Abstract
Alkohol brug disorder (DKK) er en alvorlig sundhedsmæssig udfordring. På trods af en stor arvelig komponent til AUD har kun få gener blevet utvetydigt impliceret i deres ætiologi. Bananfluen, Drosophila melanogaster, er en kraftfuld model for at udforske molekylære-genetiske mekanismer bag alkoholrelaterede adfærd, og derfor lover godt for at identificere og forstå funktionen af gener, der har indflydelse AUD. Brugen af Drosophila model for disse typer af undersøgelser afhænger af tilgængeligheden af analyser, som pålideligt måler adfærdsmæssige reaktioner på ethanol. Denne rapport beskriver et assay egnet til vurdering af ethanol følsomhed og hurtig tolerance i fluer. Ethanol følsomhed måles i dette assay påvirkes af mængden og koncentrationen af ethanol anvendes en række tidligere rapporterede genetiske manipulationer, og også den tid, fluer er anbragt uden mad umiddelbart før testning. I modsætning hertil ethanol sensitivity målt i denne analyse er ikke påvirket af styrken i flyve håndtering, køn fluerne, og tilskud af vækstmedium med antibiotika eller levende gær. Tre forskellige metoder til kvantificering ethanol følsomhed er beskrevet, der alle fører til væsentlige skelnes ethanol følsomhed resultater. Den skalerbare karakter af denne analyse, kombineret med dens overordnede enkelhed at sætte op og relativt lave omkostninger, gør den velegnet til små og store genetisk analyse af ethanol følsomhed og hurtig tolerance i Drosophila.
Introduction
Alkohol brug disorder (DKK) er et enormt sundhedsproblem i hele verden (revideret i 1). Selvom de mekanismer, der styrer udviklingen af AUD er komplekse, disse lidelser har en stor genetisk komponent (f.eks 2). Den store arvelighed af AUD og de konserverede adfærdsmæssige reaktioner til ethanol på tværs af mange arter (gennemgået i 3,4) har genereret stor interesse i at anvende genetiske modelorganismer at undersøge inddragelse af specifikke gener i ethanol-relateret adfærd mod bedre forstå den molekylære basis for AUD. Bananfluen, Drosophila melanogaster, har vist sig som en førende model organisme for at udforske molekylære-genetiske mekanismer ethanol adfærd (revideret i 3,4). Undersøgelser i fluer har fremhævet roller i flere signalveje i adfærdsmæssige reaktioner på ethanol (revideret i 5). Interessant nok nogle af generne og veje, der påvirker adfærdsmæssige responses til ethanol i fluer har også været impliceret i gnavere ethanol-relateret adfærd og / eller human AUD (fx 6-14). Bevarelsen af mekanismer kørsel ethanol-relaterede adfærd på tværs af arter, kombineret med den suite af genetiske værktøjer til rådighed i Drosophila modelsystemet, understreger nytten af bananfluen model til undersøgelse genetik adfærdsmæssige reaktioner på ethanol.
Følsomhed 15,16 og tolerance (revideret i 17) til ethanol i mennesker er knyttet til udviklingen af AUD. Begge disse adfærdsmæssige reaktioner på ethanol kan modelleres i fluer via en række forskellige laboratorieanalyser (revideret i 3,4). Alle de flyve assays er kendt af forfatterne er baseret på enten tidsafhængig ethanol-induceret sedation / manglende koordination eller tidsafhængig genrejsning ethanol sedation.
I en tidligere artikel fra vores gruppe på genetik ethanol følsomhed og rAPID tolerance i Drosophila blev en adfærdsmæssig assay baseret på ethanol damp-induceret sedation af fluer brugt 18. Afprøvning i dette assay blev initieret ved at overføre levende voksne fluer uden bedøvelse tømme fødevarer hætteglas, opfange de fluer i hætteglas med en celluloseacetat stik, tilsætning af ethanol til toppen (dvs. ikke-flyve side) af celluloseacetat stikket, og forsegling af hætteglasset med fluer, celluloseacetat stik og ethanol med en silicone prop (se skematisk i fig S3, reference 18). Flere hætteglas repræsenterer forskellige grupper af fluer blev vurderet i parallel, øge throughput af dette assay. Hætteglas fik en anonym kode og eksperimentatorer blev blindet til behandlingsgruppen for at forhindre utilsigtet skævhed i vurderingen af sedation. I et standard eksperiment, fluer i hætteglas blev tappet forsigtigt ved 6 minutters intervaller, og efter en 30 sek opsving blev antallet af sederede fluer i hvert hætteglas talt og converted til procent aktive fluer. Fluer absorberede ethanol damp fra celluloseacetat plug i en tidsafhængig måde, hvilket progressive stigninger i internt ethanol 18 og sedation (jf henvisning 18 og figur 1A og 1B i denne rapport). Sedation i dette assay blev operationelt defineret som fluer (I) stående i fravær af walking eller (ii), der ligger på ryggen, med eller uden flagrende deres vinger. Her er denne ethanol sedation assay beskrevet i detaljer, er yderligere driftsoptimering relevante for at bruge det forudsat, og analysen bruges til at behandle bidrag af fødevarer tilskud optioner på flue sedation følsomhed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dag Før Assay
- Saml fluer i friske fødevarer hætteglas i grupper på 11 (enkelt køn) under kortvarig (1-5 min) CO 2.
- Tillad fluer at inddrive O / N i fødevarer hætteglas på en miljømæssigt kontrolleret rum (typisk 25 ° C, 60% relativ fugtighed, 12 timers lys / mørke cyklus).
- Forbered ethanolopløsning (s) ved at fortynde rent (100%) ethanol i oprenset (≥18 MOhm) vand til en slutkoncentration (s) passende for den planlagte eksperiment. Opløsningen (s) at vende tilbage til RT O / N.
Bemærk: Fortynding af ethanol er exoterm.
2. Dag af Assay
- For hvert hætteglas af fluer, der skal testes, fremstilles (i) en ren, tom hætteglas fødevarer; dvs., prøvning hætteglas, (ii) en ny celluloseacetat stik, (iii) en silicone prop og (iv) 1 ml ethanol opløsning (se tabel 3).
- Test værelse Forbered ved at justere temperaturen til 20-25 ° C og en relativ luftfugtighed på 55-65%.
- Har en anden arbejdstagertildele en unik kode til hver gruppe af hætteglas og registrere koden til senere. Placer kodede hætteglas med fluer i test værelse akklimatisere i et par min.
- Label tomme test hætteglas til at matche koder på flyve hætteglas fra 2.3.
- Konstruer en papirkopi test log ved at indtaste koderne i kolonne (en kolonne / hætteglas) i et regneark svarende til tabel 1.
- Brug af test log som en guide, arrangere kodede fødevarer hætteglas med fluer og tomme test hætteglas i matchende arrays i test værelse.
Bemærk: En rimelig maksimalt antal hætteglas til test er 24 (dvs. 6 sæt 4 hætteglas hver). - Transfer flyver fra fødevarer hætteglas i matchede / mærkede tom test hætteglas og straks indsætte celluloseacetat stik i test hætteglas indtil celluloseacetat stik er 2 cm under hætteglassets toppe.
- Herefter håndtere hver række af fire hætteglas som et sæt på forskudte 1 min intervaller.
- For tiden 0 vurdering, forstå hvert hætteglas individuelt wi'te tommelfinger og pegefinger, skal du trykke let på bordet tre gange for at banke fluer til bunden af hætteglasset, vent 30 sek og derefter tælle antallet af fluer, der er immobile / døde. Registrere antallet af immobile / døde fluer til hvert hætteglas på tidspunktet 0 min i hardcopy test log.
- Start timer tælle op kontinuerligt ved tid 0 og straks begynde at tilføje 1 ml ethanol til celluloseacetat propper i hætteglassene for den første række / sæt med 4 hætteglas. Der tilsættes 1 ml ethanol til celluloseacetat propper i hætteglas ved 5 sek intervaller i den rækkefølge, de vil blive testet. Tilføj ethanol til celluloseacetat stik i en cirkulær bevægelse, således at ethanolen optages jævnt celluloseacetat stikpropper. Når ethanol er blevet tilføjet til alle 4 test hætteglas i sættet, indsætte en silicone prop i hvert hætteglas for at forsegle den.
- Til tider 1, 2, 3, 4 og 5 min, tilsættes 1 ml ethanol til den anden, tredje, fjerde, femte og sjette sæt af 4 hætteglas hhv. Fortsæt indsætte silikone propper eftertilsætning af ethanol til hvert sæt af 4 hætteglas.
- Til tiden 6 min, teste det første sæt af 4 hætteglas ved at tage fat hvert hætteglas med tommel- og pegefinger, trykke forsigtigt på bordet tre gange for at banke fluer til bunden af hætteglasset, venter 30 sek og derefter tælle og registrere det samlede antal fluer, der sederes. Score flyver som bedøvet, hvis de (i) stå på gulvet i hætteglasset, men ikke gå eller (ii) ligger på ryggen med eller uden basker med vingerne.
- Håndtag hvert hætteglas i sættet med 5 sek intervaller ved hjælp af tidsplanen i tabel 2.
- Til tider 7, 8, 9, 10 og 11 min, teste den anden, tredje, fjerde, femte og sjette sæt hætteglas henholdsvis som på det første sæt.
- Til tiden 12 min, teste det første sæt af 4 hætteglas igen som beskrevet i 2.12 og fortsætte med at teste den anden, tredje, fjerde, femte og sjette sæt hætteglas på 13, 14, 15, 16 og 17 min.
- Fortsætte med at teste fluer som beskrevet i 2.12 indtil alle fluer er sedated.
- Indtast det samlede antal fluer i hvert hætteglas i papirudgave test log. Censor immobile / døde fluer på tidspunktet 0 fra det samlede antal fluer.
- Beregn procent aktive fluer på hvert Sagsbehandlingstiden-point og plot data som% aktive fluer (y-akse) vs. tid (x-aksen). Kvantificere ethanol sedation ved at interpolere Sedation Time 50 værdier (ST50, tid til 50% sedation) fra tredje ordens polynomium eller sigmoidal kurve passer eller beregne arealet under kurven.
- Indsamle data fra dekodede hætteglas og udføre statistiske analyser (f.eks envejs ANOVA med Bonferroni multipel sammenligning test) i givet fald for den eksperimentelle design.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De rå data fra dette ethanol sedation assay er antallet af fluer, der er sederet som en funktion af ethanoldamp eksponeringstid. Rådata omdannes til procent aktive fluer som en funktion af tid (primære data, Figur 1A, B, D - F). Følsomhed over for ethanol sedation fra de primære data kan kvantificeres som Sedation Time 50 (ST50), den tid, der kræves til 50% af insekterne bliver Sedated eller AEA under kurven (AUC), via interpolation fra kurvetilpasning. Tidligere rapporterede 18 tredje ordens polynomium kurver passer de primære data godt som forventet (gennemsnitligt R2 = 0,934, n = 24, figur 1A), selv sigmoidale kurver passer de primære data noget bedre (gennemsnitlig R2 = 0,997, n = 24; Figur 1B). Som et alternativ til bestemmelse af ST50 værdier fra kurvetilpasning kan ethanol sedation følsomhed fra de primære data også kvantificeret som områdeunder kurven (AUC,% aktive fluer x tid) (figur 1C). Resultaterne fra disse tre metoder til kvantificering korrelerer særdeles godt med hinanden (Pearson R2 ≥0.998, n = 24) og er i det væsentlige ikke kan skelnes (figur 1C), selvom enhederne er nødvendigvis forskellige for ST50 (min) og AUC (% aktiv fluer x tid). Nærmere oplysninger om alle beregninger, regneark anvendes mv er tilgængelige fra den tilsvarende forfatter. Bemærk, at højere og lavere værdier af ST50 (eller AUC) angiver afstumpet og øget følsomhed over for ethanol sedation hhv. Til overensstemmelsen med den foregående rapport 18 blev ST50 værdier afledt af tredje ordens polynomium kurve passer anvendt i resten af denne study.Importantly, analysen registrerer effekten af RNAi mod Cnx14D (figur 1D) og mutationer i SCB (figur 1E) , Aru og hppy (figur 1F)
Under rutinemæssig brug af dette assay, aflytning af hætteglas med celluloseacetat stik befugtet med 2 ml ethanol forårsagede celluloseacetat plugs at rejse mod bunden af nogle hætteglas i et par individuelle eksperimenter (ikke vist), hvorved de potentielt ændre fluer 'fri plads og koncentrationen af ethanol damp. Derudover ca. 0,25 ml ethanol nået bunden (dvs. flyve side) af celluloseacetat stik, når de blev befugtet med 2 ml ethanol (figur 2A), hvilket øger muligheden for, der flyver i disse assays blev udsat for ethanol væske ud at ethanoldamp. Faldende volumen ethanol i celluloseacetat stikket fra 2 ml til 1 ml elimineret de nedadgående migration af cellulosE-acetat propper under assayet, selv efter kraftig aflytning (ikke vist) og også elimineret målbare mængder ethanol opløsning på bunden af celluloseacetat stik (figur 2A). Sedation af fluer var følsom over for mængden af ethanol anvendes selv med rumfang under 1 ml (figur 1A - C). Ved anvendelse af 1 ml ethanol derfor bidrager til at opretholde et konstant åbent rum for fluer under assayet og sikrer, at flydende ethanol ikke bliver indtaget. Fluer derfor formentlig udelukkende er eksponeret til ethanol som en damp i dette assay. En ml 85% ethanol (dvs. damp fra 1 ml 85% (vol / vol) ethanol) blev og 1-5 dag gamle w [A] fluer anvendes i alle efterfølgende undersøgelser rapporteret her, medmindre andet er angivet.
I forsøg med 24 hætteglas er fluer bankes forsigtigt ved 6 minutters intervaller for at tillade forsøgslederen for at vurdere (dvs. cykle gennem) alle hætteglas på rimelige, ordineret schedule. ST50s fra studier med kontrol fluer med færre hætteglas og 5 min intervaller var sammenlignelige med ST50s fra studier med 6 minutters intervaller (data ikke vist). Fluer vurderes for sedation 30 sek efter at trykke for at tillade forsøgslederen tid til at trykke på et sæt af fire hætteglas i rækkefølge før bestemmelse af sedation status fluer i hvert hætteglas. At afgøre, om blev målt forskelle i tappe energi eller nyttiggørelse tid efter aflytning virkning ethanol sedation følsomhed, ST50 værdier i mandlige og kvindelige kontrol fluer mens bliver aflyttet normalt (Regular) eller meget kraftigt (Hard), og efter en standard 30 sek eller længere 60 sek opsving. Tapping vigør (figur 2B) og restitutionstid (figur 2C) havde ingen målbar effekt på ST50 værdier i kontrol hanner eller hunner.
Antibiotika kan anvendes til at undertrykke bakterievækst i flue fødevarer medium. At afgøre, om tilskud af fødevarer medium med antibiotika påvirker ethanol sedation følsomhed,ST50-værdier blev målt i fluer, der opdrættes til en generation i nærvær eller fravær af tre antibiotika (ampicillin, 100 ug / ml; tetracyclin, 20 ug / ml; chloramphenicol, 125 ug / ml). Opdrættet fluer på disse tre antibiotika havde ingen effekt på ethanol sedation følsomhed (figur 2D).
Fluer overføres til tomme fødevarer hætteglas-og derfor fratages føde og vand for ~ 5 min-umiddelbart forud for at blive udsat for ethanol damp i sedation assay. For at bestemme om mængden af tid fluer holdes i tomme fødevarer hætteglas før initiering af assayet virkninger ethanol sedation følsomhed blev fluer sultet i 6 timer (mindst 70-fold af normal) og derefter ST50 blev målt. Sult i 6 timer faldt betydeligt ST50s i både mandlige og kvindelige kontrol fluer (Figur 2E). Selv om effekten af sult på ST50 var relativt lille (9-14% i disse eksperimenter), mængden af tid flyver spend i tomme hætteglas før at blive udsat for ethanol damp i analysen bør holdes ensartet på tværs af grupper i et forsøg, og også mellem forsøgene.
Laboratorium flyve mad kan suppleres med levende gær (f.eks 18,20,23,24) for at fremme produktionen af afkom. For eksempel fødevarer hætteglas suppleret med levende gær (Saccharomyces cerevisiae), der produceres voksne tidligere end de med varmedræbt gær eller ingen levende gær (sammenlign d10-d11, hvide søjler, figur 3A), selv om det samlede antal afkom produceres 20 dage kunne skelnes i hætteglas suppleret med levende og varmedræbt gær (figur 3A). For at løse den mulighed, at levende gær producere meningsfulde mængder af ethanol på fly mad, blev virkningerne af levende gær (I) ethanol i fødevarer medium, (ii) ethanol i fluer, og (iii) ethanol sedation følsomhed i fluer målt. Mad medium suppleret med levende gær indeholdt subsentlige mængder af ethanol i forhold til fødevarer suppleret med varmedræbt eller ingen gær (figur 3B). Ikke desto mindre kontrol fluer dyrket på medium suppleret med levende, dræbt eller ingen gær havde uden nærmere lave koncentrationer af internt ethanol (figur 3C). Desuden ethanol sedation følsomhed var ikke skelnes i kontrol fluer, der dyrkes på medium suppleret med varme-dræbt eller levende gær (figur 3D).
Figur 1. (AC) Sedation assay dataanalyse muligheder. Kontrol w [A] hunner (w 1118 isogene, Bloomington Indiana Drosophila Stock center stock # 5905) blev udsat for damp fra de angivne mængder af 85% (vol / vol) ethanol. (A) Sedation tidsforløb data passer med tredje- ordens polynomier. (B)Sedation tid-kursus data passer med sigmoidale kurver. (C) Ethanol sedation følsomhed kvantificeret som (venstre Y-akse) ST50 værdier interpoleret fra tredje-ordens polynomier og sigmoidale kurver eller (højre Y-akse) område under kurven (AUC,% aktive fluer x tid). Ethanol volumen, men ikke analysemetode påvirket ethanol følsomhed (to-vejs ANOVA; virkning af volumen, p <0,0001; virkning analysemetode, NS; n = 8 / gruppe; AUC data transformerede 1/100 at tage højde for forskellen i størrelsen af værdierne). (DF) Repræsentant tid-kursus data fra. (D) Ekspression af Cnx14D RNAi i nervesystemet (elav-Gal4 / v5597) stumpe ethanol følsomhed i forhold til kontrol (v5597 / + og elav-Gal4 / + ). (E og F) Mutation af s cb (SCB Vol2) og Aru (Aru 8,128) forbedret ethanol sedation følsomhed og mutation af hppy (hppyKG5537) afrundede ethanol sedation følsomhed sammenlignet med kontroller. Data i EF blev tidligere rapporteret som ST50 værdier 18.
Figur 2. Vurdering af operationelle parametre i sedation analysen. (A) mængde ethanol i de nederste 2 mm af celluloseacetat stik. Mængden af ethanol tilsættes til toppen af celluloseacetat stik haft en betydelig indvirkning på den mængde ethanol, der flyttede ind i de nederste 2 mm af celluloseacetat stik under en mock 60 min eksperiment (envejs ANOVA, p <0,0001; * Bonferroni multiple sammenligningstest, 2 ml vs 0 og 1 ml, p <0,05 n = 4). Ethanol blev kvantificeret som en ændring i masse af cellulose acetat stik. (B) Hverken vigør for at trykke hætteglassene under test (Regular, Hard) eller køn fluer testet berørte ST50s (to-way ANOVA; effekt af aflytning, ns; effekt af køn, ns; n = 12) (C) Hverken inddrivelse tid efter aflytning eller køn havde væsentlig indvirkning på ST50s (tovejs ANOVA;. effekt af restitutionstid, ns; effekt af køn, ns. n = 6) (D) Optagelse af antibiotika (ATC, ampicillin, tetracyklin og chloramphenicol) i vækstmediet havde nogen samlet effekt på ST50s, men der var en effekt af køn på ST50 (to-vejs ANOVA; effekt af ATC, ns; effekt af køn, p = 0,001; interaktion , ns. n = 6) (E) Effekt af sult på ethanol sedation følsomhed. ST50s var signifikant lavere hos fluer berøvet mad og vand i 6 timer (Starved) sammenlignet med normalt fodret (Fed) fluer; ST50s hos mænd og kvinder var skelnes overordnet (to-vejs ANOVA; effekt af sult, p <0,0001, effekt af køn, ns; n = 12; * Bonferroni flere sammenlignende test, effekt af sult hos mænd og kvinder, p <0,05) .
Figur 3. Virkning af levende gær på vækst, ethanol indhold og sedation følsomhed. (A) Voksen afkom fra hætteglas indeholdende fødevarer medium suppleret med ingen gær (nr Y), varmedræbt gær (dræbt Y) eller levende gær (Live Y). Hvide barer, voksen afkom opstå under dage 10-11; grå søjler, dage 12-20. Samlet set gær behandling havde en signifikant effekt på afkom produktion (envejs ANOVA, alle (10-20) dage, p <0,0001, dage 10-11, p <0,0001, dage 12-20, p = 0,0002, n = 5 ). Samlet antal afkom produceret under alle (10-20) dage var større fra hætteglas med dræbt Y og Live Y end Nej Y (Bonferroni multipel sammenligning test, p <0,05). Under dage 10-11, hætteglas med Live Y produceret mere afkom end Killed Y og hætteglas med dræbt Y produceret mere afkom end Nej Y (hvide søjler, Bonferroni flere sammenligning tests, p <0,05). Under dage 12-20, hætteglas with Killed Y produceret mere afkom end hætteglas med nr Y eller Levende Y (grå bjælker, Bonferroni multiple sammenligningstest, p <0,05). (B) ethanol i fødevarer medium var signifikant højere i hætteglas suppleret med live Y i forhold til hætteglas med nr Y og dræbt Y (envejs ANOVA, p <0,0001, n = 5; Bonferroni multiple sammenligning test, p <0,05) (C) Intern ethanol i w [A] kvindelige fluer blev ikke signifikant påvirket af tilskud af gær (en. way ANOVA, NS, n = 5-10). Ethanol indhold i B og C bestemmes som beskrevet 18 (D) ST50 værdier blev ikke signifikant påvirket af tilskud af vækstmediet med gær i mænd eller kvinder w [A] (to-vejs ANOVA;. Effekt af gær, ns; effekt køn, NS; n = 12).
| hætteglas → | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| kode → | ||||||||
| total # → | ||||||||
| 0 min | ||||||||
| 6 min | ||||||||
| 12 min | ||||||||
| 18 min | ||||||||
| 24 min | ||||||||
| 30 min | ||||||||
| 36 min | ||||||||
| 42 min | ||||||||
| 48 min | ||||||||
| 54 min | ||||||||
| 60 min |
Tabel 1: Typisk test log. Se protokol trin 2.5.
| Vial | Tap | Vurdere |
| 1 | 6 min 0 sec | 6 min 30 sec |
| 2 | 6 min 5 sec | 6 min 35 sec |
| 3 | 6 min 10 sek | 6 min 40 sec |
| 4 | 6 min 15 sek | 6 min 45 sec |
Tabel 2: Se protokol trin 2.13 Typisk aflytning og afprøvning tidsplan..
| Navn på Material / Udstyr | Firma | Catalog Number | Kommentarer / Beskrivelse |
| fødevarer hætteglas | VWR | 89092-772 | smal |
| Flugs | Genesee / flystuff.com | 49-102 | smal |
| silikone prop | Fisher Scientific | 09-704-1l | # 4 |
| ethanol | Farmakoterapeutisk Aaper | 111000200 | 200 proof |
Tabel 3: Materialer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Enkle assays, reproducerbart mængdebestemme meningsfulde fænotyper er af stor værdi til analyse af adfærd. Den her beskrevne arbejde omhandler adskillige praktiske aspekter af et assay til måling af ethanol sedation følsomhed og hurtig tolerance i Drosophila. Selvom det ikke er fokus i dette arbejde, er adfærdsmæssige analyser lettes ved at bevare miljøet og genetiske baggrund konstant for testpersoner en studiegruppe. Endvidere bør sammenligninger typisk mellem grupper af fluer opdrættet og testet side-by-side. Med henblik herpå alle fluer inden for de enkelte eksperimenter i dette arbejde havde samme genetiske baggrund og blev opdrættet side om side under ensartede miljøforhold (25 ° C, 60% relativ fugtighed, 12 timers lys / mørke cyklus) med standard mad medium (10 % saccharose, 3,3% majsmel, 2% gær og 1% agar), bortset fra de eksperimenter, hvor fødevaren mediet blev udtrykkeligt manipuleret.
ETHanol sedation assay beskrevet her kræver meget få materialer (plast hætteglas, celluloseacetat stik, silikone propper og ethanol), som alle er billige og let tilgængelige fra kommercielle kilder (tabel 3). Denne ethanol sedation assay ligner og i vid udstrækning baseret på tidligere rapporterede metoder (fx 6,20,25-27, omfattende revideret i 3,28). Selv om alle disse assays har anvendelighed til måling ethanol sedation følsomhed, fordele ved assayet beskrevet her omfatter (i) fluer ikke udsættes for flydende ethanol under assayet, (ii) den reducerede muligheden for, at fluer kan blive viklet ind i bomuld eller andet materiale i afprøvningen hætteglasset under analysen, (iii) mulighed for at teste mange grupper af fluer parallelt, og (iv) tre muligheder for målet kvantificering af ethanol følsomhed fra primære datasæt. Tilsammen disse fordele stort set eliminere muligheden for, at fluer drikke ethanol, that ethanol kunne befugte udvendige overflader af fluer derved hæmmer deres samlede bevægeapparatet evner, og at udførelsen af fluer i analysen kunne blive beskæmmet af vanskeligheder forbundet med indfiltringsnet materiale i testmiljø. Derudover disse fordele øge den samlede gennemløb og reproducerbarhed af assayet. Desuden er ethanol følsomhed måles i dette assay ikke påvirkes af ekspression af endogene hvid eller transgene markør mini-white 18, hvilket gør den velegnet til undersøgelser med transgener og genetiske baggrunde, der almindeligvis anvendes i Drosophila genetiske analyser.
Flere vigtige parametre bør kontrolleres for at opnå pålidelige resultater fra ethanol sedation assays. Udover at kontrollere væksten miljø og genetiske baggrund af stammer testes (se ovenfor), mængden og koncentrationen af ethanol er naturligvis yderst vigtig til kvantificering af ethanol sensitivity. Bemærk, at fortyndingen af ethanol i vand er exoterm. Derfor bør fortyndede ethanolopløsninger få lov at komme i ligevægt til RT forud for indledningen af sedation assays. En yderligere parameter, der bør gøres ensartet på tværs af grupperne, der testes, er den tid, at fluer er opstaldet i tomme fødevarer hætteglas før du starter sedation analysen. To yderligere parametre bør også kontrolleres. Antallet af fluer pr hætteglas bør ideelt set være (a) den samme i alle hætteglas og grupper, (b)
et antal, der let kan tælles hurtigt, og (c) et antal stort nok til at tillade relativt glatte sedation tidspunkter kurser. Eleven fluer / hætteglas fungerer godt i vores laboratorium og er en foreslået udgangspunkt. En sidste parameter til at overveje, er en alder af fluerne, der anvendes i sedation assays. Selv om der ikke reproducerbare virkninger af alder på ethanol sedation følsomhed i 1-10 dage gamle fluer er fundet (data ikke vist), synes brugen af unge alderskategori dyrberettiget i betragtning af den store litteratur om aldersrelaterede adfærdsændringer i fluer 29,30.
Andre parametre synes ikke så kritisk i sedation assays, i hvert fald når der testes kontrol fluer ved hjælp af områderne for de parametre, der beskrives her. Sex, styrke aflytning, restitutionstid fra aflytning, og tilskud af flyve mad med antibiotika (ampicillin, tetracyklin og chloramphenicol) eller levende gær ændrer ikke ethanol følsomhed målt som beskrevet her. Tilsvarende kvantificering ethanol følsomhed ved interpolation fra tredje ordens polynomium kurver, interpolation fra sigmoidale kurver, eller bestemmelse af AUC fra den primære sedation tidsforløbet data medfører væsentlige skelnes fortolkninger. Selv om ingen virkning sex konsekvent blev observeret i studierne beskrevet her, har virkninger sex ethanol følsomhed i flere Drosophila genetiske baggrunde blevet rapporteret 31. Således er det muligt, at sex virkninger varblot maskeret af genetisk varians i w [A] baggrund her. Alternativt er det muligt, at måling sex virkninger på adfærdsmæssige reaktioner i Drosophila kræver endnu uidentificerede assay eller vækstbetingelser. Under alle omstændigheder anbefales det at gøre alle parametre så ensartet som muligt i sedation assays, herunder køn af nogen grupper bliver eksplicit sammenlignes.
Eftersom levende gær producere betydelige mængder af ethanol i flue fødevarer, det var noget overraskende, at tilskud af mad med levende gær ikke øge den interne ethanol i fluer. En mulig forklaring er, at ethanol ikke produceres ensartet over overfladen af fødevarer og fluer kan derfor selektivt indtage fødevarer med ingen eller relativt lave koncentrationer af ethanol. Yderligere undersøgelser vil være forpligtet til at behandle dette og andre mulige forklaringer på dette fund.
Et stort antal ændringer af analysen described her er muligt, afhængigt af målene i forsøget udføres. For eksempel er antallet af hætteglas testet i et eksperiment, antallet af testede i hvert hætteglas fluer, koncentrationen og mængden af ethanol anvendes, varigheden af ethanol eksponering tidsintervallet mellem sedation vurderinger, alder og køn af fluer testet , og kriterierne for sedation kan alle tilpasses til de behov, en individuel laboratorium. Anbefalingen er at starte med en eller to grupper af fire hætteglas ved første lære analysen og derefter skalere op til at bruge det antal hætteglas, der giver den gennemløb nødvendige for projektet. Skal uventet korte eller lange ST50s overholdes, vil det være god praksis at sikre, at test-fluer blev udsat for kort (1-5 min) anæstesi gange, fik lov til at komme sig efter anæstesi O / N, mindre end 10 dage gamle, var ikke fysisk beskadiget under håndtering, ikke blev fugtet med ethanol-opløsning, og havde ikke lokomotoriske nedskrivninger.
Kun og derfor assayet foranstaltninger ethanol sedation følsomhed er ikke udviklet eller velegnet til at vurdere andre adfærdsmæssige reaktioner på ethanol. Som alle kendte ethanol adfærdsmæssige paradigmer i fluer, denne analyse kræver fluer at have stort set normale bevægeapparatet evner og derfor genotyper med nedsat bevægelsesevne bør ikke testes. En anden begrænsning af analysen er, at koncentrationen af ethanol damp i hætteglasset formentlig stiger kontinuerligt som flygtiggøres lægemiddel fra celluloseacetat stik. Selv fluerne interne ethanol stiger gradvist med tiden i alle flyve ethanol adfærdsmæssige analyser, synes muligt, at levere en fast koncentration af ethanol damp til fluer kunne forbedre sammenhængen i resultaterne fra denne analyse. En fremgangsmåde til levering af en fast koncentration af ethanol damp er endnu ikke blevet identificeret, der ville tillade assayet, der skal anvendes på skalaen beskrevet her.
Ethanolen sedationassay beskrevet her er velegnet til genetisk analyse af ethanol følsomhed og hurtig tolerance 18. Vækstmiljø, genetisk baggrund, koncentrationen og mængden af ethanol, mængden af tid, fluer tilbringer i tomme fødevarer hætteglas, og antallet og alder af fluer, der anvendes, bør alle kontrolleres. Under antagelse af disse parametre er tilstrækkeligt kontrolleret, skal sedation analysen være egnet til både vende og sende genetiske tilgange, der undersøger den molekylære basis for adfærdsmæssige reaktioner til ethanol i Drosophila.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| food vials | VWR | 89092-772 | narrow |
| Flugs | Genesee/flystuff.com | 49-102 | narrow |
| silicone stopper | Fisher Scientific | 09-704-1l | #4 |
| ethanol | Pharmaco-Aaper | 111000200 | 200 proof |
References
- Rehm, J., et al. Global burden of disease and injury and economic cost attributable to alcohol use and alcohol-use disorders. Lancet. 373, 2223-2233 (2009).
- Prescott, C. A., Kendler, K. S. Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins. The American journal of psychiatry. 156, 34-40 (1999).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annual review of neuroscience. 36, 121-138 (2013).
- Scholz, H., Mustard, J. A. Invertebrate Models of Alcoholism. Current topics in behavioral neurosciences. 13, 433-457 (2011).
- Rodan, A. R., Rothenfluh, A. Functional Plasticity and Genetic Variation: Insights into the Neurobiology of Alcoholism. Reilly, M. T., Lovinger, D. M. 91, Elsevier. (2010).
- Schumann, G., et al. Genome-wide association and genetic functional studies identify autism susceptibility candidate 2 gene (AUTS2) in the regulation of alcohol consumption. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7119-7124 (2011).
- Corl, A. B., et al. Happyhour, a Ste20 family kinase, implicates EGFR signaling in ethanol-induced behaviors. Cell. 137, 949-960 (2009).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
- Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development. Nature. 436, 845-847 (2005).
- Riley, B. P., et al. Alcohol dependence is associated with the ZNF699 gene, a human locus related to Drosophila hangover, in the Irish affected sib pair study of alcohol dependence (IASPSAD) sample. Molecular psychiatry. 11, 1025-1031 (2006).
- Morozova, T. V., et al. Alcohol sensitivity in Drosophila: translational potential of systems genetics. Genetics. 183, 733-745 (2009).
- Ogueta, M., Cibik, O., Eltrop, R., Schneider, A., Scholz, H. The influence of Adh function on ethanol preference and tolerance in adult Drosophila melanogaster. Chemical senses. 35, 813-822 (2010).
- Han, S., et al. Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence. American journal of human genetics. 93, 1027-1034 (2013).
- Lind, P. A., et al. A genomewide association study of nicotine and alcohol dependence in Australian and Dutch populations. Twin Res Hum Genet. 13, 10-29 (2010).
- Schuckit, M. A. Low level of response to alcohol as a predictor of future alcoholism. The American journal of psychiatry. 151, 184-189 (1994).
- Schuckit, M. A., Smith, T. L. An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects. Archives of general psychiatry. 53, 202-210 (1996).
- Tabakoff, B., Cornell, N., Hoffman, P. L. Alcohol tolerance. Ann Emerg Med. 15, 1005-1012 (1986).
- Chan, R. F., et al. Contrasting Influences of Drosophila white/mini-white on Ethanol Sensitivity in Two Different Behavioral Assays. Alcohol Clin Exp Res. 38, 1582-1593 (2014).
- Eddison, M., et al. arouser reveals a role for synapse number in the regulation of ethanol sensitivity. Neuron. 70, 979-990 (2011).
- Wen, T., Parrish, C. A., Xu, D., Wu, Q., Shen, P. Drosophila neuropeptide F and its receptor, NPFR1, define a signaling pathway that acutely modulates alcohol sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2141-2146 (2005).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcohol Clin Exp Res. 33, 1794-1805 (2009).
- Bhandari, P., et al. Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors in Drosophila, Caenorhabditis elegans and mice. Genes, brain, and behavior. 11, 387-397 (2012).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
- Chen, J., Wang, Y., Zhang, Y., Shen, P. Mutations in Bacchus reveal a tyramine-dependent nuclear regulator for acute ethanol sensitivity in Drosophila. Neuropharmacology. 67, 25-31 (2013).
- Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
- Maples, T., Rothenfluh, A. A simple way to measure ethanol sensitivity in flies. J Vis Exp. , e2541 (2011).
- Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, 199-211 (2006).
- Nohronha, A. Ch. 23. Neurobiology of Alcohol Dependence. 23, Elsevier. 467-495 (2014).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental gerontology. 46, 320-325 (2010).
- Martin, I., Grotewiel, M. S. Oxidative damage and age-related functional declines. Mechanisms of ageing and development. 127, 411-413 (2006).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Acute ethanol responses in Drosophila are sexually dimorphic. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 21087-21092 (2012).
