Abstract
הפרעת שימוש באלכוהול (AUD) היא אתגר בריאותי חמור. למרות מרכיב תורשתי גדול לAUD, כמה גנים היו מעורבים באופן חד משמעי באטיולוגיה שלהם. זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, הוא מודל עוצמה לחקר מנגנונים מולקולריים-גנטיים שבבסיס התנהגויות הקשורות לאלכוהול, ולכן טומן בחובו הבטחה גדולה לזיהוי וההבנה של הפונקציה של גנים המשפיעים על AUD. השימוש במודל תסיסנית למחקרים מסוג תלוי בזמינות של מבחני שלמדוד באופן מהימן תגובות התנהגותיות לאתנול. דו"ח זה מתאר assay המתאים להערכת רגישות אתנול וסובלנות מהירה בזבובים. רגישות אתנול נמדדה בassay זה מושפעת הנפח והריכוז של אתנול משמש, מגוון רחב של מניפולציות גנטיות שדווחו בעבר, וגם את משך זמן הזבובים הם שוכנו ללא מזון מייד לפני הבדיקה. בניגוד לכך, של אתנולensitivity נמדד בassay זה אינו מושפע מהמרץ של טיפול זבוב, מין של הזבובים, ותוספת של מדיום גידול באנטיביוטיקה או שמרים חיים. שלוש שיטות שונות לרגישות אתנול quantitating מתוארות, כולם מובילים לתוצאות רגישות אתנול בלתי שונה במהות. טבע מדרגי של assay זה, בשילוב עם הפשטות שלה הכוללת להגדרה והוצאה נמוכה יחסית, הופך אותו מתאים לניתוח גנטי בקנה מידה קטן וגדול של רגישות אתנול וסובלנות מהירה בדרוזופילה.
Introduction
הפרעת שימוש באלכוהול (AUD) היא בעיה בריאותית עצומה ברחבי העולם (שנסקרה ב1). למרות מנגנוני הנהיגה פיתוח AUD מורכבים, יש להם הפרעות אלה מרכיב גנטי משמעותי (לדוגמא, 2). התורשתיות הגדולה של AUD והתגובות התנהגותיות המשומרות כדי אתנול על פני מינים רבים (שנסקרו ב3,4) יצרו עניין רב בשימוש באורגניזמים מודל גנטיים כדי לחקור את מעורבותם של גנים מסוימים בהתנהגויות הקשורות לאתנול להבנה טוב יותר של הבסיס המולקולרי של AUD. זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, התפתח כאורגניזם מודל מוביל לחקר מנגנונים מולקולריים-גנטיים של התנהגויות הקשורות לאתנול (שנסקרו ב3,4). מחקרים בזבובים הדגישו תפקידים במשך כמה מסלולי איתות בתגובות התנהגותיות לאתנול (הנסקרת ב 5). מעניין לציין, שחלק מהגנים והמסלולים המשפיעים על התנהגות responses לאתנול בזבובים גם היה מעורב בהתנהגויות הקשורות לאתנול מכרסם ו / או AUD האנושי (למשל, 6-14). שימור מנגנוני נהיגה התנהגויות הקשורות לאתנול בין מינים, בשילוב עם החבילה של כלים גנטיים זמינים במערכת מודל דרוזופילה, מדגיש את התועלת של מודל זבוב פירות לחקירת הגנטיקה של תגובות התנהגותיות לאתנול.
רגישות וסובלנות 15,16 (הנסקרת ב -17) כדי אתנול בבני האדם קשורה להתפתחות של AUD. שתי תגובות התנהגותיות אלה כדי אתנול יכולים להיות מודל בזבובים באמצעות מגוון רחב של מבחני מעבדה (שנסקר ב3,4). כל מבחני הזבוב ידועים למחברים מבוססים על שני מושרה אתנול הרגעה / חוסר קואורדינציה תלוי זמן או זמן החלמה תלוי מהרגעת אתנול.
במאמר קודם מהקבוצה שלנו בגנטיקה של רגישות אתנול וrסובלנות apid בדרוזופילה, assay התנהגות המבוסס על הרגעה מושרה אדי אתנול זבובים שימשה 18. הבדיקה בassay זה הייתה ביוזמת העברה מבוגרת חי עפה ללא הרדמה לרוקן את בקבוקוני מזון, לכידת הזבובים בצלוחיות עם תקע אצטט תאית, הוספת אתנול לראש (כלומר, הצד הלא-fly) של התקע אצטט תאית, ו איטום הבקבוקון המכיל זבובים, תקע אצטט תאית ואתנול עם פקק סיליקון (ראה סכמטי באיור S3, התייחסות 18). בקבוקונים מרובים המייצגים קבוצות שונות של זבובים הוערכו במקביל, הגדלת תפוקה של assay זה. בקבוקונים ניתנו קוד אנונימי והנסיינים לא היו מודעים לקבוצת טיפול למניעת הטיה מכוונת בהערכת ההרגעה. בניסוי סטנדרטי, זבובים בבקבוקונים שנקשו בעדינות בשעה 6 דקות במרווחים, ולאחר התאוששות 30 שניות, את מספר הזבובים מסוממים בכל בקבוקון נספר וconverteד לזבובים פעילים אחוזים. זבובים נקלטו אדי אתנול מהתקע אצטט תאית באופן תלוי זמן, גורמים לעלייה הדרגתית באתנול הפנימי 18 והרגעה (התייחסות CF 18 ואיור 1 א ו -1 B בדוח זה). הרגעה בassay זה הוגדרה מבצעי כזבובי מעמד (i) בהעדר ההליכה או (ii) שוכב על גבם, עם או בלי נפנוף הכנפיים שלהם. כאן, assay ההרגעה אתנול זה מתואר בפירוט, אופטימיזציה תפעולית נוספת הנוגע לשימוש בו מסופקת, וassay משמש לטיפול בתרומה של אפשרויות תוספי מזון על רגישות הרגעה זבוב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. יום לפני Assay
- לאסוף זבובים לתוך צלוחיות מזון טריות בקבוצות של 11 (חד מיני) תחת CO הקצר (1-5 דקות) 2.
- לאפשר זבובים להתאושש O / N בבקבוקוני מזון בחלל מבוקר לסביבה (בדרך כלל 25 ° C, 60% לחות יחסית, שעות אור 12 / מחזור כהה).
- הכן פתרון אתנול (ים) על ידי דילול (100%) אתנול טהור במים מטוהרים (≥18 MΩ) לריכוז סופי (ים) מתאים לניסוי המתוכנן. לאפשר פתרון (ים) כדי לחזור לRT O / N.
הערה: הדילול של אתנול פולט חום.
2. יום של Assay
- לכל בקבוקון של זבובים להיבדק, להכין (i) בקבוקון מזון נקי, ריק; כלומר, בקבוקון בדיקות, (ii) תקע אצטט תאית חדש, (iii) פקק סיליקון ו( iv) 1 מיליליטר של תמיסת אתנול (ראה טבלה 3).
- הכן חדר בדיקות על ידי התאמת טמפרטורה 20-25 מעלות צלזיוס ולחות היחסית ל55-65%.
- יש עובד נוסףלהקצות קוד ייחודי לכל קבוצה של בקבוקונים ולהקליט את הקוד לשימוש מאוחר יותר. מניחים צלוחיות מקודדות עם זבובים בחדר בדיקות כדי להסתגל לכמה דקות.
- תווית בקבוקוני בדיקות ריקות כדי להתאים קודים על בקבוקונים לטוס מ -2.3.
- לבנות יומן עותק בדיקה קשה על ידי הזנת הקודים לעמודות (עמודה אחת / בקבוקון) בגיליון אלקטרוני דומה לטבלת 1.
- , שימוש ביומן הבדיקות כמדריך לסדר בקבוקוני מזון מקודדים עם זבובים ובקבוקוני בדיקות ריקים למערכי התאמה בחדר הבדיקה.
הערה: מספר מרבי סביר של בקבוקונים לבדוק הוא 24 (כלומר, 6 סטים של 4 בקבוקונים כל אחד). - העברת זבובים מבקבוקוני מזון להתאמת בקבוקוני בדיקות ריקות שכותרתו / ולהכניס מייד תקעים אצטט תאית לתוך צלוחיות בדיקות עד תקעים אצטט תאית הם 2 סנטימטר מתחת לצמרות הבקבוקון.
- מכאן והלאה, לטפל בכל שורה של ארבעה בקבוקונים כערכה במרווחים דק 'מדורגים 1.
- להערכה זמן 0, לתפוס כל בקבוקון בנפרד wאגודל ואצבע ה- i, לטפוח בעדינות על השולחן שלוש פעמים לדפוק זבובים לתחתית של הבקבוקון, לחכות 30 שניות ואז לספור את מספר הזבובים שהם נייחים / מתים. רשום את מספר הזבובים נייחים / מתים עבור כל בקבוקון בזמן 0 דקות ביומן הבדיקות המודפסת.
- הפעלת טיימר ספירה ברציפות בזמן 0 ומייד מתחיל הוספת 1 מיליליטר של אתנול לתקעים אצטט תאית בבקבוקונים לשורה / הסט הראשון של 4 בקבוקונים. הוסף 1 מיליליטר של אתנול לתקעים אצטט תאית בבקבוקונים במרווחים של 5 שניות על מנת שייבחנו. הוספת אתנול לתקעים אצטט תאית בתנועה סיבובית, כך שאתנול נספג באופן שווה לאורך כל התקעים אצטט תאית. כאשר אתנול נוספו לכל 4 בקבוקוני הבדיקה בסט, להכניס תקע סיליקון בכל בקבוקון כדי לאטום אותו.
- בזמנים 1, 2, 3, 4 ו -5 דקות, להוסיף 1 מיליליטר של אתנול לרביעי, סטים השני, שלישיים, החמישי והשישי של 4 בקבוקונים, בהתאמה. המשך החדרת פקקי סיליקון לאחרהוספת אתנול לכל סט של 4 בקבוקונים.
- בזמן 6 דקות, לבדוק את הסט הראשון של 4 בקבוקונים ידי אחיזת כל בקבוקון עם אגודל ואצבע, הקשה בעדינות על השולחן שלוש פעמים לדפוק זבובים לתחתית של הבקבוקון, מחכה 30 שניות ולאחר מכן ספירה ורישום המספר הכולל של זבובים שהם מסוממים. ציון עף כמו מסומם אם הם (i) עומדים על רצפת הבקבוקון אבל לא ללכת או (ii) לשכב על גבם, עם או בלי נפנוף הכנפיים שלהם.
- לטפל בכל בקבוקון בתוך נקבע על 5 מרווחי שניות באמצעות לוח הזמנים בטבלה 2.
- לפעמים 7, 8, 9, 10 ו -11 דקות, לבדוק את הסטים שני, שלישיים, רביעי, חמישי והשישי של בקבוקונים, בהתאמה, כפי שנעשה לסט הראשון.
- בדקות זמן 12, לבדוק את הסט הראשון של 4 בקבוקונים שוב כפי שמתואר ב2.12 ולהמשיך הבדיקה רביעית, הסטים שני, שלישיים, חמישי והשישי של בקבוקונים בגיל 13, 14, 15, 16 ו -17 דקות, בהתאמה.
- המשך זבובי בדיקה כמתואר ב2.12 עד שכל הזבובים שלedated.
- הזן את המספר הכולל של זבובים בכל בקבוקון ביומן עותק הבדיקה הקשה. לצנזר זבובים נייחים / מתים בזמן 0 מהמספר הכולל של זבובים.
- לחשב את זבובי אחוזים פעילים בכל נקודת זמן הערכה ונתונים עלילה כזבובי% פעילים (ציר y) לעומת זמן (ציר x). לכמת הרגעה אתנול על ידי ביון סדציה זמן 50 ערכים (ST50, זמן להרגעת 50%) מסדר שלישי עקום פולינום או sigmoidal מתאים או חישוב שטח מתחת לעקומה.
- לאסוף נתונים מבקבוקונים מפוענחים ולבצע ניתוחים סטטיסטיים (למשל, בכיוון אחד ANOVA עם מבחן השוואה מרובה Bonferroni) מתאים כלתכנון ניסוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
נתונים הגולמיים מassay ההרגעה אתנול זה הם המספרים של זבובים שהם מסוממים כפונקציה של זמן חשיפת אדי אתנול. הם נתונים גולמיים הוסבו לזבובים הפעילים אחוזים כפונקציה של זמן (נתונים ראשוניים, איורים 1 א ', ב', ד '- ו'). רגישות להרגעת אתנול מנתונים הראשוניים ניתן נרשמת כסדציה זמן 50 (ST50), את הזמן הנדרש עבור 50% מזבובים להפוך מסומם או AEA מתחת לעקומה (AUC), באמצעות אינטרפולציה מהעקומה מתאימה. בעבר דיווח 18 עקומות פולינום מסדר שלישי להתאים את הנתונים העיקריים גם כצפוי (R הממוצע 2 = .934, n = 24, איור 1 א), אם כי עקומות sigmoidal להתאים את הנתונים העיקריים קצת יותר טובים (R הממוצע 2 = .997, n = 24; איור 1). כחלופה לקביעת ערכי ST50 מהתקפים עקום, רגישות הרגעה אתנול מנתונים הראשוניים יכולה להיות גם ונרשמת כאזורמתחת לעקומה (AUC, זבובים פעילים% x זמן) (איור 1 ג). התוצאות משלוש שיטות של quantitation אלה לתאם טובים מאוד אחד עם השני (פירסון r 2 ≥0.998, n = 24) והם בעצם שאין להבחין (איור 1 ג), אם כי היחידות שונות בהכרח לST50 (דקות) וAUC (% פעילים עף זמן x). פרטים לגבי כל החישובים, גיליונות אלקטרוניים משמשים, וכו 'זמינים מן המחבר המקביל. שים לב שערכים גבוהים ונמוכים של ST50 (או AUC) מצביעים הקהו ומשופרים רגישות אתנול הרגעה, בהתאמה. לעקביות עם הדוח הקודם 18, ערכי ST50 נגזרים מהתקפים עקום פולינום מסדר שלישי שמשו בכל שאר study.Importantly זה, assay מזהה את ההשפעות של RNAi נגד Cnx14D (1D איור) ומוטציות בSCB (איור 1E) , לארו וhppy (איור 1F),
במהלך שימוש שיגרתי של assay זה, הקשה של צלוחיות עם תקעים אצטט תאית רטובה עם 2 מיליליטר של אתנול גרם אצטט התאית מתחברת לנסוע לכיוון תחתית של כמה בקבוקונים בכמה ניסויים בודדים (לא מוצג), ובעקבות כך משתנים חופשיים "הזבובים חלל וריכוז אדי אתנול. בנוסף, כ 0.25 מיליליטר של אתנול הגיע לתחתית (כלומר, לטוס צד) של התקעים אצטט תאית כשהם רטוב עם 2 מיליליטר של אתנול (איור 2 א), מעלה את האפשרות שעפה במבחנים אלה נחשפו לאתנול נוזלי בתוספת כדי אתנול אדים. הצמצום היקף אתנול בתוספת אצטט תאית מ2 מיליליטר עד 1 מיליליטר בטל את ההגירה כלפי מטה של cellulosתקעי דואר אצטט במהלך assay גם לאחר הקשה נמרצת (לא מוצגת) וגם חיסלה כמויות למדידה של פתרון אתנול על התחתית של תקעים אצטט תאית (איור 2 א). ההרגעה של זבובים הייתה רגישה לנפח של אתנול המשמש גם עם כמויות של פחות מ 1 מיליליטר (איור 1 א - ג). שימוש 1 מיליליטר של אתנול ולכן מסייע בשמירה על שטחים פתוחים קבועים לזבובים במהלך assay ומבטיח כי אתנול נוזלי לא מתעכל. זבובים ולכן נחשפים ככל הנראה כדי אתנול אך ורק כאדים בassay זה. אחת מיליליטר של אתנול 85% (כלומר, אדים מ1 מיליליטר של 85% (כרך / כרך) אתנול) ו1-5 יום ישן w [] זבובים שמשו בכל המחקרים שלאחר מכן דיווחו כאן, אלא אם כן צוין אחרת.
בניסויים עם 24 בקבוקונים, זבובים נקשו בעדינות בשעה 6 דקות במרווחים על מנת לאפשר הנסיין להעריך (כלומר, לעבור) את כל הבקבוקונים בschedul סביר, שנקבעדואר. ST50s ממחקרים עם זבובי שליטה באמצעות פחות בקבוקונים ו -5 דקות במרווחים היו דומה לST50s ממחקרים עם מרווחים של 6 דקות (מידע לא מוצג). זבובים מוערכים להרגעת 30 שניות לאחר ההקשה על מנת לאפשר זמן הניסוי ברז סט של ארבע צלוחיות ברצף לפני קביעת מעמד ההרגעה של הזבובים בכל בקבוקון. כדי לקבוע אם הבדלים בהקשת מרץ או זמן התאוששות לאחר ההקשה רגישות הרגעה אתנול השפעה, ערכי ST50 בזבובי שליטה גבריים ונשיים נמדדו בזמן שטפח בדרך כלל (רגיל) או באופן חד מאוד (קשיח) ולאחר 30 שניות סטנדרטית או 60 שניות ארוכות יותר התאוששות. מרץ הקשה (איור 2) וזמן התאוששות (איור 2 ג) לא היו השפעה מדידה על ערכי ST50 בזכרים או נקבות שליטה.
אנטיביוטיקה יכולה לשמש כדי לדכא התפתחות חיידקים במדיום מזון זבוב. כדי לקבוע אם תוספת של מדיום המזון עם אנטיביוטיקה משפיעה רגישות הרגעה אתנול,ערכי ST50 נמדדו בזבובים שגדלו דור אחד בנוכחות או עדר של שלוש אנטיביוטיקה (אמפיצילין, 100 מיקרוגרם / מיליליטר; טטרציקלין, 20 מיקרוגרם / מיליליטר; כלורמפניקול, 125 מיקרוגרם / מיליליטר). זבובי גידול בשלושת סוגי אנטיביוטיקה אלה לא היו השפעה על רגישות הרגעה אתנול (איור 2 ד).
זבובים מועברים לאוכל ריק בקבוקונים-ולכן מניעת מזון ומים ל~ 5 דקות-מייד לפני שנחשף לאדי אתנול בassay ההרגעה. כדי לקבוע אם כמות זבובי זמן נשמרות בבקבוקוני מזון ריקים לפני ביצוע רגישות ההרגעה אתנול השפעות assay, זבובים הורעבו במשך 6 שעות (לפחות 70 של פי רגיל) ולאחר מכן ערכי ST50 נמדדו. רעב במשך 6 שעות ירד באופן משמעותי ST50s בשני זבובי הזכר ונקבה השליטה (איור 2E). למרות השפעת ההרעבה על ST50 הייתה קטנה יחסית (9-14% בניסויים אלה), את משך הזמן עף SPEnd בבקבוקונים ריקים לפני שנחשף לאדי אתנול בassay צריך לתת דין ואחיד על פני קבוצות בתוך ניסוי וגם בין ניסויים.
יכול להיות בתוספת מזון זבוב מעבדה עם מרים חיים (למשל, 18,20,23,24) כדי לקדם את הייצור של צאצאים. לדוגמא, בקבוקוני מזון בתוספת שמרים חיים (Saccharomyces cerevisiae) המיוצרים על מבוגרים מוקדם יותר מאשר אלה עם שמרים-נהרג חום או לא מרים חיים (השווה D10-D11, ברים לבנים, איור 3 א), אם כי המספר הכולל של צאצאים המיוצרים על פני 20 ימים היה להבחין בבקבוקונים בתוספת שמרים חיים ו- נהרג חום (איור 3 א). להתייחס לאפשרות שגרה שמרים לייצר כמויות משמעותיות של אתנול על מזון זבוב, את ההשפעות של שמרים בשידור חיים באתנול (i) במדיום המזון, (ii) אתנול בזבובים, וכן (iii) רגישות הרגעה אתנול בזבובים נמדדו. בינוני מזון בתוספת תת מרים חיים הכילוכמויות stantial של אתנול בהשוואה למזון בתוספת שמרים-נהרג חום או לא (איור 3). עם זאת, זבובי שליטה גדלו על מדיום בתוספת חי, נהרגו או לא היו לו שמרי ריכוזים אין להבדיל בין השתיים נמוכות של אתנול הפנימי (איור 3 ג). יתר על כן, רגישות הרגעה אתנול הייתה להבחין בזבובי שליטה גדלו על מדיום השלים עם-נהרג חום או שמרים חיים (איור 3D).
איור 1. אפשרויות ניתוח נתונים (AC) assay סדציה. שליטת w [] נקבות (w 1,118 isogenic, המניה # Bloomington אינדיאנה תסיסנית מרכז Stock 5905) נחשפו לאדים מכרכים מצויינים של 85% (כרך / כרך) אתנול. נתונים () סדציה זמן כמובן בקנה אחד עם שלישי פולינומי סדר. (ב)נתונים הרגעה בזמן כמובן בקנה אחד עם עקומות sigmoidal. (C) אתנול הרגעה רגישות ונרשמת כערכים (Y-ציר השמאלי) ST50 אינטרפולציה מפולינומי מסדר שלישי ועקומות sigmoidal או אזור (ציר Y מימין) מתחת לעקומה (AUC,% זבובים פעילים x זמן). אתנול נפח, אבל לא שיטת ניתוח, רגישות אתנול השפיע (דו-כיווני ANOVA; השפעה של נפח, p <0.0001; השפעה של שיטת ניתוח, ns; n = 8 / קבוצה; נתונים AUC הפכו 1/100 כדי להסביר את ההבדל ב סדר גודל של הערכים). (DF) נתונים בזמן כמובן נציג מ. (ד) ביטוי של Cnx14D RNAi במערכת העצבים (elav-Gal4 / v5597) הקהה היחסית רגישות אתנול לבקרות (v5597 / + ו- Gal4 elav / + ). (E ו- F) מוטציה של cb s (Vol2 SCB) ולארו (לארו 8.128) רגישות משופרת אתנול הרגעה ומוטציה של hppy (hppyKG5537) הקהה את רגישות הרגעה אתנול השוואה לקבוצת ביקורת. הנתונים בEF דווחו בעבר כST50 ערכי 18.
איור 2. הערכה של פרמטרים תפעוליים בassay ההרגעה. (א) סכום של אתנול ב2 מ"מ תחתית התקעים אצטט תאית. הנפח של אתנול הוסיף אל צמרות תקעים אצטט תאית הייתה השפעה משמעותית על ההיקף של אתנול שעבר ל- 2 מ"מ תחתית התקעים אצטט תאית במהלך ניסוי 60 דקות מדומה (בכיוון אחד ANOVA, p <0.0001; * Bonferroni בדיקה מרובה השוואה, 2 מיליליטר לעומת 0 ו -1 מיליליטר, p <0.05 n = 4). ST50s מושפע אתנול היה נרשמת כשינוי במסה של התקעים אצטט תאית. (ב) גם מרץ של הקשה על הבקבוקונים במהלך בדיקה (רגילה, קשה) ולא מין של הזבובים שנבדקו (שתי-w איי ANOVA; השפעת הקשה, ns; השפעה של יחסי מין, ns; n = 12) (ג) גם זמן החלמה לאחר ההקשה ולא מין היה השפעה משמעותית על ST50s (דו-כיווני ANOVA;. השפעה של זמן התאוששות, ns; השפעה של מין, ns; 6) הכללת n = (D) של אנטיביוטיקה. (ATC; אמפיצילין, טטרציקלין וכלורמפניקול) במדיום הגידול לא היו השפעה הכוללת על ST50s, אבל לא הייתה השפעה של מין על ST50 (דו-כיווני ANOVA; השפעה של ATC, ns; השפעה של המין, p = 0.001; אינטראקציה , Ns;. N = 6) (E) ההשפעה של רעב על רגישות הרגעה אתנול. ST50s היו נמוך באופן משמעותי בזבובי מניעת מזון ומים במשך 6 שעות (מורעב) בהשוואה לכלל האכיל (הפד) זבובים; ST50s בזכרים ונקבות לא ניתן היה להבחין כולל (דו-כיווני ANOVA; השפעה של רעב, p <0.0001; השפעה של המין, ns; n = 12; בדיקות * Bonferroni מרובות השוואה, השפעה של רעב בזכרים ונקבות, p <0.05) .
ithin-page = "תמיד"> 
איור 3. השפעה של שמרים בשידור חיים בצמיחה, תוכן אתנול ורגישות הרגעה. () צאצאים למבוגרים מבקבוקונים המכילים בינוני מזון בתוספת ללא שמרים (לא Y), שמרי חום נהרגו (נהרג Y) או שמרים חיים (Live Y). ברים לבנים, צאצאים בוגרים המתעוררים בימים 10-11; פסים אפורים, ימים 12-20. בסך הכל, שמרי טיפול היה השפעה משמעותית על ייצור זרע (בכיוון אחד ANOVAs; כל (10-20) הימים, p <0.0001; ימי 10-11, p <0.0001; ימי 12-20, p = 0.0002; n = 5 ). המספר כולל של צאצאים הנוצרים במהלך כל (10-20) הימים היה גדול יותר מצלוחיות עם Y נהרג ו- Live Y מאשר לא Y (מבחן Bonferroni מרובה השוואה, p <0.05). בימים 10-11, צלוחיות עם השידור החי Y מיוצרות יותר צאצאים מאשר נהרג Y וצלוחיות עם Y נהרג מיוצרות יותר צאצאים מאשר לא Y (ברים לבנים, בדיקות השוואה מרובות Bonferroni, p <0.05). במהלך ימים 12-20, בקבוקוני wiה נהרג Y מיוצר יותר צאצאים מאשר צלוחיות עם לא Y או Y Live (פסים אפורים, מבחן השוואה מרובה Bonferroni, p <0.05). אתנול (B) במדיום המזון היה גבוה יותר באופן משמעותי בבקבוקונים בתוספת חי Y בהשוואה לצלוחיות עם לא Y ונהרג Y (בכיוון אחד ANOVA, p <0.0001, n = 5; מבחן Bonferroni מרובה השוואה, p <0.05) (C) אתנול פנימי בw [] זבובים נשיים לא הושפעו באופן משמעותי על ידי תוספת של שמרים (אחד. -way ANOVA, ns, n = 5-10). תוכן אתנול בB ו- C נקבע כמתואר 18 ערכים (D) ST50 לא הושפעו באופן ניכר על ידי התוספת של מדיום הגידול עם שמרים בזכר או נקבת w [א] (דו-כיווני ANOVA;. השפעה של שמרים, ns; השפעה מין, ns; n = 12).
| בקבוקון → | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| הקוד → | ||||||||
| סך הכל # → | ||||||||
| 0 דקות | ||||||||
| 6 דקות | ||||||||
| 12 דקות | ||||||||
| 18 דקות | ||||||||
| 24 דקות | ||||||||
| 30 דקות | ||||||||
| 36 דקות | ||||||||
| 42 דקות | ||||||||
| 48 דקות | ||||||||
| 54 דקות | ||||||||
| 60 דקות |
טבלת 1: יומן בדיקה טיפוסי. ראה שלב פרוטוקול 2.5.
| בקבוקון | ברז | להעריך |
| 1 | 6 דקות 0 שניות | 6 דקות 30 שניות |
| 2 | 6 דקות 5 שניות | 6 דקות 35 שניות |
| 3 | 6 דקות 10 שניות | 6 דקות 40 שניות |
| 4 | 6 דקות 15 שניות | 6 דקות 45 שניות |
טבלה 2:. הקשה אופיינית ולוח זמני בדיקות ראו שלב פרוטוקול 2.13.
| שם חומר / ציוד | חברה | מספר קטלוגי | תגובות / תיאור |
| בקבוקוני מזון | VWR | 89092-772 | צר |
| Flugs | Genesee / flystuff.com | 49-102 | צר |
| פקק סיליקון | פישר סיינטיפיק | 09-704-1l | # 4 |
| אתנול | Pharmaco-Aaper | 111000200 | 200 הוכחה |
טבלה 3: חומרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מבחני פשוטים שreproducibly לכמת פנוטיפים משמעותיים הם בעלי ערך רב לניתוח ההתנהגות. העבודה המתוארת כאן מטפלת במספר היבטים מעשיים של assay למדידת רגישות הרגעה אתנול וסובלנות מהירה בדרוזופילה. למרות שלא להתמקד על עבודה זו, ניתוחי התנהגות הם הקלו על ידי שמירה על איכות הסביבה וקבועה רקע גנטי לבדיקת נושאים במחקר. יתר על כן, השוואה צריכה בדרך כלל נקבעת בין קבוצות של זבובים שגדלו ונבדקו צד-by-side. לשם כך, כל הזבובים בתוך ניסויי פרט בעבודה זו היה אותו הרקע הגנטי וגודלו זה לצד זה בתנאים סביבתיים אחידים (25 ° C, 60% לחות יחסית, שעות אור 12 / מחזור כהה) עם מדיום מזון סטנדרטי (10 % סוכרוז, קמח תירס 3.3%, שמרי 2% ואגר 1%), פרט לאלה ניסויים שבהם בינוני אוכל מניפולציות במפורש.
המכון הטכנולוגי שלassay ההרגעה anol המתואר כאן דורש מעט מאוד חומרים (בקבוקוני פלסטיק תקעים אצטט תאית, פקקי סיליקון ואתנול), כל אלה הם זולים וזמינים ממקורות מסחריים (לוח 3). assay ההרגעה אתנול זה דומה ולמבוסס על שיטות שדווחו בעבר (למשל, 6,20,25-27, בביקורת מקיפה ב3,28) במידה רבה. למרות כל מבחני האלה יש שירות למדידת רגישות הרגעה אתנול, יתרונות של assay מתוארים כאן כוללים זבובים (i) אינם חשופים לאתנול נוזלי במהלך assay, (ii) את האפשרות המופחתת שעפה יכולה להסתבך בכותנה או חומר אחר בבקבוקון הבדיקות במהלך assay, (iii) את היכולת לבחון קבוצות רבות של זבובים במקביל, ו( iv) שלוש אפשרויות לכימות האובייקטיבי של רגישות אתנול מערכות נתונים ראשוניות. יחד, יתרונות אלה במידה רבה לשלול את האפשרות שעפה אתנול משקה, thaאתנול t יכול להרטיב את המשטחים החיצוניים של זבובים וכך מונע את היכולות של תנועה הכוללת שלהם, וביצועי שהזבובים בassay יכולים להיות מבולבל על ידי קשיים הקשורים לסבך מהותי בסביבת הבדיקות. בנוסף, יתרונות אלה להגדיל את התפוקה ושחזור הכוללות של assay. יתר על כן, רגישות אתנול נמדדה בassay זה אינה מושפע מביטוי של אנדוגני הלבן או הסמן המהונדס מיני לבן 18, מה שהופך אותו מתאים ללימודים עם transgenes ורקע גנטי נפוצות בניתוחים גנטיים דרוזופילה.
צריכים להיות מבוקרים כמה פרמטרים מרכזיים כדי להשיג תוצאות אמינות ממבחני הרגעה אתנול. בנוסף לשליטה על סביבת הצמיחה ורקע גנטי של זנים שנבדק (ראה לעיל), הנפח והריכוז של אתנול הם כמובן מאוד חשובים לכימות של sensitivi אתנולty. שים לב שהדילול של אתנול במים פולט חום. כתוצאה מכך, יש לאפשר פתרונות אתנול מדוללים לאזן לRT לפני תחילת מבחני הרגעה. פרמטר נוסף שצריך להיעשות אחיד על פני הקבוצות נבדקות הוא משך זמן שזבובים הם שוכנו בבקבוקוני מזון ריקים לפני תחילת assay ההרגעה. שני פרמטרים נוספים גם צריכים להיות מבוקרים. מספר זבובים לכל בקבוקון אידיאלי צריך להיות (א) זהה בכל המבחנות וקבוצות, (ב)
מספר שניתן לספור בקלות במהירות, ו- (ג) מספר גדול מספיק כדי לאפשר לזמן-קורסי הרגעה חלקים יחסית. עשרה זבובים / בקבוקון עובד היטב במעבדה שלנו והוא נקודת התחלה שהציע. פרמטר סופי הוא להביא בחשבון את גיליו של הזבובים המשמשים במבחני הרגעה. למרות שאין לו תופעות לשחזור של גיל על רגישות הרגעה אתנול בזבובים ישנים 1-10 יום כבר נמצאו (מידע לא מוצג), השימוש בבעלי חיים באותו גיל צעירים נראהמוצדק בהתחשב בספרות הגדולה על שינויים התנהגותיים הקשורים לגיל בזבובים 29,30.
פרמטרים אחרים לא נראים קריטיים כמו במבחני הרגעה, לפחות כאשר בודקים זבובי שליטה באמצעות הטווחים של פרמטרים שתוארו כאן. סקס, כוחו של ההקשה, זמן התאוששות מקשה, ותוספי מזון זבוב עם אנטיביוטיקה (אמפיצילין, טטרציקלין וכלורמפניקול) או שמרים חיים אינם משנים את רגישות אתנול נמדדים כמפורט כאן. באופן דומה, quantitating רגישות אתנול על ידי ביון מעקומות פולינום מסדר שלישי, אינטרפולציה מעקומות sigmoidal, או קביעת AUC מנתונים בזמן כמובן הרגעה הראשונית מוביל לפרשנויות בלתי שונה במהות. למרות שאין כל השפעה של מין נצפתה באופן עקבי במחקרים שתוארו כאן, השפעות של סקס על רגישות אתנול בכמה רקע גנטי תסיסנית דווחו 31. לפיכך, ייתכן כי השפעות המין היופשוט רעול פנים בשונות גנטיות בw [] רקע משמשות כאן. לחלופין, ייתכן שהשפעות מין מדידה על תגובות התנהגותיות בדרוזופילה דורשות תנאי assay או צמיחה עדיין לא מזוהים. בכל מקרה, ההמלצה היא להפוך את כל הפרמטרים אחידים ככל האפשר במבחני הרגעה, כולל יחסי המין של כל קבוצות מושוות במפורש.
בהתחשב בכך שמרים חיים לייצר כמויות גדולות למדי של אתנול במזון זבוב, זה היה קצת מפתיע שתוספי מזון עם שמרים חיים לא גדלו אתנול פנימי בזבובים. הסבר אפשרי אחד הוא שאתנול אינו מיוצר באופן אחיד על פני השטח של המזון והזבובים עשויים, לכן, באופן סלקטיבי לבלוע מזון עם ריכוזים נמוכים יחסית של אתנול לא או. מחקרים נוספים יידרשו כדי לטפל בזה והסברים אפשריים אחרים לממצא זה.
מספר גדול של שינויים לdescrib assayed אפשרי כאן בהתאם למטרות של מתבצע הניסוי. לדוגמא, מספר הבקבוקונים נבדק בניסוי, מספר הזבובים שנבדקו בכל בקבוקון, הריכוז והנפח של אתנול משמשים, משך חשיפת אתנול, מרווח הזמן בין הערכות הרגעה, הגיל ומין של הזבובים שנבדק , כולם יכולים להיות שונה והקריטריונים להרגעה כדי שיתאימו לצרכים של מעבדה בודדת. ההמלצה היא להתחיל עם קבוצה אחת או שתיים מתוך ארבעת בקבוקונים כאשר בתחילה לומד assay ולאחר מכן בהיקף של עד באמצעות מספר הבקבוקונים המספק את התפוקה הנדרשת לפרויקט. צריך ST50s קצר או ארוך באופן בלתי צפוי לצפות, זה יהיה אימון טוב כדי להבטיח שזבובי המבחן היו נתונים לקצרים (1-5 דקות) פעמים הרדמה, הורשו להתאושש מההרדמה O / N, היו בן פחות מ -10 ימים, היו לא נפגע פיזי במהלך טיפול, לא הורטב ע"י פתרון אתנול, ולא היה לי ליקויי תנועה.
רגישות ההרגעה אתנול אמצעי assay בלבד, ולכן אינה מיועדת או מתאים להערכת תגובות התנהגותיות אחרות לאתנול. כמו כל פרדיגמות התנהגות אתנול ידוע בזבובים, assay זה דורש זבובים ליש להם יכולות של תנועה במידה רבה נורמליות ולכן גנוטיפים עם תנועה לקויה לא צריך להיבדק. מגבלה נוספת של assay היא שהריכוז של אדי אתנול בבקבוקון ככל הנראה במגמת העלייה כvolatilizes סמים מהתקע אצטט תאית. למרות אתנול הפנימי 'הזבובים עולה בהדרגה עם זמן בכל לטוס מבחני התנהגות אתנול, זה נראה אפשרי שמספק ריכוז קבוע של אדי אתנול זבובים יכולים לשפר את העקביות של תוצאות מassay זה. שיטה להעברת ריכוז קבוע של אדי אתנול טרם זוהתה שיאפשר assay לשימוש בקנה המידה שתואר כאן.
ההרגעה אתנולassay שתואר כאן הוא מתאים היטב לניתוח גנטי של רגישות אתנול וסובלנות מהירה 18. סביבת גידול, רקע גנטי, הריכוז והנפח של אתנול, כמות זבובי זמן לבלות בבקבוקוני מזון ריקים, ואת המספר והגיל של זבובים המשמשים צריך להיות כל שליטה. בהנחת פרמטרים אלה נשלטים כראוי, assay ההרגעה צריך להיות מתאים גם לאחור וקדימה גישה גנטית לחקור את הבסיס המולקולרי לתגובות התנהגותיות כדי אתנול בדרוזופילה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| food vials | VWR | 89092-772 | narrow |
| Flugs | Genesee/flystuff.com | 49-102 | narrow |
| silicone stopper | Fisher Scientific | 09-704-1l | #4 |
| ethanol | Pharmaco-Aaper | 111000200 | 200 proof |
References
- Rehm, J., et al. Global burden of disease and injury and economic cost attributable to alcohol use and alcohol-use disorders. Lancet. 373, 2223-2233 (2009).
- Prescott, C. A., Kendler, K. S. Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins. The American journal of psychiatry. 156, 34-40 (1999).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annual review of neuroscience. 36, 121-138 (2013).
- Scholz, H., Mustard, J. A. Invertebrate Models of Alcoholism. Current topics in behavioral neurosciences. 13, 433-457 (2011).
- Rodan, A. R., Rothenfluh, A. Functional Plasticity and Genetic Variation: Insights into the Neurobiology of Alcoholism. Reilly, M. T., Lovinger, D. M. 91, Elsevier. (2010).
- Schumann, G., et al. Genome-wide association and genetic functional studies identify autism susceptibility candidate 2 gene (AUTS2) in the regulation of alcohol consumption. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7119-7124 (2011).
- Corl, A. B., et al. Happyhour, a Ste20 family kinase, implicates EGFR signaling in ethanol-induced behaviors. Cell. 137, 949-960 (2009).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
- Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development. Nature. 436, 845-847 (2005).
- Riley, B. P., et al. Alcohol dependence is associated with the ZNF699 gene, a human locus related to Drosophila hangover, in the Irish affected sib pair study of alcohol dependence (IASPSAD) sample. Molecular psychiatry. 11, 1025-1031 (2006).
- Morozova, T. V., et al. Alcohol sensitivity in Drosophila: translational potential of systems genetics. Genetics. 183, 733-745 (2009).
- Ogueta, M., Cibik, O., Eltrop, R., Schneider, A., Scholz, H. The influence of Adh function on ethanol preference and tolerance in adult Drosophila melanogaster. Chemical senses. 35, 813-822 (2010).
- Han, S., et al. Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence. American journal of human genetics. 93, 1027-1034 (2013).
- Lind, P. A., et al. A genomewide association study of nicotine and alcohol dependence in Australian and Dutch populations. Twin Res Hum Genet. 13, 10-29 (2010).
- Schuckit, M. A. Low level of response to alcohol as a predictor of future alcoholism. The American journal of psychiatry. 151, 184-189 (1994).
- Schuckit, M. A., Smith, T. L. An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects. Archives of general psychiatry. 53, 202-210 (1996).
- Tabakoff, B., Cornell, N., Hoffman, P. L. Alcohol tolerance. Ann Emerg Med. 15, 1005-1012 (1986).
- Chan, R. F., et al. Contrasting Influences of Drosophila white/mini-white on Ethanol Sensitivity in Two Different Behavioral Assays. Alcohol Clin Exp Res. 38, 1582-1593 (2014).
- Eddison, M., et al. arouser reveals a role for synapse number in the regulation of ethanol sensitivity. Neuron. 70, 979-990 (2011).
- Wen, T., Parrish, C. A., Xu, D., Wu, Q., Shen, P. Drosophila neuropeptide F and its receptor, NPFR1, define a signaling pathway that acutely modulates alcohol sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2141-2146 (2005).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcohol Clin Exp Res. 33, 1794-1805 (2009).
- Bhandari, P., et al. Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors in Drosophila, Caenorhabditis elegans and mice. Genes, brain, and behavior. 11, 387-397 (2012).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
- Chen, J., Wang, Y., Zhang, Y., Shen, P. Mutations in Bacchus reveal a tyramine-dependent nuclear regulator for acute ethanol sensitivity in Drosophila. Neuropharmacology. 67, 25-31 (2013).
- Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
- Maples, T., Rothenfluh, A. A simple way to measure ethanol sensitivity in flies. J Vis Exp. , e2541 (2011).
- Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, 199-211 (2006).
- Nohronha, A. Ch. 23. Neurobiology of Alcohol Dependence. 23, Elsevier. 467-495 (2014).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental gerontology. 46, 320-325 (2010).
- Martin, I., Grotewiel, M. S. Oxidative damage and age-related functional declines. Mechanisms of ageing and development. 127, 411-413 (2006).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Acute ethanol responses in Drosophila are sexually dimorphic. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 21087-21092 (2012).
