.4.2), incubar com o anticorpo primário conjugado com fluoróforo durante a noite a 4 ° C. Lavar 3 vezes com PBS. Incubar as lâminas com um agente antifade e Dapi e selo com unha polonês.
    6. Bandejas tampa deslizante com folha de alumínio e armazenar a 4 ° C para geração de imagens ea fotografia a qualquer hora até várias semanas depois. Veja fotos e células utilizando quaisquer sistemas de imagens microscópicas de fluorescência equipado com uma câmera de 1000X ampliação.
    7. Para a coloração de actina fibrilar, bloco desliza em 1% de albumina de soro bovino (BSA) durante 30 min e incubar em BODIPY FL-Phallacidin (verde) ou rodamina-faloidina (vermelho) à temperatura ambiente durante 20 min. Adicionar um agente antifade e selar como acima.

3. clonogénico Incubação de Estudos Moleculares

  1. Western Blots
    1. Incubar ER + do câncer de mama células MCF-7 ou T47D em densidades clonogénicos de 20.000 células / placa de 60 mm e 50.000 células / placa 100mm em fibronecplacas a 37 ° C em 5% de CO 2 revestido de estanho.
    2. Incubar as células em densidades ligeiramente superiores de 75.000 células / 100 mm placa para estudos moleculares que exijam montantes mg para proteína de lisados. Use até dez placas por ponto experimental para coletar proteína suficiente para estudos moleculares utilizando Western blot ou para isolamento de RNA de transferência de Northern.
    3. O número de células de gel com base de carregamento é um complemento necessário para comparar a expressão da proteína em células de cultivo e dormentes vastamente diferentes tamanhos. Recolher as células por trypsinizing e contagem de uma alíquota num hemocitómetro em 0,2% de Azul de Tripano, para preparação de lisados ​​de Western blot em vez de raspar as células com uma única lâmina de borda.
    4. Células de centrífuga a 10.000 xg durante 2 minutos, retirar o suporte por aspiração, adicionar 200 ul de tampão de lise, sonicar as células em tampão de lise e determinar a concentração de proteína.
    5. Calcula-se a quantidade de proteína por célula, dividindo a produção de proteína ao número de célulasque gerou esse montante. Carregar o lisado para cada poço de géis de poliacrilamida separadas que representa tanto a) quantidades equivalentes de proteína e b) as quantidades de proteína que representam o número de células equivalentes. Pelo menos 25 mg de proteína deve ser carregado em cada poço.
      NOTA: Isto irá permitir comparações entre crescimento e dormentes células, que são significativamente diferentes em tamanho e conteúdo de proteína (Figura 1).
  2. Citometria de Fluxo
    1. Recolher as células a partir de placas de 100 mm por tripsinização, como em 3.1 e analisar por células activadas por fluorescência (FACS padrão) usando protocolos de coloração por imunofluorescência primário ou secundário tanto para antigénios intracelulares ou extracelulares, como descrito em 2.4.
      NOTA: Desanexando células a partir das placas de cultura de tecidos por tripsinização não afecta a concentração de proteínas de membrana, conforme determinado por marcação com anticorpos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

As experiências foram conduzidas de recapitular o ensaio. O curso do tempo da experiência é mostrado na Figura 2A. As células são incubadas a densidade clonogénico no dia -1, é adicionado FGF-2 em meio fresco no dia 0 e as células são cultivadas até ao dia 6, quando eles são coradas e as colónias são contadas. Quaisquer perturbações do sistema são administrados no dia 3 em volumes de 100 uL a 10X a concentração final desejada. A Figura 2B mostra a aparência típica de crescimento e dormentes colónias. Colónias crescentes conter> 30 células e colônias dormentes conter 12 ou menos células que são muitas vezes maiores do que as células em crescimento, com grandes proporções citoplasma / núcleo. Figura 2C demonstra um resultado experimental típico realizado em quadruplicado. A distribuição predominante de células sem adição de FGF-2 é representado por clones em crescimento, enquanto, na presença de FGF-2, a grande maioria dos clones estão dormentes.

ontent "> A Figura 3 é um exemplo de uma experiência na qual foram adicionados agentes perturbadoras no dia 3. A figura representa a inibição dependente da dose de clones dormentes por inibição da família Rho de GTPases por uma panela de Rho-transferase e um inibidor C3 Rho cinase (ROCK) inibidor Y27632. O ensaio pode avaliar a ED50 de inibidores adicionados em clones latentes, bem como os clones que crescem. Nesta experiência, o efeito em clones em crescimento não foi determinada, uma vez que só foi apresentada para ilustrar a metodologia.

As Figuras 4 e 5 demonstram que o ensaio pode ser usado para avaliar os efeitos combinados de inibidores sobre a sobrevivência de clones latentes. Os nossos estudos anteriores demonstraram que a via PI3K passa por uma activação sustentada em células dormentes neste modelo e inibição de ambas as PI3K e Akt inibe parcialmente a sobrevivência dos clones 7 latentes. Aqui, observações preliminares, demonstraram tchapéu de inibição não específica da família Rho de GTPases pequenas também inibe parcialmente a sobrevivência de clones dormentes. Os dados apresentados nas Figuras 4 e 5 demonstram que a combinação de inibição de PI3K e um dos seus efectores a jusante, AKT, com a inibição da família Rho com transferase C3 e um inibidor de rocha pode eliminar quase completamente a sobrevivência de clones latentes em algumas circunstâncias. Nós já anteriormente demonstrado que os clones dormentes sobreviver à inibição de PI3K da Akt, mas não são compostos de células que já não apresentam o fenótipo dormente, mas aparecem mesenquimais e afligido 7. As células em clones dormentes em que a família Rho tem sido amplamente inibida por C3 transferase e o inibidor ROCHA também perdem a aparência típica dormente, assumir aparências fibrolastoid e membranas de babados e também aparecem angustiado (Figura 6). Estas experiências demonstram um modelo que pode ser consultado em um muito largooad forma a alcançar uma compreensão dos elementos que governam a dormência e resistência à terapia.

Figura 1
Figura 1: mecanismos que regem o nosso modelo in vitro de dormência (a) o crescimento e dormentes MCF-7 clones após 6 dias de incubação a densidade clonogénico em placas revestidas com fibronectina com e sem FGF2 10 ng / ml 7 (amplificação de 100X).. Esquema (B) Resumo descrevendo os dados que FGFR e integrina α5β1 paralelo sinalização estado estável é necessária para ativar e manter a dormência 7. FGF-2 upregulates inibidores de cinase dependentes de ciclina, resultando em G1 detenção 21, activa a ERK 8 e PI3-cinase 7 que initiatesurvival sinalização e regulam positivamente integrina α5β1 7, que atinge o estado estacionário, após vários dias. Throug sinalização duplah FGFR através PI3K e de forma independente através da ligadura de integrina α5β1 por fibronectina são necessários para a ativação da FAK e localização da membrana e ativação da RhoA GAP GRAF 15. Isso resulta em inactivação de RhoA e um estado estacionário permissivo para rearranjo cortical de F-actina (fotomicrografia manchado de phalloidin), epiteliais re-diferenciação e dormência 15. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Elementos do ensaio de dormência in vitro (A) Esquema dos componentes temporais do ensaio de dormência.. As células são incubadas em placas revestidas com fibronectina de tecido de cultura com uma densidade clonogénicas, a uma densidade máxima de 1,500 células / poço de uma placa de 24 poços em um incubator a 37 ° C e 5% de CO 2 no dia 1. O meio é substituído no dia 0 com meio fresco ou meio fresco contendo o FGF-2 10 ng / mL e as células são re-incubadas. As células são coradas com solução de violeta de cristal, tal como descrito, no dia 6. Os inibidores ou agentes de perturbação são adicionados no dia 3 em volumes de 100 ul em 10x concentrações desejadas e as células são re-incubadas até ao dia 6. (B) O aparecimento de coradas crescendo e dormentes MCF-7 colônias. Colónias crescentes conter> 30 células e colônias dormentes conter 12 ou menos células. Células dormentes são em forma de panqueca, muitas vezes maior do que as células em crescimento, com grandes proporções citoplasma / núcleo. (Amplificação de 100X). (C) Gráfico demonstrando o potencial clonogénico de 1500 células MCF-7 de cancro da mama humanas foram incubadas com e sem FGF-2 10 ng / ml em placas de 24 poços revestidas com fibronectina. Sem o FGF-2, a distribuição predominante de células é representada por clones em crescimento, enquanto na presença de FGF- 2 a grande maioria dos clones estão dormentes. As experiências foram feitas em quadruplicado. (As barras de erro são + SD)

Figura 3
Figura 3: inibição dose-dependente de clones dormentes por Pan-família Rho inibidores da transferase C3 e o inibidor Y27632 ROCHA células T-47D foram incubadas a uma densidade de 1000 células clonogénicas por poço em placas de 24 poços revestidas com fibronectina-FGF-2. 10 ng / ml durante 6 dias. Meios, C3-transferase 3 ou 5 ug / ml, e o inibidor ROCHA Y27632 0,1, 1 ou 10 ug / ml foram no dia 3 e os clones dormentes foram contadas no dia 6. O gráfico demonstra uma inibição dose-dependente de clones corados em dormentes dia 6. O ED50 de C3 foi de aproximadamente 3 ug / ml, enquanto que o inibidor de rocha foi entre 1 e 10 uM neste ensaio. As experiências foram feitas em quadruplicado. (As barras de erro são + SD)

jove_content "fo: manter-together.within-page =" always "> Figura 4
Figura 4:. Combinado efeitos de pan-família Rho inibidor C3 com um inibidor Akt ou com um inibidor de PI3-quinase sobre a sobrevivência de dormentes clones T-47D células T-47D foram incubadas a uma densidade de 1000 células clonogénicas por cavidade em 24 cavidades de fibronectina -Revestido placas com FGF-2 10 ng / ml durante seis dias. Meios, C3-transferase de 5 ug / mL, 25 uM de inibidor Akt e LY294002 20 uM foram adicionados individualmente ou em combinação no dia 3 e os clones dormentes foram contadas no dia 6. Os efeitos combinados de C3 e o inibidor de AKT parecem ser aditivos para estes concentrações mas os efeitos combinados de C3 e o inibidor de PI3K parecem ser sinérgica nestas experiências sobre a inibição da sobrevivência clone dormente. As experiências foram feitas em quadruplicado. (As barras de erro são + SD)

= "Figura 5" src = "/ files / ftp_upload / 52672 / 52672fig5.jpg" />
Figura 5:. Combinado efeitos de inibidor ROCHA Y27632 com um inibidor Akt ou com um inibidor de PI3-quinase sobre a sobrevivência de dormentes clones T-47D células T-47D foram incubadas a uma densidade de 1000 células clonogénicas por poço em placas de 24 poços revestidas com fibronectina- com FGF-2 10 ng / ml durante seis dias. Meios, inibidor ROCHA Y27632 3 ug / ml, Akt inibidor 25 uM e LY294002 20 uM foram adicionados individualmente ou em combinação no dia 3 e os clones dormentes foram contadas no dia 6. Os efeitos combinados de Y27632 e o inibidor de AKT não parecem ser aditivo a estas concentrações, mas os efeitos combinados de Y27632 e o inibidor de PI3K parecem ser mais do que aditivo nestas experiências sobre a inibição da sobrevivência clone dormente. As experiências foram feitas em quadruplicado. (As barras de erro são + SD)

.jpg "/>
Figura 6:. O aparecimento de sobreviver dormentes clones T47-D depois do tratamento com o inibidor de transferase C3 e ROCHA Y27632 ensaios de colónias foram estabelecidas em quadruplicado em 24 placas de cultura de tecidos bem fibronectina revestidos a 1000 células / poço com FGF-2, tal como descrito, inibidores foram adicionados no dia 3 às concentrações mostradas, as células foram coradas e fotografado no dia 6. As células tratadas com inibidores da família pan-Rho perdeu sua aparência spread, tornou-se pequeno, dendrítica e parecia angustiado. (Amplificação de 100X).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

O nosso modelo é composta por vários elementos chave de dormência na medula óssea. É composto de estrogénio células sensíveis, que são do tipo susceptíveis de permanecer dormentes na medula por períodos prolongados 10, que consiste de fibronectina, um elemento estrutural chave da medula, o FGF-2, um factor de crescimento abundantemente sintetizado pelo estroma da medula óssea e fortemente depositado na matriz extracelular da medula óssea 31,32 e incubação de células clonogénicas, em densidade, onde as suas interacções são principalmente com o substrato. Enquanto o microambiente da medula óssea é muito mais complexo, este sistema simples pode ser construída com a complexidade tanto adicionados conforme necessário para fazer perguntas específicas mecanicistas.

O modelo pode ser usado para comparar com o dormente células crescendo em um número de maneiras, incluindo técnicas biológicas moleculares, técnicas de células e em técnicas in vivo. Fenótipos celulares podem ser ensaiados por re-clonagem, motilidadee invasão estuda 35, iniciando a formação de tumores não aderente esférula 36 ou por estudos funcionais para a interacção com o microambiente usando anticorpos ou péptidos específicos de bloqueio 7.

A saída primário do ensaio clonogénico é uma contagem numérica de colónias, antes crescendo ou dormente, o que se traduz para o crescimento ou dormente potencial clonogénico das células. Como implicado acima, um grande número de variáveis ​​têm o potencial de afectar este resultado, todos os quais devem ser rigorosamente controlada como quanto possível, para se obter resultados reprodutíveis. Estes incluem a fonte de células, o número total de passagem, a técnica de criopreservação e a qualidade das culturas de células que foram criopreservadas, o número de passagens, desde a descongelação, a confluência das culturas a partir do qual foram obtidas as preparações de células individuais, a origem e a qualidade da soro fetal de vitelo, as durações de tripsinização e sua reprodutibilidade, a duraçãode células foi deixada à temperatura ambiente, a destreza de pipetagem números equivalentes de células em cada poço, a destreza ou distribuir uniformemente as células através de toda a área da superfície de um poço, o número de vezes que uma placa é removida da incubadora para observação, entre dezenas de outros. Além de representar os controles de qualidade de cultura de tecidos geralmente aceites, estas variáveis ​​afetam o potencial clonogénico dormente de experiência para experiência. Variabilidade intra-experimental é tipicamente inferior a 8-10%, no entanto, resulta em alterações percentuais a partir de experiência para experiência que são altamente reprodutíveis. Tipicamente, a variância dos dados começa a diminuir com uma correlação directa do aumento da experiência do experimentador com o sistema e o tempo gasto a realização deste ensaio.

A expressão de genes em células dormentes e crescimento pode ser avaliada por RT PCR, Northern blot, Western blot, imunoprecipitação / Western e funcional complexo precipitação / Western, Imunofluorescência ou imunohistoquímica, multiplexação por microfluídica, espectroscopia Raman, citometria de fluxo e outras técnicas. Estas técnicas podem ser usadas para determinar os papéis de receptores específicos, outras proteínas de membrana, as vias de sinalização, factores de transcrição, modificadores de histonas, organelas e proteínas mitocondriais, vias metabólicas e de utilização de energia, de tensão e força de e interacção com o microambiente de inúmeras maneiras sobre o papel de dormência.

Os nossos estudos anteriores demonstraram papéis significativos para as vias de PI3K na sobrevivência dos clones 7 latentes, bem como na manutenção do fenótipo de dormente com a distribuição epitelial de actina cortical 15. Também demonstramos que RhoA especificamente, deve ser inibida a fim de que o fenótipo dormente para ser activado. Isto está em contraste com os dados aqui apresentados, em que a inactivação da família Rho com inibidores pan diminui a sobrevivência de clones latentes. Tseus sublinhados o perigo de usar inibidores químicos para dissecar os mecanismos ea necessidade de uso de abordagens genéticas para inibir ou ativar vias específicas. Para este fim, o método se presta a manipulação genética das células, quer por transfecção ou transdução permanente ou por transfecção transitória 15, siRNA ou nanopartículas. Uma vez que o ensaio é de 6 dias de duração, a expressão do gene transitório ou interferência com o que irá resultar em efeitos fenotípicos significativas em 6 dias que podem ser medidos.

Reconhecendo o seu potencial para o estudo de mecanismos de entrar, bem como sair da dormência, estamos investigando atualmente mecanismos para que estas células para escapar de dormência. Durante a introdução de dormência é mal compreendida, uma compreensão dos mecanismos que regulam a sair do estado de dormência é ainda mais evasivo. Nós relatamos observações preliminares que respostas inflamatórias por estroma lesionado pode contribuir para o despertar da dormant células MCF-7, utilizando este modelo 37. O modelo pode ser aplicado a células T-47, bem como, uma outra linha celular de cancro da mama ER +. Enquanto as células ER- não se tornam dormentes em resposta a FGF-2, pode ser possível adaptar o método para outros tipos de células de cancro com agentes de diferenciação diferentes em futuras investigações.

Apesar de ser uma técnica muito útil para a identificação de mecanismos chave envolvidos na dormência, continua a ser um modelo in vitro. No entanto, as células que tenham sido submetidos a dormência ou manipulação in vitro podem ser testados quanto à capacidade de formação de tumor de xenoenxerto. O principal benefício potencial do sistema, no entanto, é a identificação de mecanismos que permitem o desenvolvimento de uma hipótese que pode ser testada in vivo em modelos de dormência altamente complexas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Compatível com o Departamento de Defesa Grants DAMD17-01-C-0343 e DAMD17-03-1-0524, a Comissão Estado de Nova Jersey em Cancer Research 02-1140-CCR-E0 ea Ruth Goldberg Estrin Memorial para Pesquisa do Câncer (RW)

Acknowledgments

Os autores não têm nada a revelar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MCF-7 cells ATCC HTB-22
T47D cells  ATCC HTB-123
BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate Corning 354411
BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes Corning 354403
BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes Corning 354451
BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin Corning 354088
6 Well tissue culture plate CellTreat 229106
Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder Corning Life Sciences 50-013-PB
Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum Serum Source International FB02-500HI
0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA Corning 25-053-CI
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X Corning 30-002-CI
L-Glutamine, 100x, Liquid Corning 25-005-CI
Recombinant Human FGF basic R&D Systems 234-FSE-025
Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate) CalBiochem 124005
LY294002  CalBiochem 19-142 Chenical PI3K inhibitor
C3 transferase  Cytoskeleton CTO3 Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1
Y-27632 dihydrochloride  Santa Cruz Biotechnology 129830-28-2
BODIPY FL-Phallacidin (green)  Molecular Probes B607 Fluorochrome for fibrillar actin staining
BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red)  Molecular Probes R415 Fluorochrome for fibrillar actin staining
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent  Molecular Probes R37114
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI  Molecular Probes P-36931

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Braun, S., et al. Cytokeratin-positive cells in the bone marrow and survival of patients with stage I, II, or III breast cancer. N Engl J Med. 342 (8), 525-533 (2000).
  2. Benoy, I. H., et al. Relative microvessel area of the primary tumour, and not lymph node status, predicts the presence of bone marrow micrometastases detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction in patients with clinically non-metastatic breast cancer. Breast Cancer Res. 7 (2), R210-R219 (1186).
  3. Wapnir, I. L., Barnard, N., Wartenberg, D., Greco, R. S. The inverse relationship between microvessel counts and tumor volume in breast cancer. Breast J. 7 (3), 184-188 (2001).
  4. Wyckoff, J. B., et al. A critical step in metastasis: in vivo analysis of intravasation at the primary tumor. Cancer Res. 60 (9), 2504-2511 (2000).
  5. Phadke, P. A., et al. Kinetics of metastatic breast cancer cell trafficking in bone. Clin Cancer Res. 12 (5), 1431-1440 (2006).
  6. Braun, S., et al. Lack of an effect of adjuvant chemotherapy on the elimination of single dormant tumor cells in bone marrow of high risk breast cancer patients. J Clin Onc. 18 (1), 80-86 (2000).
  7. Korah, R., Boots, M., Wieder, R. Integrin α5β1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer Res. 64 (13), 4514-4522 (2004).
  8. Najmi, S., Korah, R., Chandra, R., Abdellatif, M., Wieder, R. Flavopiridol blocks integrin-mediated survival in dormant breast cancer cells. Clin Cancer Res. 11 (5), 2038-2046 (2005).
  9. Braun, S., et al. A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer. N England J Med. 353 (8), 793-802 (2005).
  10. Dent, R., et al. Triple-negative breast cancer: clinical features and patterns of recurrence. Clin Cancer Res. 13 (15 Part 1), 4429-4434 (2007).
  11. Kim, R. S., et al. Dormancy signatures and metastasis in estrogen receptor positive and negative breast cancer. PLoS One. 7 (4), e35569 (2012).
  12. Hanin, L. Seeing the invisible: how mathematical models uncover tumor dormancy, reconstruct the natural history of cancer, and assess the effects of treatment. Adv in Exp Med & Biol. 734, 261-282 (2013).
  13. Wilkie, K. P. A review of mathematical models of cancer-immune interactions in the context of tumor dormancy. Adv in Exp Med & Biol. 734, 201-234 (2013).
  14. Barkan, D., Green, J. E. An in vitro system to study tumor dormancy and the switch to metastatic growth. J Vis Exp. (54), e2914 (2011).
  15. Barrios, J., Wieder, R. Dual FGF-2 and intergrin α5β1 signaling mediate GRAF-induced RhoA inactivation in a model of breast cancer dormancy. Cancer Microenvironment. 2 (1), 33-47 (2009).
  16. Ganapathy, V., et al. Luminal breast cancer metastasis is dependent on estrogen signaling. Clin & Exp Metastasis. 29 (5), 493-509 (2012).
  17. Barkan, D., et al. Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton. Cancer Res. 68 (15), 6241-6250 (2008).
  18. Ghajar, C. M., et al. The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nat Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).
  19. Marshall, J. C., et al. Effect of inhibition of the lysophosphatidic acid receptor 1 on metastasis and metastatic dormancy in breast cancer. J Nat Cancer Inst. 104 (17), 1306-1319 (2012).
  20. Almog, N. Genes and regulatory pathways involved in persistence of dormant micro-tumors. Adv in Exp Med & Biol. 734, 3-17 (2013).
  21. Wang, H., et al. Basic FGF causes growth arrest in MCF-7 human breast cancer cells while inducing both mitogenic and inhibitory G1 events. Cancer Res. 57 (9), 1750-1757 (1997).
  22. Fenig, E., et al. Role of transforming growth factor beta in the growth inhibition of human breast cancer cells by basic fibroblast growth factor. Breast Cancer Res Treat. 70 (1), 27-37 (2001).
  23. Fenig, E., et al. Basic fibroblast growth factor confers growth inhibition and Mitogen-activated Protein Kinase activation in human breast cancer cells. Clinical Cancer Research. 3 (1), 135-142 (1997).
  24. Coleman-Krnacik, S., Rosen, J. M. Differential temporal and spatial gene expression of fibroblast growth factor family members during mouse mammary gland development. Molecular Endocrinology. 8 (2), 218-229 (1994).
  25. Plath, A., et al. Expression and localization of members of the fibroblast growth factor family in the bovine mammary gland. J Dairy Science. 81 (10), 2604-2613 (1998).
  26. Lavandero, S., Chappuzeau, A., Sapag-Hagar, M., Oka, T. In vivo and in vitro evidence of basic fibroblast growth factor action in mouse mammary gland development. FEBS letters. 439 (3), 351-356 (1998).
  27. Sinowatz, F., Schams, D., Plath, A., Kolle, S. Expression and localization of growth factors during mammary gland development. Adv in Exp Med & Biol. 480, 19-27 (2000).
  28. Korah, R., Sysounthone, V., Scheff, E., Wieder, R. Intracellular FGF-2 promotes differentiation in T47-D breast cancer cells. Biochem Biophys Res Comm. 277 (1), 255-260 (2000).
  29. Korah, R., Das, K., Lindy, M. E., Hameed, M., Wieder, R. Co-ordinate loss of FGF-2 and laminin 5 expression during neoplastic progression of mammary duct epithelium. Human Pathology. 38 (1), 154-160 (2007).
  30. Wieder, R., et al. Overexpression of basic fibroblast growth factor in MCF-7 human breast cancer cells: lack of correlation between inhibition of cell growth and MAP kinase activation. J. Cellular Physiology. 177, 411-425 (1998).
  31. Brunner, G., Gabrilove, J., Rifkin, D. B., Wilson, E. L. Phospholipase C release of basic fibroblast growth factor from human bone marrow cultures as a biologically active complex with a phosphatidylinositol-anchored heparan sulfate proteoglycan. J Cell Biol. 114 (6), 1275-1283 (1991).
  32. Wilson, E. L., Rifkin, D. B., Kelly, F., Hannocks, M. J., Gabrilove, J. L. Basic fibroblast growth factor stimulates myelopoiesis in long-term human bone marrow cultures. Blood. 77 (5), 954-960 (1991).
  33. Gupta, P., McCarthy, J. B., Verfaillie, C. M. Stromal fibroblast heparan sulfate is required for cytokine-mediated ex vivo maintenance of human long-term culture-initiating cells. Blood. 87 (8), 3229-3236 (1996).
  34. Chatterjee, M., van Golen, K. L. Farnesyl transferase inhibitor treatment of breast cancer cells leads to altered RhoA and RhoC GTPase activity and induces a dormant phenotype. Int J Cancer. 129 (1), 61-69 (2011).
  35. Korah, R., Sysounthone, V., Golowa, Y., Wieder, R. Basic fibroblast growth factor confers a more differentiated phenotype in MDA-MB-231 human breast cancer cells. Cancer Res. 60 (3), 733-740 (2000).
  36. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  37. Tivari, S., Lu, H., Dasgupta, T., Wieder, R. Reactivation of dormant estrogen-dependent breast cancer micrometastases by bone marrow stromal injury in an in vitro model of dormancy. Proceedings of the 105th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research. , AACR. San Diego, CA. Philadelphia (PA). (2014).

Tags

Medicina Edição 100 dormência estroma da medula óssea o FGF-2 fibronectina câncer de mama ensaio Colony
Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Dormência Modelo de câncer de mama estrogênio-sensíveis na medula óssea: Uma Ferramenta para Estudos Moleculares Mecanismo e Hipótese Geração
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tivari, S., Korah, R., Lindy, M.,More

Tivari, S., Korah, R., Lindy, M., Wieder, R. An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation. J. Vis. Exp. (100), e52672, doi:10.3791/52672 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter