Protocol
1. Schritte für den am Tag vor dem Test durchführen
- Wählen L4 Stadium Würmer an die frische Nematoden Wachstumsmedium (NGM) Platten ausgesät mit einem Rasen von OP50 E. coli und Kultur sie bei 20 CO / N. Jeder Test Zustand erfordert 10 Würmer; holen einen Überschuss von Würmern für O / N-Verlust von Würmern ermöglichen.
- Nur Tiere, die erste Test-Tag Erwachsene sind; viele Mutanten wachsen mit einer geringeren Geschwindigkeit als der Wildtyp. Stellen Sie den Zeitpunkt der Kommissionierung für Stämme, die Entwicklungsverzögerungen haben, so dass alle getesteten Tiere ersten Tag Erwachsene.
2. Schritte für den am Tage der Durchführung des Tests
- Vorbereitung für den Test:
- Führen Sie Tests auf Standard ungeimpften 60 x 15 mm NGM-Platten. Trocknen Sie alle Platten bei 37 C für 2 h verwendet werden, mit Deckel aus. Für jede experimentelle Studie, verwenden Sie vier getrocknete NGM-Platten; diese werden die 0 mM und 400 mM Ethanol Assay-Platten und die sie begleitenden Akklimatisierung Platten sein.
HINWEIS:Die Verwendung von NGM-Platten ist es wichtig, Unterschiede in der Zusammensetzung der Platten, insbesondere deren Osmolarität kann stark Einfluss auf die Dosis-Antwort von Ethanol auf Verhalten ist dies aufgrund, zumindest teilweise auf Änderungen in der Menge von Ethanol von den Tieren 20 akkumuliert. NGM-Agar ist 160 mOsm. - Nach dem Trocknen wiegen jede der ungeimpften NGM-Platten, um im Assay verwendet werden und das Gewicht. Bestimmen das Volumen der Medien in den Platten basierend auf dem Gewicht einer leeren Platte. Um die Umwandlung des Gewichts des Agars zu Volumen anzunähern, davon ausgehen, dass die Medien wiegt das gleiche wie ein gleiches Volumen Wasser.
HINWEIS: Unsere beständigsten Ergebnisse wurden mit NGM Medien, die ausreichend entwässert hat, dass ein Original 10 ml Volumen hat eine Nachtrocknungsvolumen zwischen 8,3 bis 8,9 ml gefunden. Eine Alternative zu der 2 Stunden Trockenzeit ist, um zu trocknen, bis die Platten erreichen diesen Volumenbereich, um Unterschiede in Inkubatoren ausmachen. - Schmelze 4 Kupferringe (Innendurchmesser von 1.6 cm) in der Oberfläche jeder der Platten als Hürden für die verschiedenen Genotypen oder Behandlungsgruppen worms.Grasp jeder Ring mit einer Zange und Hitze in einer Flamme (eine starke Flamme eines Bunsenbrenners funktioniert gut) für etwa 3 handeln sec. Sofort legen Sie den Ring auf einer Platte, während immer noch den Ring mit der Zange, um sie von "Überspringen" zu verhindern.
- Sicherzustellen, dass der Ring ruht flach auf der Oberfläche des Agars durch Herunterdrücken mit der Zange an mehreren Stellen auf dem Ring. Beim Anbringen des Rings, seien Sie vorsichtig, um Platz für weitere drei Ringe zu verlassen.
- Schmelzen die drei zusätzlichen Kupferringe in die Oberfläche der Platte, wobei darauf zu ihnen so nahe wie möglich beieinander zu platzieren, so dass alle vier werden in das Sichtfeld der Kamera sein.
HINWEIS: Erstellen Sie eine gute Abdichtung mit dem Agar ist wichtig, um die Würmer in den Ringen während des Tests zu halten. Ringe, die um überspringen auf der Platte ist unwahrscheinlich, dass die korrekte Abdichtung mit dem Agar zu machen undkann das Agar, der Würmer zu graben können und stört die Visualisierung der Würmer Narbe. - Für jede Testplatte vorbereiten eine begleitende "Akklimatisierung" Platte, die getrocknet werden sollte und ungeimpften und kein Ethanol erhalten. Zeigen vier Kupferringe auf diesen Platten.
- Kennzeichnen die Unterseite der Platten neben jeder Ring mit dem Wurmstamm, in den Ring eingesetzt werden, wobei darauf zu nicht im Sichtfeld der Ring selbst schreiben. Bringen Sie die Etiketten auf der Testplatte mit der dazugehörigen Akklimatisierung Platte.
- Berechnen der Menge von 100% igem Ethanol zu jeder Testplatte hinzuzufügen, so dass die Endkonzentration 0 mM oder 400 mM Ethanol (Gewicht zu Volumen). Für jedes Experiment (n = 1), wird eine 0 mM und eines 400 mM Ethanol Platte sein; Akklimatisierung Platten erhalten keine Ethanol. Hinzufügen des Ethanols Pipettieren sie um die Oberfläche der Platte. Verwenden Labor Film, um die Platte zu versiegeln und lassen Sie es auf der Tischplatte für 2 Stunden ins Gleichgewicht.
- Wenn 1,5 Stunden verstrichen ist, beginnt der Akklimatisierungsschritt des Assays, Schritt 2.2.
- Führen Sie Tests auf Standard ungeimpften 60 x 15 mm NGM-Platten. Trocknen Sie alle Platten bei 37 C für 2 h verwendet werden, mit Deckel aus. Für jede experimentelle Studie, verwenden Sie vier getrocknete NGM-Platten; diese werden die 0 mM und 400 mM Ethanol Assay-Platten und die sie begleitenden Akklimatisierung Platten sein.
- Führen Sie die Fortbewegung Test: Testplatten
- Sorgfältig über 10 Würmer von jeder Versuchsgruppe zum Zentrum von einem Kupferring auf der Akklimatisierung Platte. Entfernen Sie alle Lebensmittel, die durch Kratzen leicht mit dem Wurm Pick auf dem Agar an dieser Stelle zu sehen ist. Variiert die Reihenfolge, in der die Versuchsgruppen werden auf den Platten in experimentellen Studien legen, so dass die gleichen Stämme werden auf den Platten in der gleichen Reihenfolge in den Studien legen.
HINWEIS: Das Ziel ist es, die Tiere auf dem Teller mit minimalen Mengen von Lebensmitteln zu übertragen, denn wenn Lebensmittel auf dem Akklimatisierung Platte an der Testplatte übertragen die Würmer zu aggregieren um das Essen und die Wirkung des Medikaments auf die Fortbewegung wird verdeckt werden. - Achten Sie darauf, die Oberfläche des Agar mit dem Pick zu brechen, da dies ermöglicht es die Würmer zu graben und den Test zu unterbrechen. Die Würmer bei RT inkubieren für 30 Minuten.
- Stellen Sie sicher, dass es eine entsprechende Abstand zwischen den Einweihungen jeder Platte. Ein erfahrener Experimentator 40 Tiere, 10 / ring für 4 Ringe in <1,5 min bewegen, aber jedes Intervall von bis zu 2 Minuten ist akzeptabel. Der Standardtest hat Filme Aufnahme bei 10-12 min und 30 bis 32 Minuten der Exposition sowohl für 0 mM und 400 mM Ethanol.
- Initiieren Sie die Akklimatisierung Platte für die 0 mM Belichtung und der Akklimatisierung Platte für die 400 mM Exposition ca. 2 min und 30 s auseinander, um für das Speichern der ersten Film-Datei, bevor der zweite Film müssen anfangen können.
- Nach dem 30-Minuten Eingewöhnungszeit, übertragen Sie die Würmer aus den Akklimatisierung Platten zu den Testplatten. Übertragen Sie die Würmer zu den Testplatten (0 mM oder 400 mM Ethanol) in der gleichen Reihenfolge, dass sie auf die Akklimatisierung Platte gegeben, die Verfolgung des Zeitpunkts zwischen den Fertigstellungen jeder Platte. Verschließen Sie die Platte mit Labor Film, um den Verlust von Ethanol zu Verdampfung zu minimieren.
- Use eine Schöpfbewegung mit einer dünnen Kanten abgeflacht Wurm Pick Würmer auf der Oberseite des abgeflachten Pick sammeln. Wird die Übertragung von Würmern aus dem ungesetzten Akklimatisierung Platte an der Testplatte ohne die Verwendung von Bakterien, die üblicherweise bei der Übertragung Würmer verwendet wird, da es hilft, die Schnecke zu der Aufnahme kleben.
HINWEIS: Die Geschwindigkeit, mit denen die Tiere in diesem Schritt transferiert ist sehr wichtig, weil die ersten Würmer auf der Platte länger als die letzten Würmer zu der Platte zugegeben, um Ethanol ausgesetzt werden, und früheren Zeitpunkten können einige zeitabhängige Wirkung. Dies ist der Hauptgrund für die dreh Stämme werden auf einer Platte zuerst über Experimentwiederholungen gesetzt.
- Sorgfältig über 10 Würmer von jeder Versuchsgruppe zum Zentrum von einem Kupferring auf der Akklimatisierung Platte. Entfernen Sie alle Lebensmittel, die durch Kratzen leicht mit dem Wurm Pick auf dem Agar an dieser Stelle zu sehen ist. Variiert die Reihenfolge, in der die Versuchsgruppen werden auf den Platten in experimentellen Studien legen, so dass die gleichen Stämme werden auf den Platten in der gleichen Reihenfolge in den Studien legen.
- Führen Locomotion Assay: Die Dreharbeiten
- Mikroskop verwenden / Kamera-Kombination, die für die gleichzeitige Darstellung aller vier Ringe in dem Sichtfeld (ca. 42x42 mm 2 Quadrat), ermöglicht, wie einem Mikroskopobjektiv 0,5x, 0,8x Vergrößerung und einer Kamera mit einer Auflösung von 2048x2048 7,481; m Pixel-CCD.
- Verwenden Sie gleichmäßige Ausleuchtung über das Sichtfeld, das in der Objekterkennung in der Intensitätsschwelle Schritt unterstützt (siehe unten). A 3 "x3" Hintergrundbeleuchtung funktioniert gut.
- Bild die Würmer auf einer Platte positioniert Medienseite nach oben (Deckel nach unten), der Kontrast, die bei der Verwendung der Hintergrundbeleuchtung im Vergleich zu einem herkömmlichen Mikroskop Durchlichtquelle verloren wird erzeugt.
- Bereiten Sie die Bildanalyse-Software, um Zeitraffer-Filme der sich bewegenden Würmern zu erfassen. Legen Sie die Software zur Erfassung 12-Bit-Graustufenbilder alle 1 Sek, als 2-min (120 Rahmen) Film. Um die Größe der Ausgabedatei zu reduzieren, doch behielt er ausreichende Bildauflösung, mit einem 2x2 Binning-Modus zu 1024x1024 Pixel Bilder zu fassen.
- Notieren Sie sich die Filme. Beginnen der Aufzeichnung eines 120-Rahmens Film der ersten Platte (0 mM Ethanol) 10 min nach der letzten Würmer wurden auf dieser Platte angeordnet. Speichern Sie die Videodatei.
- Notieren Sie sich die zweite Platte (400 mM Ethanol). Wiederholen Sie diesen Vorgang fürbeide Platten ab 30 Minuten nach der letzten Würmer wurden auf der ersten Platte (0 mM Ethanol) platziert, um die 30 bis 32 min Zeitpunkten für jedes Engagement mit ein.
HINWEIS: Lassen Sie ausreichend Zeit, um die Bilddateien nach jeder Aufnahme-Session, bevor die Aufnahme beginnt die nächste Platte zu analysierende speichern. - Für Zukunftssicherheit der archivierten Filme und, damit diese Filme zu öffnen und von anderen öffentlichen Bereich Open-Source-Bildbearbeitungssoftware-Programmen wie ImageJ 28 analysiert werden, wandeln eine Kopie jeder Film in 8-Bit 256 Graustufen TIFF-Dateien.
HINWEIS: Die hier beschriebene Bildanalyse-Software ein proprietäres Dateiformat verwendet.
- Die Analyse der Filme mit ImagePro Software.
- Einmal erfasst, analysiert die Filme mit Hilfe von Image-Pro Plus-Software oder den Gegenwert.
HINWEIS: Eine Vielzahl von anderen Objekt-Tracking-Software zur Verfügung, die verwendet wurde, um mehrere C erfolgreich verfolgen elegans zu einem Zeitpunkt 29 und solchenSoftware könnte einem angemessenen Ersatz für die hier beschriebene, da die Objektidentifikation Schritte auf ähnlichen Prinzipien. Das beschriebene Verfahren bezieht sich auf Image-Pro Plus-Software-Versionen von 6,0 bis 6,3 und 7,0, neuere Versionen von Image-Pro Plus-Software kann geringfügige Unterschiede haben. - Analysieren Sie Filme in 2-min (120 Rahmen) Segmenten. Erstens, einen Filter auf die Bilder, um den Hintergrund glätten und verbessern Sie den Kontrast der Wurm Objekte. Wählen Sie den Filter wie folgt: Menü> Prozess> Filter> Zubehör> Flatten: Parameter: Hintergrund = Dunkel; Verfügen Breite = 20 Pix.
- Re-speichern Sie die Filme nach dem Filterschritt, sondern auch in der Originalfilm in seiner ungefiltert zu erhalten.
- Analysieren der Fortbewegung eines Tiere in jeder Ring getrennt mit einem kreisförmigen Bereich von Interesse (ROI), der angeordnet ist und bemessen ist, um mit dem Kupferring überlappt. Identifizieren und verfolgen die Würmer mit dem Menü> Messen> Track Objects ... Befehl; Dadurch wird das Tracking-Data Tabellenfenster. Der Button-Tracking-Optionen können bestimmte Titel ausgeschlossen werden und zu experimentellen Artefakte begrenzen.
- Unter dem Reiter Auto Tracking, verwenden Sie die folgenden Parameter: Spur-Parameter: Geschwindigkeits-Grenzwert (Suchradius) = 400 & mgr; m / Rahmen, Beschleunigungsbegrenzung = Auto, Mindestgesamtstreckenlänge = 400 & mgr; m Wiegende Bewegung type = chaotisch; Objekte in Spuren Parameter: Lassen Teilspuren = yes, Mindestlänge = 21 Frames, Kamera Vorhersage Tiefe = 1 Frame.
- Um die Verfolgung einzuleiten, klicken Sie auf Suche Alle Titel automatisch funktionieren um das Dialogfeld Count / Größe Optionen und das Dialogfeld Verfolgung aufzurufen. Wählen Sie die Option Manuell für die Intensitätsbereichsauswahl im Dialogfeld Count / Größe, die die wichtige Schwelle Schritt, der die Graustufen-Intensität der Wurm Pixel verwendet, um einen Wurm Objekt zur Analyse hervorheben und die helleren Hintergrund Pixel ignorieren bietet.
- Stellen Sie die Intensität Schwelle sliders (eine, die obere Grenze gesetzt, ein, um die untere Grenze gesetzt), um einen inklusiven Bereich, die alle dunklen Objekten unterstreicht erstellen. Ein Bereich von 0-1,500 auf einer Skala von 0-4,095 ist ein guter Ausgangspunkt für die Feinabstimmung.
- Anwenden einer Filtergröße von Objekten, die größer und kleiner als eine einzige Schnecke Objekt, wie dem Kupferring und Schutt auf den Platten aus. Stellen Sie zwei Größenparameter dazu, die Größen für den individuellen Würmer decken in einer Vielzahl von Körperhaltungen mit der Maßnahme zu tun> Wählen Messungen Menüpunkt im Dialogfeld Count / Größe angezeigt werden. (Bereich Bereich: 28,000-120,000 um 2 und Perimeter Bereich: 600-2,500 um).
- Wenn ein Mutantenstamm ist wesentlich kleiner oder größer als andere Tiere auf dem Teller zu analysieren, erweitern den Bereich der Filtereinstellungen für die Objekterkennung, um die verschiedenen Größen der Stämme, bevor die Verfolgung von Tieren unterzubringen, so dass Einstellungen nicht geändert werden müssen Mitte der Analyse.
- Füllen Sie das Tracking-Prozess, indem Sie auf Weiter im Dialogfeld Verfolgung. Visuell vergleichen die Ausgangsspuren mit dem Fortschritt der einzelnen Wurm in dem Film, um zu gewährleisten, dass jeder Wurm vertreten ist, es sei denn es gibt einen triftigen Grund, basierend auf den automatischen Filtereinstellungen, um sie auszuschließen. Spuren, die durch die Anwesenheit von nicht-bestätigten Schnecken Objekte, die die Größe Filterkriterien erfüllt hergestellt wurden manuell zu löschen.
- Verwenden Sie die Software, um die Geschwindigkeit eines jeden Wurm zwischen den einzelnen Bildern berechnen (zurückgelegte Strecke für den Schwerpunkt eines Objekts pro 1 Sekunde zwischen den Rahmen) und zeigt die Durchschnittsgeschwindigkeit für jede Spur und die Durchschnittsgeschwindigkeit über alle Spuren für die Bevölkerung von Würmern in der Kupferring. Betrachten Sie diese endgültige Durchschnitt n = 1 in Bezug auf die experimentellen Studien sein. Exportieren Sie die Daten in ein Tabellenkalkulationsprogramm für statistische Auswertungen und Datenarchivierung.
- Nachdem die Daten für das erste Ring auf der Platte aufgezeichnet wurden, bewegen Sie den ROI auf die nächste Ring undwiederholen Sie den Tracking-Prozess, ohne Änderung der Parameter.
- Berechnen Sie die relative Geschwindigkeit der Fortbewegung durch:
- Relativgeschwindigkeit (%) = behandelt (400 mM) Geschwindigkeit / unbehandelt (0 mM) Geschwindigkeit x 100.
HINWEIS: Verschiedene genetische Manipulationen verändern oft die basale Fortbewegungsgeschwindigkeit der Tiere. Um die Wirkung von Ethanol auf die Fortbewegungsgeschwindigkeit von Tieren zu bestimmen und in der Lage, diese Effekte in verschiedenen Genotypen oder Bedingungen zu vergleichen, die Berechnung einer Relativgeschwindigkeit.
- Einmal erfasst, analysiert die Filme mit Hilfe von Image-Pro Plus-Software oder den Gegenwert.
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Representative Results
Repräsentative Daten (Figur 1) aus mehreren verschiedenen Genotypen und ihrer gepaarten Bedienelemente vorgestellt 8,24; Daten wurden speziell ausgewählt, dass Highlight Unterschiede in den untersuch Tiere. Der Grad der Wirkung bei 10 Minuten der Exposition wird als die anfängliche Empfindlichkeit einer Dehnung, die auf der linken Achse in 1B-G dargestellt ist. Mutanten-Stämme mit einer Relativgeschwindigkeit größer als die Kontrolle bei 10 min werden als Ethanol beständig (1F, G), während Mutantenstämme mit einer relativen Geschwindigkeit, die geringer als die Kontrolle betrachtet empfindlich auf Ethanol zu sein (Figur 1D ist, E). Die richtigen Achsen in Abbildung 1 zeigen den Grad der Erholung der Geschwindigkeit zwischen den 10- und 30-Minuten-Zeiträume. Diese stellt ein Maß für die Geschwindigkeit der Entwicklung von akuter Funktionstoleranz (AFT) und wird als die Relativgeschwindigkeit auf 10 min aus der relativen spe abgezogen werdened bei 30 min. Stämme mit größeren Wiederbeschaffungswerte werden als eine schnellere Geschwindigkeit der Entwicklung von AFT, verglichen mit Kontrolltieren (1D, F) und Stämme mit niedrigeren Wiederbeschaffungswerte als die Kontrolltiere werden als niedrigere Entwicklung der AFT haben müssen (1C , E). Beachten Sie, dass die gemessene AFT für SBP1 (ep79) (1G) in Richtung einer negativen Erholung Trend war jedoch statistisch nicht von Wildtyp aufgrund der großen Varianz (p = 0,08 für den Vergleich mit N2 Verwertung). Wanne-1 kodiert für ein TUBBY Homolog ; BBS-1 codiert ein Homolog der menschlichen BBS1; Lippen-7 codiert ein Triacylglycerol-Lipase; fat-1 kodiert, ein Omega-3-Fettsäure-Desaturase-Acyl; FAT3 einen Delta-6-Fettsäure-Desaturase kodiert; sbp-1 codiert ein Homolog Menschen Sterol Regulatory Element bindende Proteine (SREBPs).
Es gibt mehrere wichtige Merkmale derDaten zu beachten: Erstens, die N2 (Wildtyp) Steuerdaten unterscheidet sich in Experimenten; Dies ist aufgrund von Umweltfaktoren, die schwierig zu steuern sind, wie beispielsweise absolute Wassergehalt oder der Salzkonzentration der getrockneten Medien und Temperatur im Labor wahrscheinlich. Typischerweise drückt 400 mM exogener Ethanol die Drehzahl N2 auf ca. 30% der unbehandelten Kontrollen; aber der absolute Grad der Depression variiert von Versuch zu Versuch. Ferner kann, während ca. 12% Rückgewinnung der Bewegungsgeschwindigkeit über 30 Minuten in N2 ist in der Regel erwartet, auch hier die Zahlen variieren. Wichtig ist, dass, während die absolute Empfindlichkeitsstufen und AFT Ausstellung von Tag zu Tag, Variation, die Vergleiche zwischen den Genotypen oder Bedingungen in der Regel nicht unterscheiden. Das heißt, dass Wildtyp- und eine Mutante immer ähnliche Wirkungen relativ zueinander; wenn eine Mutante bewirkt eine Verringerung der AFT relativ zum Wildtyp, wird dieser Rückgang mit der Menge der AFT von Wildtyp nachgewiesen skalieren. Diese Highlightsdie Bedeutung von leistungs gepaart Kontrollen auf den gleichen Platten gleichzeitig für Stämme oder Bedingungen, die verglichen werden.
Zweitens sind die Phänotypen der Anfangsempfindlichkeit und AFT genetisch trennbar. Beachten Sie, dass Anfangsempfindlichkeit und akute Funktionstoleranz können zusammen oder getrennt zu variieren; Beispiele wurden aus einer Vielzahl von Phänotypen in dem Anfangsempfindlichkeit und AFT unterscheiden unabhängig aufgenommen. Eine Veränderung in einer der Phänotypen nicht sagen eine Änderung in der anderen Phänotyp, auch nicht die Richtung der Änderung des zweiten Phänotyp vorher (entweder erhöht oder verringert als Reaktion auf Ethanol).
Abbildung 1. Ausgangsethanolsensitivität und die Rate der Entwicklung eines akuten Funktionstoleranz (AFT) trennbar sind Verhaltensreaktionen. (A) Übersichtstabelle für dieRichtung Wirkungen von Mutationen in der genannten Gene auf der Ebene der ursprünglichen Empfindlichkeit gegenüber Ethanol und die Geschwindigkeit der Entwicklung des AFT, beide sind im Vergleich zu den Wildtyp-Kontrollen (N2 jeweils). (B-G) Akute Bewegungsantworten bis 400 mM exogene Ethanol bei 10-12 min und 30 bis 32 min Dauer Ethanol Exposition gemessen. Relative Geschwindigkeiten (% der unbehandelten Geschwindigkeit) sind auf der linken Achse dargestellt. Der Grad der Wiederherstellung der Geschwindigkeit werden auf den rechten Achsen dargestellt sind und ein Maß für die Geschwindigkeit des AFT während dieser 20-Minuten-Intervall. Die Zahl der Versuche im Vergleich ist wie folgt: B, C, E: n = 6; G: n = 7; D: n = 9; F: n = 11 Statistisch signifikante Vergleiche (gepaarten t-Tests) werden angezeigt: *, p <0,05; ** P <0,01. 8,24 Die in dieser Figur von 8,24 modifizierten dargestellten Daten. Pmieten klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die einfache Neurobiologie und genetische Werkzeuge zur Verfügung, in C. elegans machen die Schnecke ein ausgezeichnetes Modell, in dem die molekularen Grundlagen der Auswirkungen von Ethanol auf Eigenschaften zu untersuchen. Hier beschreiben wir einen Assay, der verwendet wurde, um mehrere molekulare und Umweltmediatoren der akuten Verhaltensreaktion zu Ethanol 8,10,20,24,25 identifizieren. Diese Methode erlaubt die Differenzierung und der gleichzeitigen Prüfung von zwei verschiedenen Ethanol Ansprechverhalten Phänotypen Anfangsempfindlichkeit und der Entwicklung von akuter Funktionstoleranz, die zusammen das zusammengesetzte Modell Phänotyp der Reaktionsgrad in Säugetieren. Der gleiche Assay kann leicht angepasst werden, um andere pharmakologische Mittel studieren, wodurch der Vorteil der gleichzeitigen Prüfung mehrerer Stämme in der Bewertung der Wirkungen auf das Verhalten von anderen Arzneimitteln.
Die 10 bis 12 min Zeitfenster bietet eine nützliche Zeitpunkt Anfangsempfindlichkeit eines Stammes an et messenHanol. Analyse der Wirkung von 400 mM Ethanol über die ersten 10 min der Exposition zeigt Geschwindigkeitseffekte beginnend in der zweiten Minute der Exposition jedoch einen stationären Zustand der Effekt nicht bis zum siebten Minute der Ethanolexposition 20 erreicht. Durch diese zeitabhängige Wirkung auf die Fortbewegungsgeschwindigkeit, wird die Reihenfolge, in der jeweiligen Stämme werden auf die Platte gelegt wichtig für jegliche Geschwindigkeitsmessung vor der achten oder neunten Minute (vorausgesetzt, es dauert weniger als 2 Minuten, um alle Würmer setzen auf den Ethanol Platte). Bei diesen früheren Zeitpunkten einige Würmer mehr durch Ethanol betroffenen einfach, weil sie auf die Platte bereits in Verkehr gebracht wurden sein. Obwohl eine stabile anfängliche Wirkung von Ethanol durch den siebten Minute erreicht wird, ist es empfehlenswert, dass die Reihenfolge, in der Stämme auf Platten platziert über replicate Versuchen variiert werden, um jede systematische Wirkung über Stämme minimiert wird aufgrund dieses zeitabhängige Wirkung von Ethanol und die Zeit für die Würmer zu der Plattform zu bewegene.
Spezifische Parameter wurden in den Objektverfolgung Schritte zum Vorspannen von Würmern, die immer wieder kollidieren mit dem Kupferring oder mit anderen Würmern minimieren gewählt. Die Objektgröße Filterschritt soll ein beliebiges Objekt aus Tracking, die größer als ein einzelnes Wurm ist, darunter zwei berührende Würmern zu beseitigen. Wenn ein Wurm einen anderen Wurm oder den Kupferring berührt, dann wird der Titel zu Ende, und es sollte nicht mehr als ein gültiges Objekt erkannt werden, während es in Kontakt bleibt. Wenn der Schnecken Kontakt mit dem anderen Objekt verliert, wird es ein neues Objekt und initiiert einen neuen Weg. Wenn die Spur von einer Schnecke gebildet ist, weniger als 20 Sekunden lang, dann wird sie automatisch durch eine minimale Spurweite von 21 Frames definiert, ausgeschlossen. Dieser Filter verhindert, dass Instanzen von einem Wurm voran in ein anderes Objekt (Wurm oder Ring), Rückwärtsfahren und dann für die Zukunft, um das Objekt wieder zu berühren, so kurz Anfälle von schnellen Umkehrungen vorspannen die Gesamtdurchschnittsgeschwindigkeit der Bevölkerung von Tieren. Mit diesen Einstellungen it ist möglich und nicht für eine einzelne Schnecke mehr als eine Strecke, die größer als 20 sec lang (aber weniger als 99 s), um dem Gesamtdurchschnitt ist bei. Die Einstellungen können geändert werden, so dass jeder Wurm trägt nur eine einzige Spur, indem sie die Mindestspurlänge 61 sec (von insgesamt 120 sec), aber empirische Beobachtung, dass dieses beseitigt eine bedeutende Anzahl von Spuren, und es wurde festgestellt, dass langsamer Würmer, die mit anderen Würmern kollidierte seltener wäre überrepräsentiert. Alternativ könnten neue Tracks nicht mehr gestattet ist, um nach dem ersten Bild des Films zu beginnen, aber dann Würmer, die früh in der 2-min-Zeitraum werden aus der Analyse entfernt und Nutzdaten verloren gehen würde kollidieren. Schließlich ist die Verwendung von 10 Würmer pro Kupferring stellt einen guten Kompromiss zwischen den mit mehreren repräsentativen Titel trägt zu einer mittleren und das Problem der zu viele Schnecken Kollisionen.
Dieser Verhaltenstest hat mehrere wichtigeVorteile für die Untersuchung von Ethanol Antwortverhalten in Würmer. Gleichzeitige Prüfung von mehreren Genotypen auf der gleichen Platte ist möglich durch den Einsatz von Kupfer "Korallen." Diese Innovation hat mehrere entscheidende Vorteile. Zuerst wird in diesem Assay wird die Steuerbedingung oder Dehnung wird immer auf der gleichen Platte mit der gleichen Zeit wie das Versuchsbedingung oder Dehnung, und nur Tiere gleichzeitig getestet werden direkt Vergleich getestet. Dies ist von besonderer Bedeutung, weil Verhaltenstests werden häufig durch die Umgebung beeinflusst, und von Tag zu Tag Variation Verhaltensreaktionen kann das Rauschen in dem Assay zu erhöhen und die Fähigkeit, Signale zu erfassen. Die Seite-an-Seite-Vergleich der Versuchsgruppen in identischen Bedingungen wesentlich verringert die Auswirkungen von Tag-zu-Tag Umgebungsschwankungen, was ein Hauptvorteil dieses Ansatzes ist. Zweitens ist die Verwendung von Kupfer corrals enthält Tieren in dem Sichtfeld, das die Fortbewegung Assays in der ein durchgeführt werden könnenbsence von Lebensmitteln. Wenn die Nahrung entzogen, bewegen Würmer schnell und sind in der Regel auf der Suche nach Bakterien zu zerstreuen; ohne die Ringe, würde Würmer das Sichtfeld während des Verlaufs des Assays zu verlassen. Darüber hinaus werden die Würmer durch Kupfer abgestoßen und neigen dazu, näher an der Mitte der Ringe zu bleiben, so dass sie leicht zu visualisieren. Die Tatsache, dass die Würmer schnell bewegen in diesen Testbedingungen wesentlich erhöht die Auflösung um depressive Wirkung von Ethanol zu detektieren; wenn Würmer bewegen sich langsam, erreichen die Geschwindigkeiten den Boden der Fähigkeit, sie früher zu erkennen. Man beachte, dass Kupfer toxisch für die Würmer; während die Ringe nicht erscheinen, um die akuten Reaktionen beeinflussen, um in diesem Protokoll getestet Ethanol, verlängerte Inkubationszeit von Tieren in den Ringen (über mehrere Stunden) wird nicht empfohlen. Dritte, mit dieser Versuchsanordnung ein einziges Assay kann die Verhaltensreaktionen von bis zu vier verschiedenen Versuchsgruppen zu beurteilen. Deshalb ist die Zeit zu akkumulieren statistisch aussagekräftige Daten verringert wird entnommen. In additiauf, da ein einzelner digitaler Film gemacht wird, verringert sich dieser Speicherplatzbedarf für die Langzeitlagerung von Primärdaten. Schließlich werden in jedem Versuch, das Verhalten der 10 einzelnen Tiere jeder Testgruppe untersucht. Die Geschwindigkeiten dieser 10 Personen werden gemittelt, um einen zusammengesetzten Geschwindigkeit für einen einzelnen Assay zu erzeugen, so daß n = 1-Studie. Diese Mittelwertbildung des Verhaltens vieler Tiere verringert weiter die Variabilität in diesen empfindlichen verhaltens Assays und erhöht weiter die Auflösung auf subtile Effekte Ethanol Antwortverhalten zu erfassen.
Gibt es Einschränkungen bei der hier beschriebenen Verfahren, von denen einige auf Verhaltensanalysen dieser mutierten Tieren. Eine erhebliche Einschränkung dieses Ansatzes ist, dass mutierte Würmer, die sehr deutlich reduzierte basale Geschwindigkeiten aufgrund incoordination oder nahe Lähmung als falsch positiv für Resistenz gegen die Wirkungen von Ethanol identifiziert werden, weil ihre gemessenen Geschwindigkeit auf einen Wert th abnimmtbei unter dem Schwellwert der genaue Erfassung für eine bestimmte Bilddarstellungsaufbau. Da die meisten Objekt-Tracking-Software-Programme verwenden einen Schwerpunkt (Zentrum der Masse) wie die Position, von der die Messung Abstand zwischen Frames reiste, kann eine stationäre Wurm, der seinen Kopf bewegt sich immer noch erzeugen eine Verschiebung der Position des Schwerpunkts und die Verschiebung festgestellt werden würde als Bewegung. Daher muss ein Wurm zu bewegen schneller als durch subtile Veränderungen in der Körperhaltung, um als echte Fortbewegung zu messen verursacht. Worms Ethanol ausgesetzt sind nicht gelähmt, aber sie sind sehr unkoordiniert, so mit Würmern, die bereits über ein Defizit in der Fortbewegung ist es möglich, dass Ethanol Exposition werden ihre Geschwindigkeiten unterhalb dieser technischen Bodeneffekt zu verringern. Erhöhung der Zeit zwischen den Rahmen, so dass größere Änderungen in der Körperstellung wäre trennbar von feinen Verschiebungen in Schwerpunktposition kann dieses Problem nicht lösen, wenn die Zeit zwischen den Rahmen verlängert ist wesentlich länger als 1 Sekunde wird es für o schwierigerbject Verfolgungssoftware, um sicherzustellen, dass dieselbe Schnecke auf eine Spur anstelle einer Spurspringen zwischen Nähe, aber nicht berühren Würmer beiträgt.
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Acknowledgments
R01AA016837 (JCB) und P20AA017828 (AGD und JCB): Diese Studien wurden durch Zuschüsse aus den National Institutes of Health, Nationales Institut für Alkoholmissbrauch unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| 60 x 15 mm Petri plates, triple vented | Greiner Bio-One | 628161 | Other plate brands will suffice. |
| NGM agar | Various | NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O | |
| Forceps | Various | e.g., Fisher Scientific #10300 | |
| 37 °C Incubator | Various | For drying agar | |
| Digital balance | Various | For determining plate weights and agar volume | |
| Copper rings | Plumbmaster | STK#35583 (48 cap thread gasket) | 1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings |
| 100% ethanol | Various | ||
| Parafilm M | Bemis | PM996 | |
| CCD camera | QImaging | RET-4000R-F-M-12 | This camera has a large field of view. |
| Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective | Leica | MZ6 | Discontinued model, M60 is current equivalent. |
| Light source | Schott | A08923 | 3”x3” backlight for even illumination across the field of view |
| Imaging and tracking software | Media Cybernetics | ImagePro-Plus v6.0-6.3 | Newer versions of the software have tracking functions. |
References
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