Abstract
Multippel sklerose er en inflammatorisk demyelinerende sykdom i sentralnervesystemet kjennetegnet ved dannelse av plaque som inneholder tapte oligodendrocytter, myelin, aksoner og nerveceller. Remyelinering er en endogen reparasjonsmekanismen, hvorved ny myelin fremstilles etter at proliferasjon, rekruttering og differensiering av forløperceller oligodendrocytt i myelin dannende oligodendrocytter, og er nødvendig for å beskytte axoner mot ytterligere skade. For tiden er alle terapeutiske midler for behandling av multippel sklerose målrette avvikende immunkomponent av sykdommen, noe som reduserer inflammatoriske tilbakefall, men ikke forhindre progresjon til irreversibel nevrologisk nedgang. Det er derfor viktig at remyelinisering fremmende strategier utvikles som kan forsinke sykdomsutviklingen og kanskje reversere nevrologiske symptomer. Flere dyremodeller av demyelinisering eksisterer, inkludert eksperimentell autoimmun encefalomyelitt og curprizone; Det er imidlertid et begrensetninger i deres bruk for å studere remyelinisering. En mer robust tilnærming er det sentrale injeksjon av giftstoffer i sentralnervesystemet, inkludert vaskemiddel lysolecitin i ryggmargen hvit substans fra gnagere. I denne protokollen, viser vi at den kirurgiske prosedyren involvert i å injisere lysolecitin inn i ventral hvit substans av mus er rask, kostnadseffektiv, og krever ingen ekstra materialer enn de som er kommersielt tilgjengelig. Denne fremgangsmåten er viktig ikke bare for å studere de normale hendelser involvert i remyelinering prosessen, men også som en pre-klinisk verktøy for screening av kandidat remyelinering fremmende terapeutika.
Introduction
Multippel sklerose (MS) er en kronisk demyelinerende sykdom i sentralnervesystemet (CNS), karakterisert ved å immuncelleinfiltrasjon og plaques som inneholder tapte myelin, oligodendrocytter, aksoner og nerveceller. De fleste pasienter har et sykdomsforløp som består av inflammatoriske tilbakefall ledsaget av et bredt spekter av nevrologiske symptomer, etterfulgt av perioder med remisjon. Over halvparten av disse pasientene etter hvert overgang til en sekundær progressiv scenen med ingen åpen tilbakefall, men kontinuerlig nevrologisk nedgang. Det antas at denne progressive svekkelse skyldes aksonal skade og tap, bidro delvis av kronisk demyelinisering. Strategier for å gjenopprette tapt myelin blir dermed ansett som en lovende behandling tilnærming for å forsinke sykdomsutviklingen og kanskje reversere nevrologiske symptomer.
Remyelinisering er en endogen reparasjon respons i CNS der nye myelin hylser genereres fra rekruttert oligodendrocyte forløperceller(OPCs) som differensieres til myelin dannende oligodendrocytter. Remyelinering har blitt vist i dyremodeller for å være ganske robuste 1-3, men avtar dens effektivitet med alderen 4. Faktisk skjer remyelinisering hos mennesker, selv om det er ufullstendig i flertallet av MS-pasienter fem. Alle for tiden tilgjengelige medikamenter for MS primært mot den avvikende immunkomponent av sykdommen, og samtidig effektive for å redusere tilbakefall, ikke markert forsinke progresjon av sykdommen. Den neste generasjonen av terapeutiske strategier for forvaltning av MS vil integrere fremskritt i immunmodulering med styrking av endogen remyelinisering for å forebygge både tilbakefall og progresjon seks.
En metode for å studere de- og remyelinering i CNS involverer direkte injeksjon av vaskemiddel lysofosfatidylcholin (lysolecitin) inn i ryggmargen hvit substans 1,3,7. Denne prosedyren gir en godt karakterisert demyelinating skade bestående hovedsakelig av makrofager / microglial infiltrasjon og aktivisering 8,9, reaktiv astrogliosis, forstyrrelse av aksonal homeostase / nerveskaden og OPC spredning og migrasjon 10. Lesjonen forutsigbart utvikler seg over en periode på et par uker, og er etter hvert i stand til å fullt ut remyelinating. Denne metoden har vært spesielt nyttig i å studere koreografien av hendelser involvert i de- og remyelinisering. Videre har det blitt vedtatt som et verktøy for pre-klinisk testing av kandidat terapi for å akselerere reparasjon etter en demyeliniserende fornærmelse.
Protocol
MERK: Dyrene som brukes i denne prosedyren var ivaretatt i samsvar med den kanadiske Council on Animal Care (CCAC) retningslinjer. Etikk ble godkjent av Animal Care Utvalget ved University of Calgary.
1. Forbered sprøyte
- Oppløs lysolecitin til en 1% oppløsning i fosfatbufret saltvann (PBS; pH 7,4) og oppbevares ved -20 ° C i små alikvoter (75 ul). Tine en ampulle til RT.
MERK: hvis lysolecitin er uoppløst, sonikere røret i en ultrasonisk renere (40 kHz) i ca. 30 minutter for å danne en ensartet løsning. - Håndtere pre-trukket glass kapillær med ekstrem forsiktighet for å unngå å skade delikat spissen. Skru av mutteren på en 10 pl injisere sprøyte og tre den på den flate enden av kapillær etterfulgt av to hylser, slik at paring endene av endehylser justere og kapillær er tettsittende i den koniske hylsen (figur 1). Skyll sprøyten med isopropyl alkohol og fjerne stempelet. Når den er tørr, skru nålen montering for hånd på å injisere sprøyte.
- Fest metall hub nålen til priming sprøyte. Pierce en gummiskive med nålen og skyv den ned til bunnen. Fyll grunning sprøyte med lysolecitin. Forsiktig trykke ned grunning sprøyten til væsken er synlig på tuppen av nålen. Dette sikrer at luftbobler blir ikke innført i injeksjonssprøyten.
- Sett metall hub nål av priming sprøyten inn i sprøyte sprøyte. Å gjøre en fast tetning med gummiplate sakte trykke ned grunning sprøyten inntil kapillær fyller til spissen med løsningen. Fjern forsiktig priming sprøyte og under samtidig trykker på for å fylle sylinderen av injeksjonssprøyten uten å innføre luftbobler. Sett stempelet inn i sprøyte sprøyte og sikre oppløsning strømmer fra spissen av kapillaren som stempelet er svakt nedtrykket.
MERK: Hvis luftbobler er synlige i hattenIllary eller injeksjonssprøyte, må sprøyten preparatet bli gjentatt fra begynnelsen. Kontinuerlig væske i sprøyteapparatet er kritisk for å sikre nøyaktige injeksjonsvolumer. - Fest ferdig injisere sprøyten til armen av en stereotaktisk micromanipulator. Dette fullført apparat vil kunne injisere 15-20 dyr før du trenger å etterfylles.
- Kast de rester lysolecitin fra priming sprøyte. Uttak og trykke isopropylalkohol flere ganger, og løsne metall hub nål. Vente flere timer for de resterende isopropylalkohol i fylle sprøyte å fordampe før du fyller igjen.
2. Forbered Animal for Kirurgisk prosedyre
MERK: Denne prosedyren er beskrevet for kvinnelige C57BL / 6 mus, i alderen 8-10 uker.
- Bedøve dyret med en intraperitoneal injeksjon av ketamin (200 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) eller per institusjonelle dyrepleie forskrifter. Plan fordyr til å være under anestesi i omkring 1 time ved bruk av injiserbare anestesi.
- Test at dyret er dypt bedøvet ved å ta godt knipe på foten. En ordentlig bedøvet dyret vil ikke svare på klemme.
- Ved hjelp clippers, barbere en 2-3 cm 2 område på ryggsiden av dyret, i nærheten av ørene. Vær forsiktig så du ikke skader ørene.
- Tørk området rent med 70% etanol brukes på en kompress. Sikre alle klippet håret har blitt fjernet fra området. Desinfisere området med jod.
- Påfør vaselin for øynene for å hindre uttørking gjennom hele prosedyren.
- Holde dyret i en oppvarmet utvinningskammeret inntil den er klar til å starte prosedyren.
3. gjennomføre et inngrep
MERK: Sørg for tilstrekkelig aseptisk teknikk for alle trinn i prosedyren. Dette inkluderer riktig bruk av hansker, hairnets, masker, og gardiner. Alle verktøy bør steriliseres før du kommer inn kontaktett med dyret.
- Flytte dyret til en stereotaktisk ramme, dorsal side opp, forhøyet på midten delen av brettet papirhåndklær til å overdrive den krumning av ryggraden. Fest armene og hale med kirurgisk tape og fest hodet med en tann klemme. Stabiliserende øret barer er ikke nødvendig for denne prosedyren.
- Bruk en skalpell til å lage en 3 cm midtlinjesnitt, som starter rett under ørene og kutte i hale retning.
- Finne skillet mellom de to store adipose strukturer og bruke fin pinsett i hver hånd til å trekke disse fra hverandre. Spre Saker å åpne kirurgiske feltet.
- Under en kirurgisk mikroskop, finn fremtredende utvekst prosessen av T2 vertebra (Merk: Denne funksjonen er karakteristisk for C57BL / 6 mus belastning). Utfør en stump disseksjon med lukkede våren saks gjennom overliggende muskulaturen å bedre visualisere T2. Ved hjelp av pinsett, føler for de harde overflater av T3 og T4 for å bekrefte riktig anatomisk plassering.
- Ved hjelp av våren saks, lage grunne side kutt (2-3 mm dype) av bindevev mellom T3 og T4. På grunn av naturlig avstand mellom virvlene i det øvre brystparti av musen virvelsøylen, er en laminektomi ikke nødvendig å avsløre ryggmargen. Vær oppmerksom på at for dypt kutt vil trenge gjennom og skade ledningen.
MERK: En liten grad av blødning er vanlig under dette trinnet. Hvis dette skjer, holder en svamp spyd inn i området inntil blødningen avtar (30-60 sek). - Visualisere ryggmargen. Det vil være dekket med et tykt lag av synlig dura dersom dette hinne-lag ennå ikke var kuttet mens utsette ledningen. En fremtredende blodkar løper caudal / rostralt gjennom den omtrentlige midtlinjen av ryggmargen.
MERK: Dette blodkar bør ikke brukes som et landemerke for midtlinjen. I stedet bør tilstrekkelig belysning avsløre de grå-hvit materie grenser flankerer rygg kolonnen, og disse bør brukes til å beregne midtlinjen. - Hvis duraforblir intakt, gjør milde side skraper med en 32 G metall nål før det er ryddet. Målet er å fjerne dura, mens ikke kutte de resterende underliggende hjernehinnene, som ikke er så tykk og vanskelig å se.
MERK: Offentliggjøring av spinalvæske indikerer et brudd på araknoid og mens dette kan skje uten mekanisk skade på vev, bør den akkumulerte cerebrospinalvæsken fjernes med en svamp spyd for å bedre visualisere overflaten av ledningen. - Flytt injisere sprøyten på plass og sakte senke den til spissen av kapillaren såvidt berører ryggmarg umiddelbart sideveis fra hver side av midtlinjen. Låse armen på plass.
- Bruk graderte målinger av Z-retningen stereotaktisk arm for å lage en referanseposisjon måling. Fra denne lesningen, trekke 1,3 mm. Bruk en rask og grunne nedadgående bevegelse for å pierce vev og deretter senk kapillær inntil den nye målingen er nådd. Valgfritt: Hvis ønskelig,lesjoner i dorsal-kolonnen kan fremstilles ved den samme piercing bevegelse ved midtlinjen, og en dybde på 0,3 mm (se diskusjonen for flere opplysninger).
MERK: Disse verdiene er spesifikke for injisering mellom T3 og T4. Hvis du velger å utføre injeksjon på et annet sted i ryggmargen, må disse verdiene være avledet fra alle tilgjengelige mus hjerneatlas. - Bruk mikromanipluatoren å trykke ned lysolecitin inn i ventral ryggmarg hvit substans. Foreta en rotasjon av mikromanipulator hvert 5. sek i 2 min, noe som resulterer i et endelig volum på 0,5 pl. La kapillar på plass i ytterligere 2 minutter for å forhindre tilbakestrømning av oppløsning, og deretter forsiktig fjerne kapillar.
- Knyt en enkelt sutur i muskel / fettvev overliggende ryggsøylen. Bruk en ikke-avbrutt sutur å lukke huden. Påfør mer jod til innsnitt området.
- Plasser dyret i et oppvarmet utvinning kammer før det tar seg opp, og deretter tilbake til buret sitt. Påfør analgetika post-operativt som per institusjonelle dyr omsorg forskrifter. Ytterligere postoperativ behandling er vanligvis ikke nødvendig som dyrene er fullt oppegående og i stand til selv-fôring og drikke så snart de utvinning fra anestesi.
- Gjenta prosedyren for de resterende dyrene.
MERK: Med profesjonalitet, drift kan være ferdig i 10-15 min per dyr, spesielt med hjelp av en annen person binde sting. Den samme glasskapillar kan brukes i ca. 15-20 operasjoner før spissen blir butt, og bør skiftes ut. Kontroll operasjoner kan utføres identisk som beskrevet, med en injeksjon av PBS inn i ryggmargen i stedet for lysolecitin. Vi anbefaler ikke rengjøring kapillærene for fremtidig bruk.
4. Tissue Bearbeiding og analyse
- Ofre dyrene med en intraperitoneal overdose av ketamin (500 mg / kg) og xylazin (25 mg / kg) ved ønskede tidspunkter. Lesjoner vanligvis utvikle seg i Føllgrunn måte: 1-3 dager, aktiv demyelinisering; 3-7 dager, OPC rekruttering; 7-10 dager, oligodendrocyte differensiering; 10-21 dager, aktiv remyelinisering 2,10,11.
- Å forberede vev for histologi, først utføre en transcardial perfusjon 12 med 20 ml RT PBS etterfulgt av 20 ml iskald 4% paraformaldehyde i PBS. For utarbeidelse av harpiks innebygd vev for semi- eller ultratynne seksjonering, se trinn 4.9.
- Fjerne ryggmargen ved hjelp av buede bone saks for å klippe gjennom hver ryggvirvler som starter ved cervikal enden av ryggsøylen og arbeider ned til den nedre brystnivå. Fest ryggmargen O / N i 4% paraformaldehyde i PBS ved 4 ° C. Bryter ledningene til 30% sukrose i PBS ved 4 ° C i minst 72 timer.
- Identifisere injeksjonsstedet som et avvik i dorsalflaten av ryggmargen. Skjær en 3 mm stykke vev (med injeksjonsstedet i midten) og justere bitene i cryomolds inneholder optimal skjæring temperatur (OCT) compound. Suspenundersiden av cryomolds i en avkjølt blanding av 2-metylbutan og tørris inntil oktober er fullstendig frosset. Lagre ved -80 ° C til den er klar til del.
- Seksjon de ryggmargen på en kryostat på en bredde på 20 mikrometer på objektglass og la det lufttørke O / N før lagring lysbildene ved -20 ° C.
- Oppdage lesjon plassering og størrelse ved hjelp av en eriochrome cyanine histologisk flekk av myelin 13. Utføre alle trinnene på RT. Luft tørr lysbilder for 30 min. Plasser lysbilder i clearing agent for en min etterfulgt av rehydrering i gradert etanol løsninger (100%, 95%, 90%, 70%, 50%, vann) i 1 minutt hver.
- Plasser lysbilder i eriochrome cyanine løsning for 15 minutter, etterfulgt av en 1 min vask med vann. Differensiere i 0,5% ammoniumhydroksid i 10 sekunder, etterfulgt av en 1 min vask med vann. Dehydrerer i gradert etanol løsninger (omvendt rekkefølge som beskrevet ovenfor) i 1 minutt hver, dekkglass med montering media, og bilde på en lys-felt microscope.
- Bruk immunhistokjemi for å visualisere axoner og myelin. Luft tørr lysbilder for 30 min. Dehydrerer med gradert etanol (vann, 50%, 70%, 90%, 95%, 100%) i 2 minutter hver ved RT, og deretter omvendt rekkefølge tilbake til vann. Dette trinnet resulterer i større oppløsning av individuelle myelin ringer 14.
- Blokkere ikke-spesifikke antistoffinteraksjoner ved anvendelse av 10% geiteserum og 0,25% Triton X-100 i PBS i 60 min ved RT. Fortynn primære antistoffer (mus anti-SMI312 1: 2000, kanin-anti-MBP-1: 1000) i PBS og inkuberes på objektglass O / N ved 4 ° C.
- Vask 5 ganger i 5 minutter med PBS ved RT. Fortynn sekundære antistoffer (Alexa 488 anti-kanin 1: 500, Alexa 546 anti-mus 1: 500) i PBS og inkuberes på objektglass i 60 min ved RT. Vask 5 ganger i 5 minutter med PBS ved RT. Mount lysbilder med dekkglass ved hjelp gelvatol og bilde på en fluorescerende mikroskop.
- Bruk immunhistokjemi for å visualisere celler av oligodendrocyte avstamning. Følg fremgangsmåten for step 4,7, utelatelse av dehydrering / rehydrering trinn, og ved anvendelse av 10% hesteserum i stedet for geiteserum. Bruke følgende primære antistoff fortynninger: geit-anti-PDGFRα 1: 100, mus-anti-CC1 1: 200, kanin-anti-Olig2 1: 200. Bruk følgende sekundære antistoff fortynninger: Alexa 488 anti-geit 1: 500, Alexa 594 anti-mus 1: 500, Alexa 647 anti-kanin 1: 500.
- Å forberede vev for semi- eller ultratynne seksjonering, først utføre en transcardial perfusjon 12 med 20 ml RT PBS etterfulgt av 20 ml iskald 4% paraformaldehyde / 1% glutaraldehyd i PBS. Fjerne ryggmargen som beskrevet i trinn 4.3. Fix O / N i 4% paraformaldehyde / 1% glutaraldehyd i PBS ved 4 ° C.
- Identifiser injeksjonsstedet som beskrevet i trinn 4.4. Kutte en 1 mm stykke vev inneholdende injeksjonsstedet. Ytterligere blokker 1 mm på hver side av lesjonen kan fremstilles i tillegg hvis det er ønskelig.
- I en avtrekkshette, legge til 10 ganger volum 1% osmiumtetroksyd / 1,5% kalium ferrocyanid til hver blokk på isi 60 min.
MERK: osmiumtetroksyd er et svært giftig stoff, og bør behandles med ekstrem forsiktighet. Alle materialer som er i kontakt med osmiumtetroksyd bør plasseres i maisolje (to ganger volumet som osmiumtetroksyd-løsning) for nøytralisering. - Vask snorer 3 ganger med 0,2 M cacodylat i 10 minutter ved RT, forkaster i maisolje. Dehydrerer med graderte etanolløsninger (vann, 50%, 70%, 90%, to ganger med 95%, to ganger med 100%, 2 ganger med propylenoksyd) i 10 minutter ved RT.
- Embed snorer i harpiks som per produsentens instruksjoner.
- Skjær blokker på en ultramicrotome og montere deler ut mot vanndråper på objektglass. Plasser glir på en varm plate (ca. 50 ° C) inntil tørrhet.
- Visualisere myelin ved å legge til et par dråper 1% toluidinblått / 2% boraks løsning på lysbildene for 10-15 sek ved 50 ° C. Skyll med vann, tørk, og dekkglass med monterings media. Bilde seksjoner på en lys-feltet mikroskop.
Representative Results
Focal injeksjon av lysolecitin inn i ventral hvit substans produserer en diskret demyeliniserende lesjon som er synlig over en avstand på ca 3 mm (figur 2). Immunhistokjemisk farging av lesjonen kjerne for myelin (MBP) og aksoner (SMI312) viser axoner som har blitt strippet av myelin på 7 dager (figur 3). Av 14 dager, er mange aksoner omgitt av MBP-positive ringer, noe som antyder forekomsten av remyelinering. Farging for celler av oligodendrocytt avstamning (PDGFRα, Olig2, CC1), er det en betydelig økning i både det totale antall celler i 14 dager i forhold til 7 dager, så vel som fordelingen av modne oligodendrocytter i forhold til OPCS (figur 4) . I overensstemmelse med dette funn semithin delene farget med toluidinblått avsløre tilstedeværelsen av tynne myelin-kapper på 14 dager som sjelden detekteres på 7 dager (figur 5), noe som indikerer at disse er i remyelinatednternodes.
Fremgangsmåten er meget reproduserbar mellom dyrene. Variasjon oppstår når tung pust endrer stasjonær stilling kapillær-dette er vanligvis ikke et problem med tilstrekkelig sedasjon. Skade på aksoner synes å være minimal, bortsett fra i sentrum av lesjon, som har blitt beskrevet, fordi den tidligste bruk av en modell. Vi tror at dette skal være mekanisk skade fra glasskapillar, som det er også observerbar i PBS injisert kontroller. Ikke desto mindre, har en tendens til å være liten variasjon, og vi og andre ved hjelp av en lignende fremgangsmåte har oppdaget at forskjellene mellom eksperimentelle betingelser med så få som fire dyr per gruppe 15.
Figur 1. Montering av injeksjonssprøyten. (A) Mutteren av injeksjonssprøyten er skrudd på t Han flate enden av glasskapillar, etterfulgt av to hylser, slik at deres sammenpassende ender forrigling. Når kapillæret er fast tettsittende i den koniske hylse, er sammenstillingen skrudd for hånd inn på enden av injeksjonssprøyten. (B) bit sentrum av en gummiskive med metall navet nål festet til fyllesprøyten, og skyver den ned til basen. (C) Trekk lysolecitin oppløsning inn i fyllesprøyten. (D) forsiktig trykk inn priming sprøyte før den første dråpe av lysolecitin er synlig på spissen av nålen. (E) Sett priming sprøyten inn i sylinderen av injeksjons sprøyte, slik at en fast tetning med gummiskiven. Forsiktig trykk løsningen inntil den går til enden av kapillæret. Trekke priming sprøyte nøye og samtidig opprettholde trykket på stempelet for å fjerne metall hub nål uten å innføre luftbobler inn i injisere sprøyte.laste opp / 52679 / 52679fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Representative lysolecitin lesjon farget med eriochrome cyanin. Serielle seksjoner (400 um i avstand fra hverandre) av en karakteristisk lesjon lysolecitin på 14 dager farget med eriochrome cyanin å visualisere myelin (blå). Legg merke til at demyelinering er begrenset til den ventrale hvit substans, og at den strekker seg over lesjonen omtrent 3 mm i rostrale / caudal retning. Skala bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Axoner og myelin iden lysolecitin modell. (A) En humbug (PBS) injisert ryggmargen på 7 dager viser sunne axoner som er omgitt av myelin ringer. (B) En lysolecitin lesjon på 7 dager viser avdekt axoner samt degradert myelin. (C) På 14 dager, en andel av aksoner (eksempler er merket med hvite pilspisser) er assosiert med tilsynekomsten av myelin ringer. Skala bar = 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. oligodendrocyte avstamning celler i lysolecitin modell. (A, C) På syv dager, er det en større representasjon av PDGFRα + OPCs (hvite søyler) i forhold til CC1 + oligodendrocytter (magenta barer); tallene innenfor stolpene representerer prosenter. Olig2 ble undersøkt tilbekrefte farging av oligodendrocytt avstamning celler. (B, C) Etter 14 dager er det en betydelig økning i det totale antall oligodendrocytt avstamning celler sammenlignet med 7 dager (p <0,05, to-halet t-test er n = 4 pr gruppe ). Det er også en betydelig økning i fordelingen av oligodendrocytter i OPCS på 14 dager sammenlignet med 7 dager (p <0,0001, Fishers eksakte test). Skala bar = 10 mikrometer. Hvert felt er fanget på en original forstørrelse på 60X. Verdier er gjennomsnitt ± SD. * Betyr p <0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Remyelinering i lysolecitin modell. (A) En tverrsnitts toluidinblått farget semithin delen av ventral hvit substans i en healthy mus viser axoner over et vidt område av kaliber med respektive myelin tykkelse. (B) Ved 7 dager, en mangel på myelin-kapper er observert i tilknytning til en upåvirket område (nederst til høyre). (C) Etter 14 dager tynt myelinerte mantler ( eksempler er merket med røde pilspisser) vises i hele lesjon, en indikasjon på remyelinated segmenter. Skala bar = 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Det er utviklet en rekke dyremodeller for å studere MS, mest recognizably den eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) modell. I EAE, er gnagere vaksineres mot et fragment av en myelin peptid og gjennomgå inflammatorisk lesjon utvikling manifestere i stigende lammelse. Selv om denne modellen har vært nyttig for pre-klinisk testing av immunmodulerende MS narkotika, er det ikke ideelt for å studere remyelinisering for tre hovedgrunner: For det første, er plasseringen av inflammatoriske lesjoner noe tilfeldig, og lokalisering av lesjoner ved behandling av vev for semi- eller ultratynne seksjoner kan være utfordrende. Det andre er at remyelinisering skjer over en bestemt tid selvfølgelig, og den nøyaktige alderen på en enkelt EAE lesjon kan ikke være kjent uten kontinuerlig non-invasiv magnetic resonance imaging. Det tredje er at remyelinering er et naturlig fenomen i gnagere, og tegn på remyelinering følgende behandling i EAE kan ikke være et primært resultat av stoffet, men istead et sekundært fenomen å redusere betennelse.
En annen vanlig fremgangsmåte for fremstilling av demyelinisering oppnås ved å innføre kobber chelator cuprizone i dietten. Dette resulterer i utbredt demyelinisering, særlig i corpus callosum. Det er begrensninger i å studere corpus callosum som et område av remyelinisering av følgende grunner: For det første, axon diameter (og dermed myelin tykkelse) er mindre enn andre CNS regioner, og dermed tynt remyelinated skjeder kan være umulig å skille fra de som var aldri demyelinerte. For det andre, fordi mus corpus callosum inneholder> 70% unmyelinated aksoner 16, kan det være uklart hvorvidt en remyelinated segment gjelder reparasjon av skadede myelin eller de novo-syntese myelin i den voksne, som forekommer normalt 17.
Det er vår oppfatning at den beste modellen for å studere remyelinisering er den direkte injeksjon av giftstoffer, enten lysolecitin, ethidIUM bromide, eller andre, i hale cerebrale peduncles 18 eller ryggmargen hvit substans. Den tidligere plassering oppnås bare ved nøyaktig tre-dimensjon stereotaktisk injeksjon, og er begrenset til større gnagere (rotter) på grunn av den lille størrelsen på lillehjernen peduncles. Dette utelukker omfattende ressurs av transgene mus i å studere de- og remyelinisering. Ryggmargen inneholder imidlertid mange store hvit substans traktater som er lett tilgjengelig kirurgisk. Mellomrommene mellom virvlene i rostrale thorax segment tillater eksponering av ryggmargen, uten behov for en laminektomi, som er et nødvendig trinn i caudal thorax kirurgiske prosedyrer. En fordel med spesifikt rettet mot ventral hvite saken er at aksonene er jevnt større enn rygg hvit substans, noe som gjør kvantifisering av remyelinisering en mindre tvetydig oppgave-lignende til utfordringene knyttet til corpus callosum. I tillegg utgjør en mye større t ventral hvit substansArget område å injisere; flere hundre mikron sideveis i den dorsale regionen ville plassere den kapillære utenfor kolonnen, mens det samme avviket ventralt vil likevel frembringe en fremtredende demyelinerende lesjon. Noen protokoller injisere lysolecitin i både dorsale og ventrale kolonner av det samme dyret 19. Dette kan øke både sannsynligheten for korrekt plassering og kapillær antall målbare lesjoner i færre dyr. Mens dagens data som presenteres er fra 8-10 uker gamle dyr på tidspunktet for drift, har vi også hatt suksess ved hjelp av samme prosedyre på 8-10 måneder gamle mus, der remyelinisering beskrives som å være markant tregere 4.
Kvantifisering av remyelinisering er ikke en triviell oppgave. En sentral dogmet postulerer at remyelinated segmenter er kortere i lengde og tynnere i gjennomsnitt enn sine motstykker sunne, og dermed beregninger g-ratio (axon diameter dividert med axon + myelin diameter) av tverrsnitts semi- or supertynn seksjonene blitt standard prosedyre. Det er imidlertid kjent at remyelinated segmenter tykne over tid to og en fersk studie ved hjelp av en transgen reporter fra remyelinating oligodendrocytter tyder på at mange internodes slutt bli umulig å skille fra kontroll 20. Kvantifisering av antall modne oligodendrocytter i lesjonen er en indirekte måte å måle reparasjon, oligodendrocytter som er i stand til å lage et stort antall internodes, og en vesentlig andel av remyelinering-avhengig av modellen benyttet-kan oppstå fra Schwann cellene 3. Selvfølgelig, som remyelinering har vært knyttet til gjenopprettelse av saltatory ledning 21, ville den endelige beregning av reparasjon være funksjonell bedring av nevrologiske underskudd. Mens remyelinisering har vært knyttet til utvinning av funksjon i enkelte arter 22,23, har det ikke blitt en standard prosedyre i murine lysolecitin studier. Dette er sannsynligvis på grunn av mangel på overt observatørbare underskudd fra enten rygg eller ventral lesjoner, sammenlignet med mer robuste demyelinisering modeller som EAE og selv cuprizone. Vi tror at funksjonelle underskudd som følge av lysolecitin injeksjon, og påfølgende gjenoppretting med remyelinisering, vil bare være observerbar bruker sensitive tester av fin sensorisk funksjon.
Et søk i PubMed med "remyelinisering" sammen med en av dyremodeller som er nevnt ovenfor, om enn en brysk metodisk tilnærming, viser færre søketreff for lysolecitin (109) sammenlignet med EAE (188) og cuprizone (197). Hvis vår argument at lysolecitin demyelinisering er den overlegne tilnærming for å studere remyelinisering, hvorfor er det det minste diskutert? Kanskje en pågripelse for å bruke denne metoden stammer fra en tro av tekniske problemer i å utføre kirurgisk operasjon. I virkeligheten er denne prosedyren rask, kostnadseffektiv, og er ikke vanskeligere enn rutine vev disseksjon, krever materialer som er kommersieltsielt tilgjengelig. Det er vårt håp at denne protokollen viser seg nyttig for de som ønsker å legge til denne kraftige modellen til sitt repertoar for å studere den spennende og voksende feltet av myelin reparasjon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| spring scissors | Fine Science Tools | 15004-08 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| retractor | Fine Science Tools | 17003-03 | |
| clippers | Philips | QG3330 | |
| heating recovery chamber | Peco Services | V1200 | |
| surgical tape | 3M | 1527-1 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| scalpel blade | Feather | No. 15 | |
| sponge spear | Beaver Visitec | 581089 | |
| 5-0 Vicryl sutures | Ethicon | J511G | |
| curved ToughCut spring scissors | Fine Science Tools | 15123-12 | |
| 32 G metal needle | BD | 305106 | |
| needle holders | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| angled forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| cotton tipped applicator | Puritan | 806-WC | |
| gauze pads | Safe Cross First Aid | 3763 | |
| 10 μl syringe | Hamilton | 7635-01 | make sure to purchase the microliter, not gastight syringe |
| compression fitting | Hamilton | 55750-01 | contains the 2 ferrules and removable nut, but the nut that comes with the 10 μl syringe is a tighter fit |
| priming kit | Hamilton | PRMKIT | contains the priming syringe, removable hub needle and the rubber discs |
| pre-pulled glass capillaries | WPI | TIP10TW1 (pack of 10) | contains capillaries with 10 μm inner diameter. 30 μm inner diameter also work (TIP30TW1) |
| stereotactic frame | David Kopf instruments | Model 900 | |
| Ultrasonic cleaner | Fisher Scientific | FS-20 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | VWR | 25608-930 | |
| Tissue-Tek intermediate cryomold | VWR | 25608-924 | |
| cryostat | Leica | CM1900 | |
| microscope slides | VWR | 48311-703 | |
| bright field microscope | Olympus | BX51 | |
| ultramicrotome | Leica EM UC7 | EM UC7 | |
| Lysophosphatidylchoine | Sigma | L1381 | |
| 2-methylbutane | Sigma | M32631 | |
| Triton x-100 | Sigma | X-100 | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Mouse anti-SMI312 antibody | Covance | SMI-312R | 1:2,000 dilution |
| Rabbit anti-MBP antibody | Abcam | AB40390 | 1:1000 dilution |
| Goat anti-PDGFRα antibody | R&D Systems | AF1062 | 1:100 dilution |
| Rabbit anti-Olig2 antibody | Millipore | AB9610 | 1:200 dilution |
| Mouse anti-CC1 antibody | Calbiochem | OP80 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Life technologies | A-11008 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG | Life technologies | A-11003 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Jackson Immuno | 705-546-147 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG | Jackson Immuno | 715-586-151 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Jackson Immuno | 711-606-152 | 1:500 dilution |
| PBS | Oxoid | BR0014 | |
| isopropyl alcohol | Sigma | 109827 | |
| ketamine | CDMV | ||
| xylazine | CDMV | ||
| iodine | West Penetone | 2021 | |
| Vaseline petroleum jelly | VWR | CA05971 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| sucrose | Sigma | S5016 | |
| Eriochrome Cyanine R | Sigma | 32752 | |
| sulfuric acid | Sigma | 320501 | |
| iron(III) chloride | Sigma | 157740 | |
| ammonium hydroxide | Sigma | 320145 | |
| Acrytol | Leica Biosystems | 3801700 | |
| Citrisolv | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
| horse serum | Sigma | H0146 | |
| glutaraldehyde | Electron Micrscopy Sciences | 16220 | |
| osmum tetroxide | Electron Micrscopy Sciences | 19150 | highly toxic |
| potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma | P3289 | |
| corn oil | Sigma | C8267 | |
| polyvinyl alcohol | Sigma | P8136 | |
| glycerol | Sigma | G9012 | |
| cacodylic acid | Electron Micrscopy Sciences | 12300 | |
| propylene oxide | Electron Micrscopy Sciences | 20401 | |
| EMBED kit | Electron Micrscopy Sciences | 14120 | |
| Toluidine Blue O | Sigma | T3260 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Sigma | S9640 | |
| Recipes | |||
| Eriochrome cyanine solution | |||
| Ingredient | Amount to add | ||
| Eriochrome Cyanine R | 0.8 g | ||
| sulfuric acid | 400 ml 0.5% | ||
| iron(III)chloride | 20 ml 10% | ||
| water | 80 ml | ||
| *add eriochrome cyanine to sulfuric acid, followed by iron(III) chloride and water. Solution can be kept after use. Make fresh once per year. | |||
| Gelvatol | |||
| Ingredient | Amount to add | ||
| PBS | 140 mL | ||
| polyvinyl alcohol | 20 g | ||
| glycerol | 40 g | ||
| *mix well, place at 37 °C O/N, centrifuge at 1,960 x g 30 min, aliquot into 40 tubes |
References
- Blakemore, W. F., Eames, R. A., Smith, K. J., McDonald, W. I. Remyelination in the spinal cord of the cat following intraspinal injections of lysolecithin. J. Neurol. Sci. 33 (1-3), 31-43 (1977).
- Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. Remyelination of mouse spinal cord axons demyelinated by local injection of lysolecithin. J. Neurocytol. 24 (10), 775-781 (1995).
- Blakemore, W. F. Invasion of Schwann-cells into the spinal-cord of rat following local injections of lysolecithin. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 2 (1), 21-39 (1976).
- Shields, S. A., Gilson, J. M., Blakemore, W. F., Franklin, R. J. Remyelination occurs as extensively but more slowly in old rats compared to young rats following gliotoxin-induced CNS demyelination. Glia. 28 (1), 77-83 (1999).
- Patrikios, P., et al. Remyelination is extensive in a subset of multiple sclerosis patients. Brain. 129 (Pt 12), 3165-3172 (2006).
- Keough, M. B., Yong, V. W. Remyelination therapy for multiple sclerosis). Neurotherapeutics. 10 (1), 44-54 (2013).
- Hall, S. M. The effect of injections of lysophosphatidyl choline into white matter of the adult mouse spinal cord. J. Cell Sci. 10 (2), 535-546 (1972).
- Miron, V. E., et al. M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nat. Neurosci. 16 (9), 1211-1218 (2013).
- Kotter, M. R., Setzu, A., Sim, F. J., Van Rooijen, N., Franklin, R. J. Macrophage depletion impairs oligodendrocyte remyelination following lysolecithin-induced demyelination. Glia. 35 (3), 202-212 (2001).
- Lau, L. W., et al. Chondroitin sulfate proteoglycans in demyelinated lesions impair remyelination. Ann. Neurol. 72 (3), 419-432 (2012).
- Fancy, S. P., et al. Dysregulation of the Wnt pathway inhibits timely myelination and remyelination in the mammalian CNS. Genes Dev. 23 (13), 1571-1585 (2009).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Skihar, V., et al. Promoting oligodendrogenesis and myelin repair using the multiple sclerosis medication glatiramer acetate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17992-17997 (2009).
- Plemel, J. R., et al. Platelet-derived growth factor-responsive neural precursors give rise to myelinating oligodendrocytes after transplantation into the spinal cords of contused rats and dysmyelinated mice. Glia. 59 (12), 1891-1910 (2011).
- Chong, S. Y., et al. Neurite outgrowth inhibitor Nogo-A establishes spatial segregation and extent of oligodendrocyte myelination. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (4), 1299-1304 (2012).
- Sturrock, R. R. Myelination of the mouse corpus callosum. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 6 (6), 415-420 (1980).
- Young, K. M., et al. Oligodendrocyte dynamics in the healthy adult CNS: evidence for myelin remodeling. Neuron. 77 (5), 873-885 (2013).
- Woodruff, R. H., Franklin, R. J. Demyelination and remyelination of the caudal cerebellar peduncle of adult rats following stereotaxic injections of lysolecithin, ethidium bromide, and complement/anti-galactocerebroside: a comparative study. Glia. 25 (3), 216-228 (1999).
- Mei, F., et al. Micropillar assays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nat. Med. 20 (8), 954-960 (2014).
- Powers, B. E., et al. Remyelination reporter reveals prolonged refinement of spontaneously regenerated myelin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 4075-4080 (2013).
- Smith, K. J., Blakemore, W. F., McDonald, W. I. Central remyelination restores secure conduction. Nature. 280 (5721), 395-396 (1979).
- Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. Locomotor deficits induced by experimental spinal cord demyelination are abolished by spontaneous remyelination. Brain. 120 (Pt 1), 27-37 (1997).
- Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F. Jr, Schultz, R. D. Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (16), 6832-6836 (2009).
