Abstract
Alkoholkonsum Störung (EUR) ist ein ernstes Gesundheitsproblem. Trotz einer großen erbliche Komponente auf AUD, wenige Gene wurden eindeutig in ihrer Ätiologie in Verbindung gebracht. Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster, ist ein leistungsfähiges Modell für die Erforschung molekulargenetischen Mechanismen, die alkoholbedingte Verhaltensweisen und hält daher ein großes Versprechen für die Identifizierung und das Verständnis der Funktion von Genen, die AUD beeinflussen. Die Verwendung der Drosophila-Modell für diese Art von Untersuchungen hängt von der Verfügbarkeit von Assays, die zuverlässig Verhaltensreaktionen auf Ethanol zu messen. Dieser Bericht beschreibt eine für die Beurteilung Ethanol Empfindlichkeit und schnelle Toleranz in Fliegen-Assay. Ethanol Empfindlichkeit in diesem Test gemessen wird durch das Volumen und die Konzentration von Ethanol verwendet wird, eine Vielzahl von zuvor berichtet, genetische Manipulationen, und auch die Länge der Zeit beeinflusst die Fliegen ohne Nahrung unmittelbar vor der Prüfung untergebracht. Demgegenüber Ethanol sensitivity in diesem Test gemessen wird, nicht von der Kraft der Fliegen Handhabung, des Geschlechts der Fliegen, und Ergänzung des Wachstumsmediums mit Antibiotika oder lebende Hefe beeinflußt. Drei verschiedene Methoden zur Quantifizierung von Ethanol Empfindlichkeit beschrieben, die alle zu wesentlichen nicht unterscheidbar Ethanolsensitivität Ergebnisse. Durch die Skalierbarkeit dieses Tests, kombiniert mit seiner Gesamt Einfachheit zu Set-up und relativ niedrige Kosten, machen es für kleine und große genetische Analyse von Ethanolsensitivität und schnelle Toleranz in Drosophila geeignet.
Introduction
Alkoholkonsum Störung (EUR) ist ein enormes Gesundheitsproblem weltweit (in 1 überprüft). Obwohl die Mechanismen, die der Entwicklung von AUD komplex sind, sind diese Erkrankungen einen wichtigen genetischen Komponente (zB 2). Die große Erblichkeit der AUD und der konservierten Verhaltensreaktionen auf auf viele Arten (in 3,4 prüft) haben starkes Interesse an der Verwendung von genetischen Modellorganismen, um die Beteiligung bestimmter Gene in Ethanol bezogene Verhaltensweisen gegenüber ein besseres Verständnis der molekularen Grundlagen der Untersuchung erzeugten Ethanol AUD. Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster, hat als einer der führenden Modellorganismus für die Erforschung molekulargenetischen Mechanismen der Ethanol-Verhalten (in 3,4 prüft) entstanden. Studium der Fliegen haben Rollen für mehrere Signalwege in Verhaltensreaktionen auf Ethanol (in 5 mit Beiträgen) hervorgehoben. Interessanterweise, die Verhaltens respons beeinflussen einige der Gene und Signalwegees zu Ethanol in Fliegen auch in Nagetier Ethanolrelevante Verhaltensweisen und / oder menschlichen AUD (zB 6-14) in Verbindung gebracht. Die Erhaltung der Mechanismen, die Ethanolrelevante Verhaltensweisen zwischen den Arten, zusammen mit der Suite von genetischer Werkzeuge zur Verfügung, in der Drosophila-Modellsystem, unterstreichen den Nutzen der Fruchtfliege Modell zur Untersuchung der Genetik von Verhaltensreaktionen auf Ethanol.
Empfindlichkeit 15,16 und der Toleranz (in 17 überprüft), um beim Menschen Ethanol wird zur Entwicklung von AUD verbunden. Beide Verhaltensreaktionen auf Ethanol in Fliegen über eine Vielzahl von Labortests (in 3,4 Bewertung) modelliert werden. Alle der Fliegen Assays den Autoren bekannt sind auf beiden zeitabhängigen Ethanol-induzierten Sedierung / Inkoordination oder zeitabhängigen Rückgewinnung aus Ethanol Sedierung basiert.
In einem früheren Artikel aus unserer Gruppe über die Genetik der Ethanolsensitivität und rapid Toleranz in Drosophila, einem Verhaltenstest basierend auf Ethanoldampf-induzierten Sedierung von Fliegen wurde 18 verwendet. Testing in diesem Test wurde durch die Übertragung von Live-Erwachsenen initiiert fliegt ohne Betäubung, um Nahrung zu leeren Fläschchen, Trapping die Fliegen in den Fläschchen mit einer Celluloseacetat-Stecker, Zugabe von Ethanol zu der Spitze (dh nicht-fly-Seite) des Celluloseacetats Stecker, und Abdichten der Ampulle, die Fliegen, Celluloseacetat Stecker und Ethanol mit einem Silikonstopper (siehe schematische Abbildung S3 Referenz 18). Mehrere Fläschchen, die verschiedene Gruppen von Fliegen wurden parallel untersucht, der Durchsatz erhöht dieses Assays. Die Fläschchen wurden eine anonyme Code gegeben und Experimentatoren wurden Behandlungsgruppe geblendet, um unbeabsichtigte Verzerrungen bei der Beurteilung der Sedierung zu vermeiden. In einer Standard-Experiment fliegt in Ampullen wurden sanft mit 6-Minuten-Intervallen abgegriffen und nach einer 30 Sekunden Erholung, wurde die Anzahl der sediert Fliegen in jedem Fläschchen gezählt und converted, um die prozentuale aktive Fliegen. Fliegen absorbiert Ethanoldampf aus dem Celluloseacetat-Plug in einem zeitabhängig, was zu einem progressiven Anstieg der internen Ethanol 18 und Sedierung (siehe Referenz 18 und 1A und 1B in diesem Bericht). Sedierung in diesem Test wurde operativ wie Fliegen (i) stehen in der Abwesenheit von Walking oder (ii) auf dem Rücken liegend mit oder ohne mit den Flügeln schlugen definiert. Hier wird diese Ethanol Sedierung Assay im Detail beschrieben, wird eine weitere Betriebsoptimierung relevant Verwendung vorgesehen, und der Assay wird verwendet, um den Beitrag der Nahrungsergänzung Optionen auf fly Sedierung Empfindlichkeit ansprechen.
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Protocol
1. Tag vor dem Assay
- Sammeln Fliegen in frischen Lebensmitteln Fläschchen in Gruppen von 11 (gleichgeschlechtlichen) unter kurzen (1-5 min) CO 2.
- Lassen Sie Fliegen auf O / N in der Lebensmittelfläschchen umwelt selbst kontrollierte Verkaufsflächen wiederherzustellen (in der Regel 25 ° C, 60% relative Feuchtigkeit, 12 h Hell / Dunkel-Zyklus).
- Bereiten Ethanol-Lösung (en) durch Verdünnen reine (100%) in Ethanol gereinigt (≥18 MQ) Wasser auf eine Endkonzentration (n) für das geplante Experiment geeignet. Anschließend Lösung (en) auf RT O / N zurück.
Hinweis: Die Verdünnung von Ethanol ist exotherm.
2. Tag der Assay
- Für jedes zu prüfende Ampulle von Fliegen, vorzubereiten (i) eine saubere, leere Konserven Fläschchen; dh Testfläschchen, (ii) ein neuer Celluloseacetat Stecker, (iii) ein Silicon-Stopfen und (iv) 1 ml Ethanollösung (siehe Tabelle 3).
- Bereiten Testraum durch Einstellen der Temperatur auf 20-25 ° C und die relative Luftfeuchtigkeit um 55-65%.
- Haben Sie eine andere Arbeitskraftvergeben Sie einen eindeutigen Code für jede Gruppe von Fläschchen und notieren Sie den Code für später. Zeigen codierten Röhrchen mit Fliegen im Testraum für ein paar Minuten akklimatisieren.
- Beschriften Sie leere Testfläschchen bis hin zu Codes auf Fly Ampullen von 2,3 entsprechen.
- Konstruieren Sie eine Hardcopy Testprotokoll in einer Tabellenkalkulation ähnlich Tabelle 1 Eingabe der Codes in Spalten (eine Spalte / Fläschchen).
- Mit dem Testprotokoll als Leitfaden, ordnen codiert Essen Fläschchen mit Fliegen und leere Testfläschchen in entsprechende Felder in den Testraum.
Hinweis: Eine sinnvolle maximale Anzahl der Fläschchen, um zu testen, ist 24 (dh, 6 Sätze von 4 Flaschen je). - Über fliegt aus der Nahrung in die Fläschchen abgestimmt / beschriftet leer Test Fläschchen und sofort legen Celluloseacetat Stecker in Testfläschchen bis Celluloseacetat Stecker sind 2 cm unterhalb der Flasche Tops.
- Im Folgenden behandeln jede Zeile von vier Ampullen als Set zu gestaffelten 1-Minuten-Intervallen.
- Für die Zeit 0 Beurteilung, fassen Jedes Fläschchen individuell with Daumen und Zeigefinger, und tippen Sie vorsichtig auf dem Tisch drei Mal, um Fliegen auf den Boden der Ampulle klopfen, warten Sie 30 Sekunden und dann zählen die Anzahl der Fliegen, die unbeweglich / tot sind. Notieren Sie sich die Anzahl der unbeweglich / tote Fliegen für jedes Fläschchen zum Zeitpunkt 0 min in dem gedruckten Testprotokoll.
- Timer starten Zählen kontinuierlich zum Zeitpunkt 0 und beginnt sofort mit Zugabe von 1 ml Ethanol zu Celluloseacetat Stecker in die Fläschchen für die erste Zeile / Set von 4 Flaschen. Zugabe von 1 ml Ethanol zu der Celluloseacetat Topfen in die Fläschchen in 5 Sekunden-Intervallen in der Reihenfolge, wie sie getestet werden. Hinzufügen von Ethanol zu der Celluloseester-Stecker in einer kreisförmigen Bewegung, so daß das Ethanol gleichmäßig in der Celluloseacetat Topfen absorbiert. Wenn Ethanol wurde an alle 4 Testdurchstechflaschen in der Menge hinzugefügt wurde, legen Sie eine Silikonkappe in jedem Fläschchen, um sie zu versiegeln.
- Zu Zeiten 1, 2, 3, 4 und 5 min, 1 ml Ethanol zu den zweiten, dritten, vierten, fünften und sechsten Sätze von 4 Flaschen sind. Weiter Einsetzen Silikonstopper nachZugabe von Ethanol zu jedem Satz von 4 Flaschen.
- Zum Zeitpunkt 6 min, testen Sie den ersten Satz von 4 Durchstechflaschen durch Greifen einer Flasche mit Daumen und Zeigefinger, leichtes Klopfen auf den Tisch dreimal, um Fliegen auf den Boden der Ampulle klopfen, warten 30 Sekunden und dann Zählen und Aufzeichnen der Gesamtzahl der Fliegen, die sediert werden. Score fliegt wie betäubt, wenn sie (i) stehen auf dem Boden des Gefäßes, aber nicht zu Fuß oder (ii) liegen auf dem Rücken, mit oder ohne mit den Flügeln schlugen.
- Fassen Sie das Fläschchen in der Höhe von 5 Sekunden-Intervallen mit dem Zeitplan in der Tabelle 2.
- Zu Zeiten 7, 8, 9, 10 und 11 min, testen die zweiten, dritten, vierten, fünften und sechsten Sätze von Fläschchen, die jeweils wie für den ersten Satz durchgeführt.
- Zum Zeitpunkt 12 min, Testen des ersten Satzes von 4 Flaschen wiederum wie in 2.12 beschrieben, und weiterhin die Prüfung der zweiten, dritten, vierten, fünften und sechsten Sätze von Röhrchen bei 13, 14, 15, 16 und 17 min, auf.
- Weiter Testfliegen wie in 2.12 beschrieben, bis alle Fliegen sind sedated.
- Geben Sie die Gesamtzahl der Fliegen in jeder Flasche in der Papiertestprotokoll. Zensieren unbeweglich / tote Fliegen zum Zeitpunkt 0 aus der Gesamtzahl der Fliegen.
- Berechnen Sie die prozentuale aktive Fliegen an jedem Bewertungszeitpunkt und Plot-Daten als% aktive Fliegen (y-Achse) gegen die Zeit (x-Achse). Quantifizieren Ethanol Sedierung durch Interpolation Sedierung Zeit 50 Werte (ST50, Zeit zu 50% Sedierung) von Polynom dritter Ordnung oder S-förmigen Kurvenanpassungen oder Berechnung Fläche unter der Kurve.
- Kompilieren von Daten aus decodiert Fläschchen und statistische Analysen durchführen (zB Einweg-ANOVA mit Bonferroni Mehrfachvergleichstest) gegebenenfalls für das experimentelle Design.
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Representative Results
Die Rohdaten dieser Ethanol Sedierung Assays ist die Zahl der Fliegen, die als Funktion der Ethanoldampf Einwirkzeit sediert. Rohdaten werden auf die prozentuale aktive Fliegen als eine Funktion der Zeit umgewandelt werden (Primärdaten, die 1A, B, D - F). Empfindlichkeit gegenüber Ethanol Sedierung von den primären Daten, wie Sedation Zeit 50 (ST50) quantifiziert werden, die Zeit für 50% der Fliegen erforderlich sedierten oder aea unter der Kurve (AUC) zu werden, durch Interpolation von der Kurve passt. Zuvor berichtete, 18 Polynom dritter Ordnung Kurven passen die Primärdaten sowie die erwarteten (durchschnittliche R 2 = 0,934, n = 24, 1A), wenn auch sigmoidale Kurven passen die primären Daten etwas besser (durchschnittliche R 2 = 0,997, n = 24; 1B). Als eine Alternative zur Bestimmung ST50 Werte von Kurvenanpassungen kann Ethanol Sedierung Empfindlichkeit von den primären Daten auch als Bereich quantifiziert werdenunter der Kurve (AUC,% aktive Fliegen x Zeit) (1C). Die Ergebnisse aus diesen drei Verfahren zur Quantifizierung korrelieren sehr gut miteinander (Pearson r 2 ≥0.998, n = 24) und im wesentlichen nicht zu unterscheiden (Abbildung 1C), wobei die Einheiten notwendigerweise unterschiedlich ST50 (min) und AUC (% aktiv sind, fliegt x Zeit). Details zu allen Berechnungen, Tabellen verwendet, etc. zur Verfügung aus dem entsprechenden Autor. Beachten Sie, dass höhere und niedrigere Werte ST50 (oder AUC) weisen auf abgestumpft und erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Ethanol Sedierung auf. Aus Gründen der Konsistenz mit dem letzten Bericht 18 wurden ST50 Werte von Polynom dritter Ordnung Kurvenanpassungen abgeleitet im weiteren Verlauf dieses study.Importantly verwendet, die Effekte der RNAi gegen Cnx14D (1D) und Mutationen im SCB detektiert der Assay (1E) , aru und hppy (1F),
Während der routinemäßigen Einsatz dieses Tests, Gewindeschneiden von Vials mit Celluloseacetat-Stecker mit 2 ml Ethanol benetzt verursacht das Celluloseacetat-Stecker in Richtung der Böden von einigen Fläschchen in wenigen Einzelversuche (nicht dargestellt) zu reisen, damit möglicherweise ändern die Fliegen "frei Raum und die Konzentration der Ethanoldampf. Zusätzlich etwa 0,25 ml Ethanol den Boden erreicht (dh Fliegen Seite) des Celluloseacetats die Stecker, wenn sie mit 2 ml Ethanol (2A) benetzt wurden, was die Möglichkeit eröffnet, die in diesen Assays Line wurden belichtet, um Flüssigkeit zusätzlich Ethanol Dampf Ethanol. Verringern des Volumens von Ethanol in dem Celluloseacetat-Stecker von 2 ml bis 1 ml eliminierte die Unterwanderung der cellulosE Acetat Stecker während des Assays selbst nach starkem Klopfen (nicht gezeigt) und ebenfalls eliminiert messbare Mengen an Ethanol-Lösung in den Boden eines Celluloseacetat Steckern (2A). Sedierung von Fliegen war empfindlich gegenüber dem Volumen von Ethanol auch bei Mengen von weniger als 1 ml (1A - C) verwendet. Verwendung von 1 ml Ethanol trägt somit einen konstanten offenen Raum für Fliegen während des Assays zu erhalten und gewährleistet, dass Flüssigkeit Ethanol ist nicht eingenommen wurde. Fliegen sind daher vermutlich ausschließlich als Dampf in diesem Test Ethanol ausgesetzt. Ein ml 85% Ethanol (dh Dampf von 1 ml 85% (Vol / Vol) Ethanol) und 1-5 Tage alte w [A] Fliegen wurden in allen nachfolgenden Studien hier berichtet werden, sofern nicht anders angegeben verwendet.
In Experimenten mit 24 Fläschchen, sind Fliegen vorsichtig bei 6 min-Takt geklopft, damit der Experimentator zu bewerten (dh durchlaufen) Alle Fläschchen auf einer vernünftigen, verschrieben fahrplane. ST50s aus Studien mit Kontrollfliegen mit weniger Flaschen und 5-Minuten-Intervallen sollten ST50s vergleichbaren Studien mit 6-Minuten-Intervallen (Daten nicht gezeigt). Fliegen werden zur Sedierung 30 sec nach dem Abstich, um die Versuchszeit zu ermöglichen, um einen Satz von vier Fläschchen nacheinander vor der Bestimmung der Sedierung Status der Fliegen in jeder Ampulle tippen beurteilt. Um festzustellen, ob Unterschiede in der schneidenden Kraft oder Erholungszeit nach Antippen Auswirkungen Ethanol Sedierung Empfindlichkeit, ST50 Werte bei männlichen und weiblichen Kontrollfliegen wurden, während sie tippte normalerweise (Regular) gemessen oder sehr stark (Hard) und nach einem Standard 30 Sekunden oder länger 60 Sekunden Erholung. Klopfen Kraft (2B) und Wiederherstellungszeit (2C) hatte keinen messbaren Effekt auf ST50 Werte in Steuer Männern oder Frauen.
Antibiotika können verwendet werden, um das Wachstum von Bakterien in Lebensmitteln fly Medium zu unterdrücken. Um festzustellen, ob Ergänzung der Nahrungsmittel mit Antibiotika wirkt Ethanol Sedierung Empfindlichkeit,ST50 Werte wurden in Fliegen für eine Generation, in Gegenwart oder Abwesenheit von drei Antibiotika aufgezogen gemessen (Ampicillin, 100 ug / ml; Tetracyclin 20 ug / ml; Chloramphenicol, 125 ug / ml). Aufzucht Fliegen an diesen drei Antibiotika hatte keine Wirkung auf Ethanol Sedierung Empfindlichkeit (2D).
Fliegen werden, um leere Lebensmittel übertragen Fläschchen-und werden daher von Nahrung und Wasser für ca. 5 min-unmittelbar bevor sie auf Ethanoldampf in der Sedierung Assay ausgesetzt beraubt. Um festzustellen, ob die Zeit, die Fliegen werden in leere Konserven Fläschchen vor Beginn des Tests Auswirkungen Ethanol Sedierung Empfindlichkeit gehalten wurden Fliegen für 6 Stunden (mindestens 70-fache der Norm) und wurden dann ST50 Werte gemessen verhungert. Starvation 6 Stunden signifikant verringert ST50s in beiden männlichen und weiblichen Kontrollfliegen (2E). Obwohl der Effekt von Verhungern ST50 war relativ klein (9-14% bei diesen Versuchen), die Menge an Zeit vergeht spend in leere Fläschchen, bevor sie an Ethanoldampf in dem Test ausgesetzt sind, sollten gleichmäßig über Gruppen in einem Experiment und auch zwischen Experimente statt.
Labor Fliege Essen mit Live-Hefe ergänzt werden (zB 18,20,23,24) zur Förderung der Produktion von Nachkommen. Zum Beispiel Essen Fläschchen mit Live-Hefe ergänzt (Saccharomyces cerevisiae) früher als die mit Hitze abgetöteten Hefe oder ohne lebende Hefe (d10-d11 vergleichen, weiße Balken, 3A) hergestellt Erwachsene, obwohl die Gesamtzahl der Nachkommen über 20 Tage produziert war nicht zu unterscheiden in Fläschchen mit Live und Hitze abgetöteten Hefe (3A) ergänzt. Um die Möglichkeit, die Hefe erzeugen leben sinnvollen Mengen Ethanol auf Fly Nahrung anzugehen, wurden die Auswirkungen der lebende Hefe auf (i) Ethanol in der Lebensmittel, (ii) Ethanol in Fliegen, und (iii) Ethanol Sedierung Empfindlichkeit bei Fliegen gemessen. Nahrungsmittel mit Live-Hefe enthaltenen Unter ergänzterhebliche Mengen an Ethanol im Vergleich zum Speisen mit Hitze abgetötete oder keine Hefe (3B) ergänzt. Dennoch Kontrollfliegen auf Medium mit Live ergänzt war, getötet oder keine Hefe hatte ununterscheidbar niedrigen Konzentrationen von internen Ethanol (3C). Außerdem war Ethanol Sedierung Empfindlichkeit unterscheiden in Kontrollfliegen auf Medium mit durch Hitze abgetöteten oder lebenden Hefen (3D) ergänzt wurde.
Abbildung 1. (AC) Sedierung Testdatenanalysewahlen. Steuer w [A] Weibchen (w 1118 isogenen, Bloomington Indiana Drosophila Stock Center Lager # 5905) ausgesetzt waren von den angegebenen Mengen von 85% (v / v) Ethanol Dampf. (A) Sedierung Zeitverlaufsdaten passen mit Dritt Um Polynome. (B)Sedierung Zeitverlaufsdaten passen mit S-förmigen Kurven. (C) Ethanol Sedierung Empfindlichkeit (linke Y-Achse) ST50 Werte von dritter Ordnung Polynome interpoliert und sigmoidale Kurven oder (rechte y-Achse) Fläche unter der Kurve quantifiziert (AUC,% aktive Fliegen x Zeit). Ethanol Volumen, jedoch nicht Analyseverfahren beeinträchtigt Ethanol Empfindlichkeit (two-way ANOVA; Wirkung Volumen, p <0,0001; Wirkung von Analyseverfahren, ns; n = 8 / Gruppe; AUC Daten transformiert 1/100, um die Differenz in Rechnung Größe der Werte). (DF) Vertreter Zeitverlaufsdaten aus. (D) Expression von Cnx14D RNAi im Nervensystem (elav-Gal4 / v5597) abgestumpft Ethanol Empfindlichkeit in Bezug auf Kontrollen (v5597 / + und elav-Gal4 / + ). (E und F) Mutation s cb (SCB Vol2) und aru (aru 8,128) erhöhte Ethanol Sedierung Empfindlichkeit und Mutation hppy (hppyKG5537) abgestumpft Ethanol Sedierung Empfindlichkeit im Vergleich zu Kontrollen. Daten in EF wurden bereits berichtet, wie ST50 Werte 18.
Abbildung 2. Bewertung der Betriebsparameter in der Sedierung Assay. (A) Menge an Ethanol in den unteren 2 mm aus Celluloseacetat Steckern. Das Volumen an Ethanol zugegeben, um die Spitzen von Celluloseacetat Stopfen hatte einen signifikanten Effekt auf das Volumen an Ethanol, die während einer mock 60 min Versuch (one-way ANOVA, p <0,0001 in die unteren 2 mm aus Celluloseacetat Stopfen bewegt; * Bonferroni Mehrfachvergleichstest, 2 ml vs 0 und 1 ml, p <0,05 n = 4). Ethanol wurde als eine Änderung der Masse der Celluloseacetat-Stecker Stärke des Klopfens die Fläschchen während der Prüfung (Regular, Hard) noch Geschlecht der Fliegen getestet quantifiziert. (B) Weder betroffenen ST50s (zwei way ANOVA; Wirkung von Klopfen, ns; Wirkung von Sex, ns; n = 12) (C) Weder Erholzeiten nach dem Klopfen noch Sex hatte erhebliche Auswirkungen auf ST50s (Zwei-Wege-ANOVA;. Wirkung von Recovery-Zeit, ns; Wirkung von Sex, ns;. n = 6) (D) Die Aufnahme von Antibiotika (ATC, Ampicillin, Tetracyclin und Chloramphenicol) im Wachstumsmedium hatte keine Auswirkungen auf das Gesamt ST50s, aber es gab ein Effekt des Geschlechts auf ST50 (Zwei-Wege-ANOVA; Wirkung von ATC, ns; Wirkung von Sex, p = 0,001; Interaktion , ns;. n = 6) (E) Wirkung von Hunger auf Ethanol Sedierung Empfindlichkeit. ST50s waren deutlich niedriger bei Fliegen von Nahrung und Wasser vorenthalten 6 Stunden (Starved) im Vergleich zu normal gefüttert (Fed) fliegt; ST50s bei Männern und Frauen zu unterscheiden waren insgesamt (Zwei-Wege-ANOVA; Wirkung von Hunger, p <0,0001; Wirkung von Sex, ns, n = 12; * Bonferroni-Mehrfachvergleiche, Wirkung von Hunger bei Männern und Frauen, p <0,05) .
Abbildung 3: Wirkung von lebenden Hefen auf Wachstum, Ethanolgehalt und Sedierung Empfindlichkeit. (A) Erwachsene Nachkommen von Fläschchen mit Lebensmitteln Medium ohne Hefe (Kein Y) ergänzt, durch Hitze abgetöteten Hefe (Killed Y) oder lebende Hefe (Live-Y). Weiß Bars, erwachsene Nachkommen Schwellen während der Tage 10 bis 11; graue Balken, 12-20 Tage. Insgesamt hatte Hefe Behandlung eine signifikante Wirkung auf Nachkommen Produktion (one-way ANOVA; alle (10-20) Tagen, p <0,0001; 10-11 Tage, p <0,0001; 12-20 Tage, p = 0,0002; n = 5 ). Anzahl der Nachkommen bei allen (10-20) Tagen hergestellt war größer aus Fläschchen mit Killed Y und Y als Live-Nein Y (Bonferroni Mehrfachvergleichstest, p <0,05). Während der Tage 10-11, Fläschchen mit Live-Y produziert mehr Nachkommen als Killed Y und Fläschchen mit Killed Y produziert mehr Nachkommen, als No Y (weiße Balken, Bonferroni-Mehrfachvergleiche, p <0,05). Während der Tage 12-20, Fläschchen with Killed Y produziert mehr Nachkommen als Flaschen mit Nein Y oder Live-Y (graue Balken, Bonferroni Mehrfachvergleichstest, p <0,05). (B) Ethanol in der Lebensmittel war in Fläschchen mit Live-Y ergänzt deutlich höher als die Durchstechflaschen mit Nein Y und Y Killed (one-way ANOVA, p <0,0001, n = 5; Bonferroni Mehrfachvergleichstest, p <0,05) (C) Internal Ethanol in w [A] weibliche Fliegen war nicht signifikant durch eine Supplementierung mit Hefe betroffen (ein. -Wege ANOVA, ns, n = 5-10). Ethanolgehalt in B und C bestimmt, wie beschrieben 18 (D) ST50 Werte wurden durch die Ergänzung des Wachstumsmediums mit Hefe bei männlichen oder weiblichen w [A] (Zweiwege-ANOVA nicht signifikant beeinflusst;. Wirkung von Hefe, ns; Effekt des Geschlechts, ns; n = 12).
| Fläschchen → | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Code → | ||||||||
| Gesamt # → | ||||||||
| 0 min | ||||||||
| 6 min | ||||||||
| 12 min | ||||||||
| 18 min | ||||||||
| 24 min | ||||||||
| 30 Minuten | ||||||||
| 36 min | ||||||||
| 42 min | ||||||||
| 48 min | ||||||||
| 54 min | ||||||||
| 60 min |
Tabelle 1: Typische Testprotokoll. Siehe Protokoll Schritt 2.5.
| Phiole | Hahn | Beurteilen |
| 1 | 6 min 0 sec | 6 min 30 sec |
| 2 | 6 min 5 sec | 6 min 35 sec |
| 3 | 6 min 10 sec | 6 min 40 sec |
| 4 | 6 min 15 sec | 6 min 45 sec |
Tabelle 2:. Typische Klopfen und Testplan Siehe Protokoll Schritt 2.13.
| Name Material / Ausrüstung | Unternehmen | Katalog-Zahl | Kommentare / Beschreibung |
| Essen Fläschchen | VWR | 89092-772 | schmal |
| Flugs | Genesee / FLIEGuff.com | 49-102 | schmal |
| Silikonstopfen | Fisher Scientific | 09-704-1l | # 4 |
| Ethanol | Pharmakotherapeutische Aaper | 111000200 | 200 Proof |
Tabelle 3: Materialien.
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Discussion
Einfache Tests, die reproduzierbar quantifizieren sinn Phänotypen sind von großem Wert für die Analyse des Verhaltens. Die hier beschriebenen Arbeiten werden mehrere praktische Aspekte eines Tests zur Messung von Ethanol Sedierung Empfindlichkeit und schnelle Toleranz in Drosophila. Obwohl nicht ein Schwerpunkt dieser Arbeit, sind Verhaltensanalysen durch die Erhaltung der Umwelt und genetischen Hintergrund Konstante für Probanden in einer Studie erleichtert. Ferner sollten Vergleiche typischerweise zwischen Gruppen von Fliegen aufgezogen und getestet nebenSeiten erfolgen. Zu diesem Zweck alle Fliegen in den einzelnen Experimenten in dieser Arbeit hatte den gleichen genetischen Hintergrund und wurden nebeneinander unter einheitlicher Umweltbedingungen (25 ° C, 60% relative Luftfeuchtigkeit, 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus) mit Standard-Nahrung Medium aufgezogen (10 % Saccharose, 3,3% Maismehl, 2% Hefe und 1% Agar) mit Ausnahme der Experimente, in denen die Nahrung Medium wurde explizit manipuliert.
Die ethanol hier beschriebenen Sedierung Assay benötigt sehr wenige Materialien (Kunststofffläschchen, Celluloseacetat Steckern Silikonstopfen und Ethanol), die alle preiswert und leicht von kommerziellen Quellen erhältlich (Tabelle 3) sind. Das Ethanol Sedierung Assay ähnelt und zu einem großen Teil auf die zuvor beschriebenen Verfahren (zB 6,20,25-27, umfassend in 3,28 Bewertung). Obwohl alle diese Tests sind nützlich zur Messung von Ethanol Sedierung Empfindlichkeit, hier beschriebenen Vorteile des Tests umfassen (i) Fliegen werden nicht auf flüssige Ethanol während des Tests ausgesetzt, (ii) die reduzierte Möglichkeit, der fliegt kann verstrickt in Baumwolle oder anderes Material werden im Testfläschchen während des Assays, (iii) die Fähigkeit, viele Gruppen von entfernt parallel zu testen, und (iv) drei Optionen zur objektiven Quantifizierung von Ethanol Empfindlichkeit von primären Datensätzen. Zusammen bieten diese Vorteile weitgehend die Möglichkeit, dass Ethanol trinken fliegt zu beseitigen, that Ethanol könnte die Außenflächen von Fliegen und hemmt ihre gesamte Bewegungsfähigkeiten zu benetzen, und dass die Leistung von Fliegen im Test könnte durch Schwierigkeiten verwickeln Material in der Testumgebung assoziiert verwechselt werden. Zusätzlich werden diese Vorteile erhöhen die Gesamtdurchsatz und Reproduzierbarkeit des Assays. Weiterhin wird Ethanol Empfindlichkeit in diesem Test gemessen nicht durch die Expression von endogenen beeinflusst weiß oder die transgene Marker mini-white 18, so dass es für Untersuchungen mit Transgenen und genetischen Hintergründen üblicherweise in Drosophila genetische Analysen geeignet.
Mehrere wichtige Parameter sollte kontrolliert werden, um zuverlässige Ergebnisse aus Ethanol Sedierung Assays zu erhalten. Zusätzlich zur Steuerung der Wachstumsbedingungen und genetischen Hintergrund von Stämmen getestet wird (siehe oben), das Volumen und die Konzentration von Ethanol sind natürlich auf die Quantifizierung von Ethanol Skalenteilungs extrem wichtigty. Man beachte, dass die Verdünnung von Ethanol in Wasser ist exotherm. Folglich sollte verdünnt Ethanollösungen erlaubt werden, auf RT vor der Einleitung der Sedierung Assays äquilibrieren. Ein zusätzlicher Parameter, der gleichförmig über den Gruppen getestet werden sollte, ist die Zeitdauer, die Fliegen werden in leere Konserven Phiolen vor dem Starten der Sedierung Assay untergebracht. Zwei weitere Parameter ebenfalls gesteuert werden. Die Anzahl der Fliegen pro Fläschchen sollte idealerweise (a) das gleiche in allen Fläschchen und Gruppen, (b)
eine Zahl, die einfach, schnell, kann gezählt werden, und (c) eine Reihe groß genug, um relativ glatte Sedierung Zeit-Kurse ermöglichen. Elf fliegt / Fläschchen funktioniert gut in unserem Labor und ist ein Ausgangspunkt vorgeschlagen. Ein letzter Parameter zu prüfen, ist das Alter der in Sedierung Assays verwendet Fliegen. Obwohl keine reproduzierbare Auswirkungen des Alters auf Ethanol Sedierung Empfindlichkeit in 1-10 Tage alten Fliegen hat sich herausgestellt (Daten nicht gezeigt), scheint der Einsatz von jungen gleichaltrigen Tierengerechtfertigt angesichts der großen Literatur über altersbedingte Veränderungen im Verhalten von Fliegen 29,30.
Andere Parameter scheinen nicht so kritisch in Sedierung Assays mindestens beim Testen Kontrollfliegen über die Bereiche der hier beschriebenen Parameter. Sex, Stärke tippen, Recovery-Zeit von Klopfen und Ergänzung der Fliege Essen mit Antibiotika (Ampicillin, Tetracyclin und Chloramphenicol) oder lebende Hefe nicht Ethanol Messempfindlichkeit gemessen wie hier beschrieben. Ebenso Quantifizierung Ethanol Empfindlichkeit durch Interpolation aus Polynom dritter Ordnung Kurven, Interpolation aus sigmoidalen Kurven oder Bestimmung der AUC von der primären Sedierung Zeitverlaufsdaten führt zu wesentlichen nicht unterscheidbar Interpretationen. Obwohl kein Einfluss des Geschlechts wurde konsequent in den hier beschriebenen Studien beobachtet wurden, haben Auswirkungen auf Sex Ethanol Empfindlichkeit in mehreren Drosophila genetische Hintergründe berichtet 31. Somit ist es möglich, dass Geschlechts Wirkungen wareneinfach durch genetische Varianz in der w [A] Hintergrund verwendet hier maskiert. Alternativ ist es möglich, dass die Messung sex Wirkungen auf Verhaltensreaktionen in Drosophila, noch nicht identifizierten Assay oder Wachstumsbedingungen erforderlich. In jedem Fall ist die Empfehlung, alle Parameter so einheitlich wie möglich in Sedierung Tests, einschließlich des Geschlechts einer Gruppe machen explizit verglichen.
Da lebende Hefe erzeugen beträchtliche Mengen an Ethanol in fly Essen, es war etwas überraschend, dass eine Supplementierung der Nahrung mit Live-Hefe nicht interne Ethanol in Fliegen zu erhöhen. Eine mögliche Erklärung ist, daß das Ethanol nicht gleichmäßig über die Oberfläche des Lebensmittels hergestellt und fliegt könnte daher selektiv einnehmen Lebensmittel keine oder relativ geringe Konzentrationen von Ethanol. Weitere Studien werden benötigt, um diese und andere mögliche Erklärungen für diesen Befund richten.
Eine große Anzahl von Modifikationen der Assay described hier sind in Abhängigkeit von den Zielen des Experiments durchgeführt. Zum Beispiel kann die Anzahl von Ampullen in einem Experiment getestet, die Anzahl der Fliegen in jeder Phiole getestet, wobei die Konzentration und das Volumen von Ethanol verwendet wird, die Dauer der Ethanolexposition, das Zeitintervall zwischen Sedierung Abschätzungen, dem Alter und Geschlecht der Fliegen getestet und die Kriterien zur Sedierung können alle modifiziert werden, um die Bedürfnisse der jeweiligen Labors gerecht zu werden. Es wird empfohlen, mit einer oder zwei Gruppen von vier Ampullen zu starten, wenn zunächst das Erlernen der Assay und Skalierung auf bis zu mit der Anzahl der Fläschchen, die die für das Projekt erforderlichen Durchsatz bietet. Sollte unerwartet kurz oder lang ST50s beobachtet werden, wäre es eine gute Übung, um sicherzustellen, dass die Test Fliegen wurden kurze (1-5 min) Anästhesie Zeiten durften aus der Narkose O / N zurückzugewinnen, wurden weniger als 10 Tage alt waren Beim Transport, der nicht durch Ethanollösung benetzt nicht physisch beschädigt und nicht über Bewegungsstörungen.
Der Test misst Ethanol Sedierung Empfindlichkeit nur und wird daher nicht ausgelegt oder geeignet für die Beurteilung anderer Verhaltensreaktionen auf Ethanol. Wie alle bekannten Ethanol Verhaltensparadigmen in Fliegen, dieser Test erfordert Fliegen weitgehend normale Bewegungsfähigkeit haben und Genotypen daher mit eingeschränkter Bewegungs sollten nicht getestet werden. Eine weitere Einschränkung des Assays ist, dass die Konzentration der Ethanoldampf in das Fläschchen wird vermutlich kontinuierlich als Medikament verflüchtigt vom Celluloseacetat Stecker steigt. Obgleich interne Ethanol der Fliegen steigt progressiv mit der Zeit in allen Flug Ethanol Verhaltensassays scheint es möglich, dass die Bereitstellung einer festen Konzentration von Ethanoldampf, um Fliegen könnte die Konsistenz der Ergebnisse dieser Assays zu verbessern. Verfahren zur Abgabe einer bestimmten Konzentration von Ethanoldampf noch nicht identifiziert worden, die erlauben würde der Assay auf dem hier beschriebenen Umfang eingesetzt werden.
Das Ethanol Sedierunghier beschriebene Assay ist für die genetische Analyse von Ethanol Empfindlichkeit und schnelle Toleranz 18 gut geeignet. Wachstum Umwelt, genetischen Hintergrund, der Konzentration und Volumen an Ethanol, die Zeit fliegt verbringen in leere Konserven Fläschchen, und die Anzahl und Alter der Fliegen verwendet werden, sollten alle gesteuert werden. Angenommen, diese Parameter ausreichend kontrolliert wird, sollte die Sedierung Assay geeignet sein sowohl für Rückwärts- und Vorwärts genetischen Ansätze, die molekulare Basis für Verhaltensreaktionen auf in Drosophila Ethanol zu untersuchen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| food vials | VWR | 89092-772 | narrow |
| Flugs | Genesee/flystuff.com | 49-102 | narrow |
| silicone stopper | Fisher Scientific | 09-704-1l | #4 |
| ethanol | Pharmaco-Aaper | 111000200 | 200 proof |
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