Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Анализ по измерению влияния этанола на локомоции Скорость Published: April 9, 2015 doi: 10.3791/52681

Protocol

1. Шаги, чтобы выступить на День перед анализом

  1. Выберите L4 стадии червей в свежую среду роста нематода (NGM) пластинки засевают газон OP50 Е. палочка, и культура их в 20 CO / N. Каждое условие анализ требует 10 червей; выбрать избыток червей для обеспечения O / N потери червей.
    1. Только анализов животных, которые первого дня взрослые; многие мутанты растут на более низкой скорости, чем дикого типа. Настройка времени собирания для штаммов, которые имеют задержки в развитии, так что все подопытных животных, в первую дня взрослые.

2. Этапы выступить на день исследования

  1. Получение для анализа:
    1. Выполните анализы на стандартных раздающих 60 х 15 мм NGM пластин. Сушат все из пластин, которые будут использоваться при 37 ° С в течение 2 ч, с крышками выходных. Для каждой экспериментальной суда, используйте четыре сушеных NGM пластин; Они будут 0 мм и 400 мм этанол Планшеты и их сопровождающих акклимационный пластин.
      ПРИМЕЧАНИЕ:Использование NGM пластин Здесь важно; Различия в составе пластин, в частности, их осмолярности, может сильно повлиять на реакцию дозы этанола на поведение, это связано, по меньшей мере частично, на изменения в количестве этанола, накопленных животных 20. NGM агар 160 мОсм.
    2. После сушки, взвешивают каждый из Unseeded NGM пластин, которые будут использоваться в анализе и вес. Определить объем информации в пластинах на основе веса пустой тарелкой. Для аппроксимации преобразование массы к объему агар, предположим, что носитель весит такой же, как в равном объеме воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наши самые последовательные результаты были получены с NGM среды, что обезвоженных достаточно, что оригинальный 10 мл объема имеет объем после сушки между 8.3-8.9 мл. Альтернативой 2 ч сухое время, чтобы высохнуть, пока пластины не достигнут этот диапазон громкости для учета различий в инкубаторах.
    3. 4 расплава меди кольца (внутренний диаметр 1.6 см) на поверхность каждой из пластин в качестве загонов для различных генотипов или лечения групп worms.Grasp каждое кольцо пинцетом и тепла в пламени (сильный пламени из горелки Бунзена работает хорошо) в течение приблизительно 3 сек. Сразу положите кольцо на тарелку, продолжая удерживать кольцо с пинцета, чтобы предотвратить его от "пропуск".
      1. Убедитесь, что кольцо прилегает к поверхности агара, нажав осторожно пинцетом в нескольких точках по кольцу. При размещении кольцо, будьте осторожны, чтобы оставить место для еще трех колец.
      2. Melt три дополнительные медные кольца в поверхность пластины, заботясь, чтобы разместить их ближе друг к другу, насколько это возможно, так что все четыре будет в поле зрения камеры.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Создание хорошее уплотнение, агар необходимо держать червей в кольцах во время теста. Кольца, пропустить вокруг на плите вряд ли сделают правильный печать, агар иможет шрам агар, который позволяет черви зарываются и препятствует визуализации червей.
      3. Для каждого планшета для анализа подготовить сопроводительную "акклиматизации" пластинку, которая должна быть сухой и без раздающих и не будет получать этанол. Поместите четыре медные кольца на этих пластинах.
    4. Добавьте в нижней части пластины рядом с каждым кольцом с червячной штамма, который будет использоваться в кольце, заботясь, чтобы не записать в поле зрения самого кольца. Матч этикетки на планшете для анализа с сопровождающей ее акклиматизации пластины.
    5. Рассчитать количество 100% -ного этанола, чтобы добавить к каждой аналитической пластине таким образом, что конечная концентрация составляет 0 мм или 400 мМ этанола (вес к объему). Для каждого эксперимента (N = 1), то будет один 0 мм и один 400 мМ этанола пластины; Акклиматизация пластины не получить этанол. Добавить этанола, пипеткой его по поверхности пластины. Используйте лабораторной пленкой, чтобы запечатать пластины и дайте ему равновесие на станке в течение 2 ч.
    6. При 1,5 ч истечет, начать акклиматизации стадию анализа, шаг 2,2.
  2. Выполните локомоции анализа: Планшеты
    1. Тщательно передачи 10 червей из каждой экспериментальной группы в центре медного кольца на акклиматизации пластины. Удалить любую пищу, которая видна на агар в этой точке, очищая осторожно червя выбор. Измените порядок, в котором экспериментальные группы положить на тарелки по всей экспериментальных исследований, так что те же черты не ставятся на пластинах в том же порядке через судебных разбирательств.
      ПРИМЕЧАНИЕ: цель заключается в передаче животных в тарелку с минимальными количествами пищи, потому что, если еда на акклиматизации пластины передается на планшет для анализа черви скапливаются вокруг пищи, и эффект препарата на передвижения будут скрыты.
    2. Будьте осторожны, чтобы не сломать поверхность агара с киркой, так как это позволит черви зарываются и будет нарушать анализа. Инкубируйте червей при комнатной температуре в течение 30 мин.
    3. Убедитесь, что есть соответствующий интервал между посвящений каждой пластины. Опытный экспериментатор может двигаться 40 животных, 10 / кольцо для 4 колец в <1,5 мин, но любой интервал до 2 мин является приемлемым. Стандартный метод имеет Видеозапись на 10-12 мин и 30-32 мин экспозиции в 0 мм до 400 мм этанола.
    4. Инициировать акклиматизации пластину для воздействия 0 мм, а акклиматизации пластину для воздействия 400 мМ примерно 2 мин и 30 сек друг от друга, чтобы позволить для сохранения первого файла кинофильма до второй ролик должен начать.
    5. После 30-минутного периода акклиматизации, передавать червей из пластин акклиматизации планшеты для анализа. Передача червей планшеты для анализа (0 мм или 400 мМ этанола) в том же порядке, что они были добавлены в акклиматизации пластины, отслеживание сроков между пополнений каждого планшета. Печать пластину лабораторной пленкой, чтобы свести к минимуму потери этанола испарения.
    6. Uсе движение черпая с тонким краем плоской червь забрать сбора червей в верхней части сплющенного выбор. Выполните передачу червей из без затравки акклиматизации пластины для планшета для анализа без использования бактерий, которые обычно используются в передаче червей, поскольку это помогает склеить червя на выбор.
      Примечание: Скорость, с которой животные передаются на этом этапе очень важно, потому что первые черви на пластине будет подвергаться воздействию этанола больше, чем последние червей, добавленных к пластине, и более ранние моменты времени может показать некоторые зависящие от времени воздействия. Это главная причина, вращающихся, какие штаммы помещаются на тарелку сначала по экспериментальным повторов.
  3. Выполните опорно-двигательного Пробирной: Съемки
    1. Используйте комбинацию микроскоп / камеры, что позволяет для одновременной визуализации всех четырех колец в поле зрения (примерно 42x42 мм 2 площади), таких как 0.5x объектива микроскопа, увеличением 0,8x и камерой с 2048x2048 7,481; м МП ПЗС.
    2. Используйте равномерное освещение по всему полю зрения, которая помогает в признании объекта в пороговой интенсивности стадии (см. Ниже) 3 "x3" подсветка работает хорошо.
    3. Изображение черви на пластину, расположенную СМИ стороной вверх (вниз крышку), который генерирует контраст, который теряется при использовании подсветки по сравнению с традиционным микроскопом, передаваемой источником света.
    4. Подготовка программного обеспечения для анализа изображений, чтобы захватить покадровой фильмы движущихся червей. Установите программное обеспечение для захвата 12-битных изображений в оттенках серого раз в 1 сек, а 2-мин (120 кадров) видео. Чтобы уменьшить размер выходного файла, в то время как все еще сохраняя достаточное разрешение изображения, используйте режим биннинга 2x2 захватить 1024х1024 пикселей изображения.
    5. Запишите фильмы. Начало записи 120-кадра фильм о первой пластины (0 мМ этанола) 10 мин после последнего червей помещают на этой пластине. Сохранить файл фильма.
    6. Запись второй пластины (400 мМ этанола). Повторите этот процесс дляобе пластины начинают через 30 минут после последнего червей помещают на первой пластине (0 мм этанол), чтобы захватить 30-32 минутные перерывы баллов за каждый экспозиции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте достаточное время, чтобы сохранить файлы изображений после каждой сессии захвата перед началом записи следующего пластины должны быть проанализированы.
    7. Для перспективность архивных фильмов и чтобы эти фильмы должны быть открыты и проанализированы с помощью других программ для обработки изображений в общественном достоянии с открытым исходным кодом, таких как ImageJ 28, конвертировать копию каждого фильма в 8-битный 256 оттенков серого TIFF файлов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: программное обеспечение для анализа изображений описаны здесь использует собственный формат файлов.
  4. Анализ фильмов с помощью программного обеспечения ImagePro.
    1. После того, как в плен, анализировать видео с помощью Image-Pro Plus программного обеспечения или его эквивалент.
      ПРИМЕЧАНИЕ: разнообразию других программ слежения объект доступен, который был использован, чтобы успешно отслеживать несколько C. Элеганс в свое время 29 и такиеПрограммное обеспечение было бы разумно заменить, как описано здесь, как шаги идентификации объекта основаны на схожих принципах. Метод, описанный относится к изображению-Pro Plus версии программного обеспечения 6.0-6.3 и 7.0 новых версий Имидж-Pro Plus программного обеспечения может иметь незначительные отличия.
    2. Анализ фильмов в 2-мин (120 кадров) сегментов. Во-первых, применить фильтр к изображениям, чтобы сгладить фон и повысить контрастность объектов червей. Выберите фильтр следующим образом: Меню> Процесс> Фильтры> Души> Flatten: Параметры: Фон = Dark; Функция Ширина = 20 пикс.
    3. Re сохранение фильмы после стадии фильтрации, но всегда сохраняют оригинальный фильм в его нефильтрованного форме.
      1. Анализ передвижение животных в каждом кольце отдельно с круговой области интереса (ROI), что находится и размеры пересекаться с медным кольцом. Идентифицировать и отслеживать червей в меню> Меры> отслеживать объекты ... команду; Это поднимает отслеживания Dата столиком у окна. Кнопка Параметры отслеживания позволяет отдельные треки должны быть исключены, а также ограничить любые экспериментальные артефакты.
    4. На вкладке Auto Tracking, используйте следующие параметры: параметры трека: предел скорости (радиус поиска) = 400 мкм / кадр, ускорение предел = Auto, Минимальная общая длина трека = 400 мкм, преобладающих движения типа = хаотично; Объекты в параметрах трека: Разрешить частичные медиа = Да, минимальная длина = 21 кадров, отслеживание глубины прогнозирования = 1 кадр.
    5. Чтобы начать процесс отслеживания, нажмите Найти все дорожки автоматически функциональную кнопку, чтобы открыть диалоговое окно Count / вариантов размера и диалоговое окно слежения. Выберите параметр Вручную для выбора интенсивности диапазона в диалоговом окне Граф / размер, который обеспечивает важный рубеж шаг, который использует интенсивность, черно-белое червя пикселей выделить объект червя для анализа и игнорировать светлом фоне пикселей.
      1. Отрегулируйте порог интенсивности SLIDers (от одного до установить верхний предел, один, чтобы установить нижний предел), чтобы создать инклюзивное диапазон, который выдвигает на первый план все темные объекты. Диапазон 0-1,500 по шкале от 0-4,095 является хорошей отправной точкой для более точной настройки.
      2. Применение размер фильтр, чтобы исключить объекты, которые больше и меньше, чем одного объекта червя, такие как медным кольцом и любого мусора на пластинах. Установите два параметры размера, чтобы сделать это, которые охватывают размеры для отдельных червей в различных позах с мерой> Выберите Измерения пункт меню в диалоговом окне Параметры Граф / размер. (Диапазон Площадь: 28,000-120,000 мкм 2 и по периметру диапазон: 600-2,500 мкм).
      3. Если мутантный штамм значительно меньше или больше, чем другие животные на тарелке должны быть проанализированы, расширить диапазон параметров фильтра для распознавания объектов для размещения различных размеров штаммов, прежде чем отслеживания животных так, что настройки не должны быть изменены в середине-анализ.
      </ Li>
    6. Завершить процесс отслеживания, нажав Продолжить в диалоговом окне слежения. Визуально сравнить выходные треки с прогрессом каждого червя в кино, чтобы гарантировать, что каждый червь представлена, если нет веских оснований для исключения его на основе автоматических настроек фильтра. Удаление треков, которые были произведены в присутствии подтвержденных объектов без червей, которые отвечают критериям размера фильтра вручную.
    7. Используйте программное обеспечение для расчета скорости каждого червя между кадрами (расстояние для центра тяжести объекта за 1 сек между кадрами) и отображать среднюю скорость для каждого трека и среднюю скорость на всех треках для населения червей в медное кольцо. Считайте, что это окончательное среднем равна п = 1 с точки зрения экспериментальных исследований. Экспортировать данные в программу электронных таблиц для статистического анализа и архивирования данных.
    8. После того как данные были записаны в первое кольцо на пластине, переместить ROI к следующему кольцу иповторите процесс отслеживания, без изменения каких-либо параметров.
    9. Рассчитать относительную скорость передвижения через:
    10. Относительная частота вращения (%) = обрабатывали (400 мМ) Скорость / необработанной (0 мм) Скорость х 100.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Различные генетические манипуляции часто изменять базальную скорость локомоции животных. Для того чтобы определить влияние этанола на скорость локомоции животных и иметь возможность сравнивать эти эффекты через различных генотипов или условий, расчета относительной скорости.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Представительства данные (Рисунок 1) из нескольких разных генотипов и их парных контрольных представлены 8,24; Данные были специально выбраны, что различия событием в анализируемых животных. Степень влияния на 10 мин воздействия считается исходной чувствительности штамма, который показан на левой оси на рисунке 1b-G. Мутантные штаммы с относительной скоростью большей, чем в контроле на 10 мин, как полагают, этанол устойчивы (рис 1F, G), в то время как мутантные штаммы с относительной скоростью, которая меньше, чем в контроле, как полагают, с повышенной чувствительностью к этанола (фиг 1D, Е). Правильные оси на рисунке 1 показывает степень восстановления скорости между периодами в 10 и 30-минутных периодов. Это представляет собой меру скорости развития острой функциональной толерантности (AFT), и рассчитывается как относительной скорости в 10 мин вычитается из относительной SPEред в 30 мин. Штаммы с большими значениями восстановления как считается, имеют более высокие темпы развития АФТ по сравнению с контрольными животными (Рисунок 1г, е) и штаммов с более низкими значениями восстановления, чем у контрольных животных как считается, имеют более низкие темпы развития AFT (рис 1С Е). Обратите внимание, что измеряется AFT для SBP1 (ep79) (рис 1G) имеет тенденцию к отрицательной восстановления, но статистически не отличался от дикого типа из-за большого дисперсии = 0,08 для сравнения с восстановления N2). Ванна-1 кодирует пару лишних кило гомолог ; BBS-1 кодирует гомолог человеческой BBS1; губы-7 кодирует триацилглицерина липазы; жира 1 кодирует омега-3 жирных ацильных десатуразы; жира 3 кодирует дельта-десатуразы 6 жирных кислот; SBP-1 кодирует гомолог, чтобы человек Стирол регуляторный элемент связывающих белков (SREBPs).

Есть несколько важных характеристикДанные отметить: во-первых, N2 (дикого типа) данных управления различается по экспериментах; это, вероятно, из-за экологических факторов, которые трудно контролировать, например, абсолютное содержание воды или концентрации соли в сухих сред и температуры в лаборатории. Как правило, 400 мм экзогенного этанола подавляет скорость N2 приблизительно 30% от необработанных контролей; Однако абсолютная степень депрессии варьируется от эксперимента к эксперименту. Кроме того, в то время как около 12% восстановление скорости локомоции в течение 30 мин в N2 обычно ожидается, и здесь число варьироваться. Важно отметить, что в то время как абсолютные уровни чувствительности и кормовой выставочная изо дня в день изменения, сравнения между генотипов или условий обычно не отличаются. То есть, дикого типа и мутанта всегда будет иметь подобные эффекты по отношению друг к другу; Если мутант вызывает уменьшение AFT относительно дикого типа, что снижение будет масштабироваться с количеством AFT продемонстрировано дикого типа. Это подчеркиваетВажность выполнения паре управления на тех же пластин, в то же время для штаммов или условий, которые в настоящее время по сравнению.

Во-вторых, фенотипы исходной чувствительности и кормовой генетически разделяются. Обратите внимание, что первоначальный чувствительность и острая функциональная толерантность может изменяться вместе или по отдельности; примеры были включены из множества фенотипов, в котором начальное чувствительности и кормовой отличаются независимо. Изменение в одном из фенотипов не предсказывает изменение в другой фенотип, а также не предсказать направление изменения второго фенотипа (либо увеличивается или уменьшается в ответ на этанол).

Фигура 1
Рисунок 1. Начальная чувствительность этанол и темпы развития острого функционального допуска (AFT) являются разъемные поведенческие реакции. () Сводная таблицаНаправление воздействия мутаций в названных генов на уровне начальной чувствительности к этанолу и темпов развития AFT, оба в сравнении с контролем дикого типа (N2 в каждом случае). (B-G) Острые ответы передвижение до 400 мм экзогенный этанол, оцениваются по 10-12 мин и 30-32 мин непрерывного воздействия этанола. Относительные скорости (% неочищенных скорости) показаны на левой оси. Степени восстановления скорости показаны на правой оси и представляют собой меру скорости AFT течение этого интервала 20-мин. Число испытаний по сравнению состоит в следующем: В, С, Е: Н = 6; G: N = 7; D: N = 9; F: N = 11. Статистически значимые сравнения (парные т-тесты) показаны: * р <0,05; ** Р <0,01. 8,24 Данные, представленные на этом рисунке являются модификациями 8,24. Pаренда нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Просто нейробиологии и генетические инструменты доступны в С. Элеганс сделать червь отличная модель, в которой для изучения молекулярных основ воздействия этанола на поведение. Здесь мы опишем анализ, который был использован для идентификации нескольких молекулярных и экологических медиаторов острой поведенческой реакции на этанол 8,10,20,24,25. Этот метод позволяет дифференцировать и одновременное рассмотрение двух различных ответных этанола поведения фенотипов, начальной чувствительности и развитие острой функциональной толерантности, которые вместе модели композитного фенотип уровне ответ у млекопитающих. Же анализ может быть легко адаптирован для изучения других фармакологических средств, тем самым воспользовавшись одновременного тестирования нескольких штаммов в оценке поведенческих эффектов других препаратов.

Временное окно 10-12 мин предоставляет полезный времени для измерения начальной чувствительности штамма к дрhanol. Анализ влияния 400 мм этанола через первые 10 мин экспозиции показывает скорость эффекты, начинающиеся на второй минуте воздействия, но стабильном состоянии эффекта не достигается не до седьмой минуте этанола воздействия 20. В связи с этим, зависящего от времени эффекта на скорость передвижения, порядок, в котором конкретные штаммы размещены на пластинке будет иметь важное значение для любых измерений скорости до восьмого или девятой минуте (при условии, что занимает меньше 2 минут, чтобы поставить все от глистов на этанол пластины). В этих ранних временных точках некоторые черви будут более подвержены этанола просто потому, что они были размещены на пластину ранее. Несмотря на то, стабильный первоначальный эффект этанола достигается седьмой минуте, рекомендуется, что порядок, в котором штаммы помещают на пластинах варьировать по повторных испытаний, чтобы свести к минимуму любые систематический эффект через штаммов вследствие этого нестационарного эффекта этанола и Время, необходимое для перемещения червей в Плате.

Конкретные параметры были выбраны в шагах слежение за объектом, чтобы свести к минимуму смещение от червей, которые неоднократно сталкиваются с медным кольцом или с другими червями. Фильтр Размер шага объект должен устранить любой объект от отслеживания, который больше, чем одного червя, в том числе двух соприкасающихся червей. Если червь коснется другого червя или медное кольцо, то трек заканчивается, и он больше не должен быть признан действительным объектом при его остается в контакте. Когда червь теряет контакт с другим объектом, он становится новым объектом и инициирует новый трек. Если дорожки сделаны червь составляет менее 20 секунд в длину, то она автоматически исключается путем определения минимальной длины дорожки 21 кадров. Этот фильтр предотвращает случаи червя двигаться вперед в другой объект (червь или кольцо), реверс и затем идти вперед, чтобы коснуться этого объекта снова, как короткие приступы быстрых разворотов могут исказить общую среднюю скорость популяции животных. Используя эти параметры, ят можно и обычно для одного червя, чтобы способствовать более одной дорожки, которое больше, чем 20 сек в длине (но меньше, чем 99 сек) в среднем в целом. Параметры могут быть изменены так, что каждый червь только способствует одну дорожку, сделав минимальную длину дорожки 61 сек (из общего числа 120 сек), но эмпирическое наблюдение, что данное устранены значительное количество дорожек, и было обнаружено, что медленнее черви, которые столкнулись с другими черви реже быть более широко представлены. Кроме того, новые трассы может быть запрещена, чтобы начать после того, как первый кадр кинофильма, но тогда червей, которые сталкиваются в начале 2-минутного периода удаляются из анализа и полезные данные будут потеряны. Наконец, использование 10 червей на медным кольцом представляет собой хороший компромисс между наличием множества представительных треков, способствующих среднем и проблемы слишком много столкновений червей.

Такой поведенческий анализ имеет несколько важныхПреимущества для изучения поведения реагирования этанол в червей. Одновременное тестирование нескольких генотипов на той же пластинке можно за счет использования меди "загоны". Это нововведение имеет несколько явных преимуществ. Во-первых, в этом анализе, условие управления или деформации всегда проходят на одной пластине, в то же время, как в экспериментальных условиях или деформации, а только подопытных животных одновременно непосредственно сравнивать. Это имеет особое значение, потому что поведенческие тесты часто под влиянием окружающей среды, и день-в-день изменение поведенческих реакций может привести к увеличению шума в анализе и уменьшить способность обнаруживать сигналы. Бок-о-бок сравнение экспериментальных групп в одинаковых условиях существенно уменьшается влияние изо дня в день окружающей среды вариации, которая является основным преимуществом данного подхода. Во-вторых, использование медных загоны содержит животных в поле зрения, что позволяет локомоции анализы должны быть выполнены в Аbsence пищи. Когда лишали пищи, черви двигаться быстро и, как правило, расходятся в поисках бактерий; без колец, черви покинет поле зрения в ходе анализа. Кроме того, черви отталкиваются меди и имеют тенденцию оставаться ближе к середине колец, что делает их легко визуализировать. Тот факт, что черви быстро перемещаться в этих условиях анализа существенно увеличивает разрешение для обнаружения депрессивные эффекты этанола; когда черви медленно двигаться, скорости достигают этаж способности обнаруживать их раньше. Обратите внимание, что медь является токсичным для червей; в то время как кольца, кажется, не влияют на острые ответы к этанолу анализировали в данном протоколе, расширенный инкубации животных в кольцах (в течение нескольких часов) не рекомендуется. В-третьих, с этим экспериментальным дизайном, одном анализе можно оценить поведенческие реакции до четырех различных экспериментальных групп. Таким образом, время, необходимое для накопления статистически уменьшается смысл данных. В дополнительна, поскольку один цифровой фильм сделан, это уменьшает требования к пространству памяти для долговременного хранения первичных данных. И, наконец, в каждом эксперименте, поведение 10 отдельных животных каждой экспериментальной группы рассматривается. Скорости этих лиц 10 усредняются для создания композитного скорость для одного анализа, так что п = 1 испытание. Это усреднение поведение многих животных дополнительно снижает уязвимость в этих чувствительных поведенческих тестах, и далее увеличивает разрешение, чтобы обнаружить тонкие эффекты на поведение реагирования этанол.

Существуют определенные ограничения на способах, описанных здесь, некоторые из которых применяются к поведенческих анализа любых мутантных животных. Одним из важных ограничение этого подхода заключается в том, что мутантные черви, которые очень значимое снижение базальной скорости, из-за дискоординации или вблизи паралича, могут быть определены как ложно положительный на устойчивость к воздействию этанола, потому что их измеренная скорость уменьшается до значения йна ниже порога точного обнаружения для конкретной установки формирования изображения. Поскольку большинство компьютерных программ слежение за объектом использовать центр тяжести (центр масс) в качестве позиции, с которой для измерения пройденного расстояния между кадрами, стационарные червь, который будет двигать головой все еще может генерировать сдвиг в положении центра тяжести и сдвиг будет обнаружена как движение. Поэтому червь должен быть движется быстрее, чем обусловлена ​​тонких сдвигов в положение тела для того, чтобы измерить, как истинный передвижения. Черви воздействию этанола не парализована, но они очень скоординированы, так и с червями, которые уже имеют дефицит в передвижении вполне возможно, что воздействие этанола будет уменьшаться темпы их скорости ниже этого технического эффекта пола. Увеличение времени между кадрами так, что большие изменения положения тела будет отделить от тонких изменений в симметричного положения не решить эту проблему, если время между кадрами удлиняется более чем на 1 сек она становится все более трудным для Object отслеживания программного обеспечения для того, чтобы то же самое червь вносит свой вклад в треке, а не трек, прыжки между близкими, но не касаясь червей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Эти исследования были поддержаны грантами от Национальных Институтов Здоровья, Национальный институт по проблемам алкоголизма и злоупотребления алкоголем: R01AA016837 (JCB) и P20AA017828 (АГД и JCB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. elegans strains Caenorhabditis Genetics Center
60 x 15 mm Petri plates, triple vented Greiner Bio-One 628161 Other plate brands will suffice.
NGM agar Various NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O
Forceps Various e.g., Fisher Scientific #10300
37 °C Incubator Various For drying agar
Digital balance Various For determining plate weights and agar volume
Copper rings Plumbmaster STK#35583 (48 cap thread gasket) 1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings
100% ethanol Various
Parafilm M Bemis PM996
CCD camera QImaging RET-4000R-F-M-12 This camera has a large field of view.
Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective Leica MZ6 Discontinued model, M60 is current equivalent.
Light source Schott A08923 3”x3”  backlight for even illumination across the field of view
Imaging and tracking software Media Cybernetics ImagePro-Plus v6.0-6.3 Newer versions of the software have tracking functions.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prescott, C. A., Kendler, K. S. Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins. Am. J. Psychiatry. 156, 34-40 (1999).
  2. Schuckit, M. A. Genetics of the risk for alcoholism. Am. J. Addict. Article Review. 9, 103-112 (2000).
  3. Heath, A. C., et al. Genetic differences in alcohol sensitivity and the inheritance of alcoholism risk. Psychol. Med. 29, 1069-1081 (1999).
  4. Rodriguez, L. A., Wilson, J. R., Nagoshi, C. T. Does psychomotor sensitivity to alcohol predict subsequent alcohol use. Alcohol. Clin. Exp. Res. 17, 155-161 (1993).
  5. Schuckit, M. A., Smith, T. L. An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects. Arch. Gen. Psychiatry. 53, 202-210 (1996).
  6. Kalu, N., et al. Heritability of level of response and association with recent drinking history in nonalcohol-dependent drinkers. Alcohol. Clin. Exp. Res. 36, 522-529 (2012).
  7. Davis, S. J., Scott, L. L., Hu, K., Pierce-Shimomura, J. T. Conserved single residue in the BK potassium channel required for activation by alcohol and intoxication in. C. elegans. J. Neurosci. 34, 9562-9573 (2014).
  8. Raabe, R. C., Mathies, L. D., Davies, A. G., Bettinger, J. C. The Omega-3 Fatty Acid Eicosapentaenoic Acid Is Required for Normal Alcohol Response Behaviors in C. elegans. PLoS ONE. 9, e105999 (2014).
  9. Topper, S. M., Aguilar, S. C., Topper, V. Y., Elbel, E., Pierce-Shimomura, J. T. Alcohol disinhibition of behaviors in C. elegans. PLoS ONE. 9, e92965 (2014).
  10. Bhandari, P., et al. Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors Drosophila,Caenorhabditis elegans and mice. Genes Brain Behav. 11, 387-397 (2012).
  11. Davies, A. G., et al. A central role of the BK potassium channel in behavioral responses to ethanol in C. elegans. Cell. 115, 655-666 (2003).
  12. Davies, A. G., Bettinger, J. C., Thiele, T. R., Judy, M. E., McIntire, S. L. Natural variation in the npr-1 gene modifies ethanol responses of wild strains of C. elegans. Neuron. 42, 731-743 (2004).
  13. Kapfhamer, D., et al. Loss of RAB-3/A in Caenorhabditis elegans and the mouse affects behavioral response to ethanol. Genes Brain Behav. 7, 669-676 (2008).
  14. Speca, D. J., et al. Conserved role of unc-79 in ethanol responses in lightweight mutant mice. PLoS Genet. 6, e1001057 (2010).
  15. Thiele, T. E., Badia-Elder, N. E. A role for neuropeptide Y in alcohol intake control: evidence from human and animal research. Physiol. Behav. 79, 95-101 (2003).
  16. Treistman, S. N., Martin, G. E. BK Channels: mediators and models for alcohol tolerance. Trends Neurosci. 32, 629-637 (2009).
  17. Han, S., et al. Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence. Am. J. Hum. Genet. 93, 1027-1034 (2013).
  18. Kendler, K. S., et al. Genomewide association analysis of symptoms of alcohol dependence in the molecular genetics of schizophrenia (MGS2) control sample. Alcohol. Clin. Exp. Res. 35, 963-975 (2011).
  19. Schuckit, M. A., et al. Autosomal linkage analysis for the level of response to alcohol. Alcohol. Clin. Exp. Res. 29, 1976-1982 (2005).
  20. Alaimo, J. T., et al. Ethanol metabolism and osmolarity modify behavioral responses to ethanol in C. elegans. Alcohol. Clin. Exp. Res. 36, 1840-1850 (2012).
  21. Morgan, P. G., Sedensky, M. M. Mutations affecting sensitivity to ethanol in the nematode, Caenorhabditis elegans. Alcohol. Clin. Exp. Res. 19, 1423-1429 (1995).
  22. Mitchell, P. H., et al. The concentration-dependent effects of ethanol on Caenorhabditis elegans behaviour. Pharmacogenomics J. 7, 411-417 (2007).
  23. Vidal-Gadea, A., et al. Caenorhabditis elegans selects distinct crawling and swimming gaits via dopamine and serotonin. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, 17504-17509 (2011).
  24. Bettinger, J. C., Leung, K., Bolling, M. H., Goldsmith, A. D., Davies, A. G. Lipid environment modulates the development of acute tolerance to ethanol in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7, e35129 (2012).
  25. Davies, A. G., et al. Different genes influence toluene- and ethanol-induced locomotor impairment in C. elegans. Drug Alcohol Depend. 122, 47-54 (2012).
  26. Newlin, D., Thomson, J. Alcohol challenge with sons of alcoholics: a critical review and analysis. Psychol. Bull. 108, 383-402 (1990).
  27. Ponomarev, I., Crabbe, J. C. A novel method to assess initial sensitivity and acute functional tolerance to hypnotic effects of ethanol. J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 257-263 (2002).
  28. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  29. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , The C. elegans Research Community. (2012).

Tags

Поведение выпуск 98 этанол спирт поведение чувствительность острая функциональная толерантность, передвижения компьютер слежения анализ
Анализ по измерению влияния этанола на локомоции Скорость<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Davies, A. G., Blackwell, G. G.,More

Davies, A. G., Blackwell, G. G., Raabe, R. C., Bettinger, J. C. An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (98), e52681, doi:10.3791/52681 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter