Protocol
Tahlil önce Günü'nde gerçekleştirin 1. Adım
- Taze nematod büyüme ortamına L4 aşamada solucanlar almak (NGM) plakaları OP50 E. bir çim ekildi 20 CO / N de coli, ve kültür onları. Her deney koşulu 10 solucan gerektirir; solucanlar O / N kaybı sağlamak için solucan fazlalığı almak.
- İlk gün yetişkin Yalnızca tahlil hayvanlar; Birçok mutantlar vahşi tip daha yavaş bir hızda büyür. Test edilen tüm hayvanların ilk gün yetişkin böylece gelişimsel gecikmelere sahip suşlar için toplama zamanlamasını ayarlayın.
2. Adım Tahlil günü gerçekleştir
- Deney için hazırlanması:
- Standart giremeyen 60 x 15 mm NGM plakalar üzerinde tahlilleri gerçekleştirin. Plakalar her kapak kapalı olarak, 2 saat süre ile 37 ° C'de kullanılacak kurutun. Her deneysel deneme için, dört kurutulmuş NGM tabak kullanın; Bu 0 mM ve 400 mM etanol tahlil plakaları ve beraberindeki alıştırma plakaları olacaktır.
NOT:NGM plakalar kullanımı Burada önemli olan; plakalarının bileşimin farklılıklar özellikle bunların ozmolarite, güçlü bir davranışı üzerinde etanol doz etkisini etkileyebilir, bu hayvanlar 20 biriken miktarda etanol değişiklikler, en azından kısmen, kaynaklanmaktadır. NGM agar 160 mOsm. - Kurutma işleminden sonra, giremeyen NGM plakalar, her deneyde kullanılan ve ağırlığı dikkat edilmesi tartın. Boş levha ağırlığına göre plakalarda ortamın hacmini belirler. Hacme agar ağırlıkça dönüşümünü tahmin etmek üzere ortam su, eşit hacimde aynı ağırlığa sahip olduğunu varsayalım.
Not: En tutarlı sonuçlar, orijinal 10 ml hacim 8,3-8,9 ml arasında bir post-kurutma hacmi yeterince dehidrate olan NGM ortamı ile tespit edilmiştir. 2 saat kuru zaman bir alternatif plakalar kuluçka farklılıkları hesaba bu hacim aralığı ulaşana kadar kurumaya olduğunu. - 4 bakır halkaları (1 iç çapı eritin.Ve 6 cm) levhaların her birinin yüzeyi, yaklaşık 3 için bir alev farklı genotipler ve worms.Grasp her forseps ile bir halka, ve ısı ve tedavi grupları için corrals (Bunsen brülör güçlü bir alev çalışır) olarak hareket halinde sn. Hala 'atlama' önlemek için forseps ile halka tutarak hemen bir plaka üzerinde halka yerleştirin.
- Halka halka üzerinde birkaç noktada forseps ile hafifçe bastırarak agar yüzeyine karşı düz aittir emin olun. Halka yerleştirirken, ek bir üç yüzük için odayı terk etmek dikkatli olun.
- Dört kameranın görüş alanı içerisinde olacak şekilde olduğu gibi birbirine yakın zamanda yerleştirmek için özen levhanın yüzeyine üç ek bakır halkalar eritin.
NOT: agar ile iyi bir sızdırmazlık yapma tahlil sırasında halkalarda solucanlar tutmak esastır. Plaka etrafında atlamak Yüzükler agar ile doğru mühür yapmak olası değildir vesolucanlar yuva sağlar ve solucanlar görselleştirmek müdahale ağar, yara olabilir. - Her tahlil plaka için kurutulmuş ve dereceye giremeyen ve hiçbir etanol alacaksınız gereken eşlik eden "alıştırma" plaka hazırlamak. Bu plakalar üzerinde dört bakır yüzük yerleştirin.
- Halkanın kendisinin görüş alanında yazma için özen, aşağıdaki halka kullanılacak solucan suşu ile her bir halkada plakaların alt etiketleyin. Eşlik eden aklimasyonundan plaka tahlil plaka üzerindeki etiketleri eşleştirin.
- Nihai konsantrasyon 0 mM ya da 400 mM metanol (hacim için ağırlık), böylece her bir deney plakası eklemek için% 100 etanol miktarını hesaplayın. Her deney için (n = 1), bir 0 mM ve bir 400 mM etanol plaka olacaktır; alışma plakaları etanol almıyorsunuz. Plaka yüzeyinde etrafında pipetleme, etanol ekleyin. Plaka sızdırmaz laboratuar filmi kullanın ve 2 saat süre ile, bir tezgah üstünde dengelenmeye gelmeye bırakın.
- 1.5 saat geçtikten sonra, tahlil, adım 2.2 aklimasyonundan adımını başlar.
- Standart giremeyen 60 x 15 mm NGM plakalar üzerinde tahlilleri gerçekleştirin. Plakalar her kapak kapalı olarak, 2 saat süre ile 37 ° C'de kullanılacak kurutun. Her deneysel deneme için, dört kurutulmuş NGM tabak kullanın; Bu 0 mM ve 400 mM etanol tahlil plakaları ve beraberindeki alıştırma plakaları olacaktır.
- Hareket deneyi yapın: Deney plakaları
- Dikkatle aklimasyonundan plaka üzerinde bir bakır halka merkezine her deney grubu 10 solucanlar aktarmak. Solucan çekme hafifçe kazıyarak bu noktada agar üzerinde görünür herhangi bir gıda çıkarın. Aynı suşları çalışmalar boyunca aynı sırayla plakalar koymak değil böylece deney grubu deneysel çalışmalar boyunca plakalar koymak sırayı Vary.
Not: hedef alıştırma levha gıda deney plakasına aktarılır ise solucanlar gıda ve hareket yeteneği üzerindeki ilacın etkisini gizlenir etrafında birikir, çünkü yemek az miktarda plakaya hayvanlar transfer edilmesidir. - Bu solucanlar yuva sağlayacak ve tahlil bozacak gibi, çekme ile agar yüzeyine kırmak için değil dikkatli olun. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında solucanlar inkübe edin.
- Her plaka insiyatifleri arasında uygun bir aralık olduğundan emin olun. Deneyimli bir deneyci 40 hayvan, 4 yüzük <1.5 dakika boyunca 10 / halka taşıyabilirsiniz, ancak 2 dakika kadar herhangi bir aralık kabul edilebilir. Standart tahlil 10-12 dakika ve 0 mM ve 400 mM etanol hem de maruz 30-32 dk kayıt filmleri vardır.
- 0 mM maruz kalma aklimasyonundan plaka ve yaklaşık 2 dk 30 sn dışında ikinci filmi başlamalıdır ilk önce film dosyasının tasarrufu sağlamak için 400 mM maruz kalma aklimasyonundan plaka başlatın.
- 30 dakikalık bir alışma süresinden sonra, deney plakalarına alıştırma levhalarından solucanlar aktarın. Her plakanın tamamlama arasındaki zamanlama takip, alıştırma plakaya ilave edildi sırayla deney plakalarına dişli (0 mM ya da 400 mM etanol) aktarın. Buharlaşma etanol kaybını en aza indirmek için laboratuvar film ile plaka Seal.
- Udüzleştirilmiş çekme üstüne solucanlar toplamak için ince kenarlı basık solucan kıracağıyla bir çekiş hareketi se. Bu çekme solucanı yapıştırıcı yardımcı olarak yaygın solucan aktarılması kullanılan bakteri, kullanılmadan analiz plakasına giremeyen alıştırma plaka solucanlar transferini gerçekleştirir.
Not: plaka ilk solucanlar plakaya eklenmiştir son solucanlar daha uzun etanol maruz çünkü hayvanlar bu aşamada transfer edildiği hızı çok önemlidir, ve daha önceki zaman noktalarında, bazı zamana bağlı etkilere sahip olur. Bu suşlar, deneysel çoğaltır genelinde ilk plaka üzerine yerleştirilir döndürülmesi için önemli nedenidir.
- Dikkatle aklimasyonundan plaka üzerinde bir bakır halka merkezine her deney grubu 10 solucanlar aktarmak. Solucan çekme hafifçe kazıyarak bu noktada agar üzerinde görünür herhangi bir gıda çıkarın. Aynı suşları çalışmalar boyunca aynı sırayla plakalar koymak değil böylece deney grubu deneysel çalışmalar boyunca plakalar koymak sırayı Vary.
- Hareket Testi gerçekleştirin: Film Çekme
- Böyle bir 2048x2048 7.4 ile bir 0.5x mikroskop objektif, 0.8x büyütme ve bir kamera gibi görüş alanı (yaklaşık 42x42 mm 2 kare), tüm dört yüzük eşzamanlı görüntüleme için izin veren bir mikroskop / kamera arada kullanın81 m piksel CCD.
- Yoğunluk eşik adımında nesne tanıma yardımcı olan görüş alanı, üzerinde bile aydınlatma kullanarak (aşağı bakınız). Bir 3 "x3" arka iyi çalışıyor.
- Görüntü ışık kaynağı bulaşan geleneksel mikroskop ile karşılaştırıldığında arka kullanarak kaybolur kontrastı üreten bir plaka yerleştirilmiş medya tarafı yukarı solucanlar (kapak aşağı).
- Hareketli solucanlar zaman atlamalı filmleri yakalamak için görüntü analiz yazılımı hazırlayın. 2-min (120 kare) film olarak, 12-bit gri ölçekli görüntüler, her 1 sn yakalamak için yazılım ayarlayın. Hala yeterli görüntü çözünürlüğü korurken, çıktı dosyasının boyutunu azaltmak için, 1024x1024 piksel görüntü yakalamak için bir 2x2 binning modunu kullanın.
- Film kaydetmek. Son solucanlar 10 dakika sonra o plaka yerleştirildi ilk plaka (0 mM etanol) 120 kare film kayıt başlayın. Film dosyayı kaydedin.
- İkinci plaka (400 mM etanol) kaydedin. Için bu işlemi tekrarlayınSon solucanlar işleminden 30 dakika sonra başlayan, her iki levha her teşhir için, 30-32 dakikalık bir zaman noktaları yakalamak için birinci plaka (0 mM etanol) yerleştirildi.
NOT: analiz edilecek bir sonraki plaka kaydı başlamadan önce her yakalama seansından sonra görüntü dosyalarını kaydetmek için yeterli zaman tanıyın. - Arşivlenmiş film geleceğe prova ve 8-bit 256 gri skala TIFF dosyaları için her filmin bir kopyasını dönüştürmek, bu filmler açıldı ve ImageJ 28 gibi diğer kamu alanı, açık kaynak kodlu yazılım programları görüntüleme, analiz edilecek izin vermek.
NOT: Burada anlatılan görüntü analiz yazılımı özel bir dosya biçimini kullanır.
- ImagePro yazılımını kullanarak film analizi.
- Yakalanan kez, Image-Pro yazılımı veya eşdeğer Artı kullanarak film analiz.
NOT: Diğer nesne izleme yazılımı çeşitli başarıyla birden C izlemek için kullanılır olmuştur ki mevcut tek seferde 29 ve böyle de elegansYazılım makul nesne tanımlama adımlar benzer ilkelere dayalı olarak burada tarif için yerine olabilir. açıklanan yöntem küçük farklılıklar olabilir Resim-Pro Plus yazılımı sürümleri 6,0-6,3 ve 7.0, Resim-Pro Plus yazılımının yeni sürümlerini ilgilidir. - 2-min (120 kare) segmentlerde filmleri analiz. İlk olarak, arka plan düzleştirmek ve solucan nesnelerin kontrastı artırmak için görüntülere bir filtre uygulamak. Aşağıdaki gibi filtre seçin: Menü> İşlem> Filtreler> Donanım> Flatten: Parametreler: Arka plan = Karanlık; Genişlik = 20 Pix Özellik.
- Filtreleme aşamasından sonra film yeniden kaydetmek ama her zaman kendi filtresiz formda orijinal film korumak.
- Yerleştirilir ve bakır halka ile üst üste büyüklükte faiz (ROI) bir dairesel bölge ile ayrı ayrı halka hayvanların lokomosyonu analiz. Belirlemek ve Menü> Tedbir ile solucanlar izlemek> Parça ... komutunu Nesneleri; Bu Takibi D getirirata Tablo penceresi. Takip Seçenekleri düğmesi belirli parçalar hariç olmak üzere ve herhangi bir deneysel eserler sınırlamak için olanak sağlar.
- Otomatik Takip sekmesinde, aşağıdaki parametreleri kullanın: Parça Parametreleri: Hız sınırını (arama yarıçapı) = 400 mm / çerçeve, İvme sınırı = Otomatik, Minimum toplam hat uzunluğu = 400 mikron, Baskın hareket type = kaotik; Parça parametreleri nesneler: kısmi parçalar = yes, Min uzunluğu = 21 kare, İzleme tahmin derinliği = 1 çerçeve izin verin.
- Izleme sürecini başlatmak için, otomatik olarak tüm parçalar Bul Kont / Boyut seçenekleri iletişim kutusunu ve İzleme iletişim kutusunu getirmek için düğmeye işlev tıklayın. Analiz için bir solucan nesne vurgulamak ve hafif arka plan pikselleri görmezden solucan piksel gri ölçekli yoğunluğunu kullanan önemli eşik adım sağlar Kont / Boyutu iletişim kutusunda, içinde Intensity Range Seçimi Manuel seçeneğini seçin.
- Yoğunluk eşik SLI ayarlayınders, tüm karanlık nesneleri vurgular kapsayıcı bir dizi oluşturmak için (bir alt sınırını ayarlamak için, bir üst sınırını ayarlamak için). 0-4,095 bir ölçekte 0-1,500 bir dizi ince ayar için iyi bir başlangıç noktasıdır.
- Bakır halka ve plakalar üzerinde herhangi bir enkaz gibi tek bir solucan nesnesi daha büyük ve daha küçük nesneleri, dışlamak için bir boyut filtresini uygulayın. Tedbir ile duruşlar çeşitli bireysel solucanlar için boyutları kapsayan bunu yapmak için iki boyut parametrelerini ayarlayın> Kont / Boyut seçenekleri iletişim kutusunda seçin Ölçümler menü öğesi. (Alan aralığı: 28,000-120,000 mikron 2 ve Çevre aralığı: 600-2,500 um).
- Bir mutant suş analiz edilecek plaka üzerinde önemli ölçüde daha küçük ya da diğer hayvanlara göre daha büyükse ayarları değiştirilebilir olması gerekmez, böylece ilk hayvanları izleme önce suşları farklı boyutlarda uyum nesne tanıma için filtre ayarları aralığını genişletmek orta analizi.
- Takip iletişim kutusunda Devam tıklayarak izleme işlemini tamamlayın. Görme otomatik filtre ayarlarına göre bunu dışlamak için geçerli bir neden olmadıkça, her solucan temsil sağlamak için filmde her solucanın ilerleme çıkış parçaları karşılaştırın. Manuel boyutu filtre kriterlerini doğruladı olmayan solucan nesnelerin varlığı ile üretilen parçaları silin.
- Her çerçeve arasındaki her solucanın hızını hesaplamak için yazılımını kullanın (mesafe kareler arasında 1 saniyede bir nesnenin sentroidinden için gitti) ve solucanlar nüfus için tüm parçalar arasında her parça için ortalama hız ve ortalama hızı görüntüler bakır halka. Bu son ortalama deneysel çalışmalarda açısından n = 1 olmak düşünün. İstatistiksel analizler ve veri arşivleme için bir elektronik tablo programı veri ihracat.
- Veri plakasında ilk halka kaydedildi edildikten sonra, bir sonraki halkaya yatırım getirisini taşımak veparametrelerden birini değiştirmeden, izleme işlemini tekrarlayın.
- Lokomosyon ile göreceli hız hesaplayın:
- Bağıl hız (%) = işlenmiş işlenmemiş (400 mM) hız / (0 mM) hız x 100.
NOT: Farklı genetik manipülasyonlar genellikle hayvanların bazal lokomosyon oranını değiştirmek. Hayvanların hareket hızına etanol etkiyi tespit etmek ve farklı genotipler ve koşullar arasında, bu etkilerini karşılaştırmak mümkün olması için, göreceli hızını hesaplar.
- Yakalanan kez, Image-Pro yazılımı veya eşdeğer Artı kullanarak film analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Birkaç farklı genotipleri ve eşleştirilmiş kontrollerden Temsilcisi verileri (Şekil 1) 8,24 sunulmuştur; veri özel tahlil hayvanlarda bu vurgu farklılıkları seçildi. maruziyet 10 dakika sonra etki derecesi Şekil 1B-G sol eksen üzerinde gösterilen bir soyu, ilk duyarlılık olarak kabul edilir. 10 dakika sonra kontrole göre daha büyük bir göreceli hızla mutant suşları, etanol (Şekil 1F, G) karşı dirençli olduğu kabul ederken (Şekil 1D, etanol aşırı duyarlılığı olduğu kabul edilir kontrolden daha az olan bir nispi hız ile mutant soyunun E). Şekil 1 'de sağ eksen 10 ve 30 dakikalık bir zaman dilimi arasında hızı geri kazanımı derecesini göstermektedir. Bu, akut fonksiyonel tolerans gelişmesi (AFT) hızının bir göstergesidir ve göreli SPE çıkarılır, 10 dakika göreceli hız olarak hesaplanır30 dk ed. Daha büyük geri kazanım değerleri suşlar (Şekil 1C Kontrol hayvanları AFT geliştirilmesi oranlarının daha düşük kabul edilir daha düşük geri kazanım değerleri kontrol hayvanlarında (Şekil 1D, K) ve suşlar ile karşılaştırıldığında AFT gelişimi daha hızlı bir oranına sahip olduğu kabul edilir E). SBP1 için ölçülen AFT (ep79) (Şekil 1G) (N2 kurtarma karşı karşılaştırma için p = 0.08) nedeniyle büyük varyans olumsuz toparlanma doğru trend ama vahşi tip istatistiksel olarak farklı değildi unutmayın. Küvet-1 tubby homologunu kodlar , BBS-1 insan BBS1 bir homologunu kodlayan, dudak-7 triaçilgliserol lipaz kodlar yağ-1, bir omega-3 yağ açil desatürazını kodlayan, yağ-3 bir delta-6 yağlı asit desatürazını kodlayan, SBP-1 için bir homologunu kodlayan Proteinler (SREBPs) Bağlama insan sterol Düzenleme Elemanı.
Birkaç önemli özellikleri vardırVeri dikkat: Birincisi, N2 (vahşi tip) kontrol verileri deneyler arasında farklılık; bu durum, bu gibi laboratuarda toplam su içeriğine veya kuru ortam tuz konsantrasyonu ve sıcaklık gibi kontrolü zor olan çevresel faktörlere olması muhtemeldir. Tipik haliyle, 400 mM eksojen etanol muamele edilmemiş kontroller yaklaşık olarak% 30 N2 hızı bastırır; Ancak depresyon mutlak derecesi deneme deney değişir. N2 içinde, 30 dakika boyunca hareket hızının yaklaşık% 12 geri kazanım genellikle beklenen Daha da ötesi, burada, daha numaraları değişir. Önemlisi, duyarlılık ve AFT sergi gün-gün varyasyon mutlak seviyeleri, genotipleri veya koşullar arasındaki karşılaştırmalar genellikle farklılık yok iken. Diğer bir deyişle, vahşi tip ve mutant birbirlerine göre benzer etkilere her zaman olacaktır; mutant vahşi tip AFT nisbetle bir azalmaya neden olur ise, bu azalma vahşi tip ile ortaya AFT miktarı ile ölçeklenir. Bu olaylarıperformansa önemi karşılaştırılan suşları veya koşullar için, aynı zamanda, aynı levha üzerindeki kontrolleri eşleştirilmiş.
İkincisi, ilk hassasiyet ve AFT fenotipleri genetik ayrılabilir. Bu ilk duyarlılığı ve birlikte ya da ayrı ayrı değişebilir akut fonksiyonel tolerans Not; örnekler, ilk duyarlılık ve AFT bağımsız olarak farklı olduğu fenotipler çeşitli dahil edilmiştir. Fenotip birinde bir değişiklik diğer fenotipinde bir değişiklik öngörmediğini, ne de ikinci fenotipin değişim yönünü tahmin etmez (artmış veya etanole yanıtta azalma olarak).
Şekil 1. İlk etanol duyarlılık ve akut fonksiyonel tolerans (AFT) gelişme oranı ayrılabilir davranışsal tepkiler vardır. (A) Özet tablosuetanol ve AFT gelişme hızı başlangıç duyarlılık seviyesinde adlandırılmış genlerdeki mutasyonların etkileri yönü, her ikisi de (her durumda, N2), vahşi tipli kontroller ile karşılaştırıldığında içindedir. (B-G) Akut hareket yanıtları 400 mM eksojen etanol 10-12 dakika ve sürekli etanol maruz 30-32 dk ölçülür. Bağıl hızlar (işlenmemiş hız%) sol eksen üzerinde gösterilir. hızındaki iyileşme derece doğru eksen üzerinde gösterilen ve 20 dakika aralığında AFT hızının bir ölçüsü olarak kabul edilmelidir. aşağıdaki gibi karşılaştırıldığında çalışmaların sayısı aşağıdaki gibidir: B, C, E n = 6; G: n = 7; D: s = 9; F: n = 11 istatistiksel olarak anlamlı karşılaştırmalar (eşleştirilmiş t-testi) gösterilmiştir: *, p <0.05; ** P <0.01. 8,24 modifiye edilmiştir, bu Şekilde gösterilen 8,24 verileri. pkira bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C. mevcut basit nörobiyoloji ve genetik araçlar elegans solucan davranışı üzerinde etanol etkilerinin moleküler temellerini incelemek için hangi mükemmel bir model olun. Burada, 8,10,20,24,25 etanol akut davranış tepkisinin farklı moleküler ve çevre mediatörleri tanımlamak için kullanılan bir analiz tanımlamaktadırlar. Bu yöntem, bu arada, memelilerde tepki seviyesine bileşik fenotip modeli, farklılaşması ve iki farklı etanol tepki davranışı fenotipleri ilk duyarlılık ve akut fonksiyonel tolerans gelişimi aynı anda incelenmesine olanak tanır. Aynı deney, kolaylıkla böylece diğer ilaç davranışsal etkilerinin değerlendirilmesinde çok türüne aynı anda test yararlanarak, diğer farmakolojik ajanlar çalışmaya adapte edilebilir.
10-12 dakika süre penceresi et bir gerginlik ilk duyarlılığını ölçmek için yararlı bir zaman noktası sağlarHANOL. Maruz kalma ilk 10 dakika boyunca 400 mM etanol etkilerinin analizi maruz ikinci dakikada ancak etkisi sürekli bir devlet başlayan hız efektleri etanol maruz 20 yedinci dakikaya kadar elde değil gösterir. Nedeniyle hareket hızı bu zamana bağımlı etkisi, özellikle suşlar plaka üzerine yerleştirilir sırası sekizinci veya dokuzuncu dakikada önce herhangi bir hız ölçümleri için önemli olacaktır (varsayarak solucanlar her yere en az 2 dakika sürer etanol plaka üzerinde). Bu daha önceki zaman noktalarında bazı solucanlar onlar plaka daha önce yerleştirildi çünkü etanol daha etkilenmiş olacak. Etanol istikrarlı ilk etkisi yedinci dakikada elde edilir olsa da, bunun nedeni, etanol ve bu zamana bağlı etkisi suşlar kaplarına yerleştirilir sırası suşları arasında sistematik etkisinin en aza düşürülmesi için suret çalışmalar boyunca değiştirilebilir önerilir ve plat solucanlar taşımak için gerekli süreör.
Belirli parametreler defalarca bakır halka veya diğer solucanlar ile çarpışır solucanlar önyargı en aza indirmek için nesne izleme adımlarla seçildi. nesne boyutu filtre adımı iki dokunaklı solucanlar dahil tek solucan daha büyük izleme herhangi bir nesneyi, ortadan kaldırmak gerekir. Bir solucan başka solucan veya bakır halka dokunursa o parça biter ve temas kalırken artık geçerli nesne olarak kabul edilmelidir. Solucan diğer nesne ile temas kaybettiğinde, yeni bir nesne haline gelir ve yeni bir parça başlatır. Bir solucan tarafından yapılan hat uzunluğu az 20 sn ise, o zaman otomatik olarak 21 kare minimum iz uzunluğu tanımlayarak hariçtir. Bu filtre bir solucan örnekleri, bir nesneyi tekrar dokunmak ileriye, sonra başka bir nesneye (solucan veya halka) içine ilerlemeye ters ve engeller hızlı ters olarak kısa nöbetleri önyargı hayvanların nüfusunun genel ortalama hızı olabilir. Bu ayarları kullanarak, it mümkün ve genel ortalamaya uzunluğu fazla 20 sn (ama az 99 sn) daha fazla parça katkıda tek bir solucan için nadir değildir. Her solucan sadece (120 sn toplam dışarı) Minimum hat uzunluğu 61 sn yaparak tek parça katkıda böylece ayarları değişmiş olabilir, ancak ampirik gözlem bu parça bir önemli sayıda ortadan ve yavaş olduğu tespit edildi tespit Diğer solucanlar ile çarpıştı solucanlar daha sıklıkla aşırı temsil olacaktır. Alternatif olarak, yeni parçalar daha sonra erken 2 dakikalık bir süre içinde analiz kaldırılır ve kullanışlı veriler kaybedilecek çarpışır solucanlar filmin ilk karesinde sonra başlayacak ancak izin verilmeyen olabilir. Son olarak, bakır halka başına 10 solucanlar kullanımı, ortalama ve çok sayıda sonsuz vida çarpışmalar yönelik probleme katkıda bulunan birden çok temsili parça olan arasında iyi bir denge gösterir.
Bu davranış tahlil önemli birkaç vardırsolucanlar etanol tepki davranışları çalışmanın avantajları. Aynı plaka üzerinde birden fazla genotiplerin aynı anda test ". Corrals" bakır kullanılması ile mümkün olmaktadır Bu buluş bir çok farklı avantajları vardır. İlk olarak, bu tahlilde, kontrol durumu veya ırkı her zaman deneysel koşul veya gerilme ve doğrudan karşılaştırılmıştır eşzamanlı olarak test hayvanların sadece aynı anda aynı plaka üzerinde test edilir. Davranışsal deneyler genellikle çevre tarafından etkilenir ve davranışsal tepkilerin gün-gün varyasyon tahlilde gürültüyü artırmak ve sinyalleri algılamak için yeteneğini azaltabilir çünkü bu özellikle önem taşımaktadır. aynı koşullarda deney grupları yan yana karşılaştırma esasen bu yaklaşımın önemli bir avantajı gün-gün çevre varyasyon, etkisini azaltır. İkinci olarak, bakır corrals kullanımı hareket deneyler a gerçekleştirilebilir sağlar görüş alanı, hayvanları içerirGıda bsence. Gıda yoksun olduğunda, solucanlar hızlı hareket ve bakteri arama dağıtmak eğilimindedir; halkalar olmadan, solucanlar tahlil sırasında görüş alanını terk ediyorum. Buna ek olarak, solucanlar görselleştirmek için onları kolay hale bakır tarafından püskürtüldü ve halkaların ortasına yakın kalmak eğilimindedir. Solucanlar bu deney koşullarında hızlı hareket olması büyük ölçüde etanol depresif etkilerini tespit etmek çözünürlüğü artırır; solucanlar yavaş hareket ederken, hızları daha önce onları tespit yeteneği kata çıkılır. Bakır solucanlar için toksik olduğunu unutmayın; yüzük, bu protokolde tahlil (birkaç saat içinde) halkaların hayvanların inkübasyonu genişletilmiş -etanol akut yanıtları etkileyebilir görünmüyor ise tavsiye edilmez. Üçüncü olarak, bu deneysel tasarım ile, bir tek deney dört farklı deney gruplarının davranışsal tepkilerini değerlendirmek. Bu nedenle, zaman istatistiksel olarak anlamlı veriler azalır birikir kaldırıldı. Additi içindetek bir dijital film yapımı olduğundan, üzerinde, bu birincil verilerin uzun süreli depolama için hafıza alanı gereksinimleri azalır. Son olarak, her bir deney için, her bir deney grubu için 10 tek tek hayvanların davranışı incelenmiştir. Bu 10 bireylerin hızları tek bir tahlil için bir birleşik hızı üretmek için ortalaması alınmıştır, böylece, n = 1 test edilmiştir. Birçok hayvan davranışı bu ortalama ayrıca bu duyarlı davranış tahlillerde değişkenliği azalır ve daha etanol tepki davranışları üzerinde ince etkilerini tespit etmek çözünürlüğü artar.
Herhangi bir mutant hayvanlar davranış analiz için geçerli bir kısmı burada tarif edilen yöntemler, bazı sınırlamalar vardır. Bu yaklaşımın önemli bir kısıtlama, kendilerinin ölçülen hız değeri inci düşer, çünkü çok bağlı olarak önemli koordinasyon bozukluğu veya felç yakın bazal hızlar olan mutant solucanlar, etanol etkilerine karşı direnç için yanlış pozitif olarak tespit edilebilir olmasıdırbir belirli görüntüleme kurulumu için doğru algılama eşiğinin altında. En nesne izleme yazılım programları mesafe kareleri arasında seyahat ölçmek için hangi pozisyon olarak centroid (kütle merkezi) kullanmak gibi, başını hareket sabit solucan hala sentroid konumunda bir kayma oluşturabilir ve bu kayma tespit edilecek hareket olarak. Bu nedenle, bir solucan gibi gerçek lokomosyonu ölçmek için vücut duruşu ince vardiya neden olduğu daha hızlı hareket edilmesi gerekir. Etanol maruz Solucanlar felç değil ama etanol pozlama bu teknik kat etkisi altında hız onların oranlarını azaltmak olasıdır zaten hareketin bir açığı var solucanlar ile onlar, çok koordinasyonsuzluk bulunmaktadır. Çerçeveler arasındaki zaman bu o için daha zor hale gelir çok daha fazla sn 1 den uzatılmış ise kare arasındaki süreyi artırmak vücut pozisyonunda büyük değişiklikler, bu sorunu çözmüyor sentroid pozisyonda ince vardiya ayrılabilir olacağını, böylecebject izleme yazılımı aynı solucan bir parça ziyade yakın ama dokunmadan değil solucanlar arasında bir parça atlama katkıda emin olmak için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
R01AA016837 (JCB) ve P20AA017828 (AGD ve JCB): Bu çalışmalar Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Alkolizm ve Alkol Bağımlılığı Enstitüsü hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans strains | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| 60 x 15 mm Petri plates, triple vented | Greiner Bio-One | 628161 | Other plate brands will suffice. |
| NGM agar | Various | NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O | |
| Forceps | Various | e.g., Fisher Scientific #10300 | |
| 37 °C Incubator | Various | For drying agar | |
| Digital balance | Various | For determining plate weights and agar volume | |
| Copper rings | Plumbmaster | STK#35583 (48 cap thread gasket) | 1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings |
| 100% ethanol | Various | ||
| Parafilm M | Bemis | PM996 | |
| CCD camera | QImaging | RET-4000R-F-M-12 | This camera has a large field of view. |
| Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective | Leica | MZ6 | Discontinued model, M60 is current equivalent. |
| Light source | Schott | A08923 | 3”x3” backlight for even illumination across the field of view |
| Imaging and tracking software | Media Cybernetics | ImagePro-Plus v6.0-6.3 | Newer versions of the software have tracking functions. |
References
- Prescott, C. A., Kendler, K. S. Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins. Am. J. Psychiatry. 156, 34-40 (1999).
- Schuckit, M. A. Genetics of the risk for alcoholism. Am. J. Addict. Article Review. 9, 103-112 (2000).
- Heath, A. C., et al. Genetic differences in alcohol sensitivity and the inheritance of alcoholism risk. Psychol. Med. 29, 1069-1081 (1999).
- Rodriguez, L. A., Wilson, J. R., Nagoshi, C. T. Does psychomotor sensitivity to alcohol predict subsequent alcohol use. Alcohol. Clin. Exp. Res. 17, 155-161 (1993).
- Schuckit, M. A., Smith, T. L. An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects. Arch. Gen. Psychiatry. 53, 202-210 (1996).
- Kalu, N., et al. Heritability of level of response and association with recent drinking history in nonalcohol-dependent drinkers. Alcohol. Clin. Exp. Res. 36, 522-529 (2012).
- Davis, S. J., Scott, L. L., Hu, K., Pierce-Shimomura, J. T. Conserved single residue in the BK potassium channel required for activation by alcohol and intoxication in. C. elegans. J. Neurosci. 34, 9562-9573 (2014).
- Raabe, R. C., Mathies, L. D., Davies, A. G., Bettinger, J. C. The Omega-3 Fatty Acid Eicosapentaenoic Acid Is Required for Normal Alcohol Response Behaviors in C. elegans. PLoS ONE. 9, e105999 (2014).
- Topper, S. M., Aguilar, S. C., Topper, V. Y., Elbel, E., Pierce-Shimomura, J. T. Alcohol disinhibition of behaviors in C. elegans. PLoS ONE. 9, e92965 (2014).
- Bhandari, P., et al. Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors Drosophila,Caenorhabditis elegans and mice. Genes Brain Behav. 11, 387-397 (2012).
- Davies, A. G., et al. A central role of the BK potassium channel in behavioral responses to ethanol in C. elegans. Cell. 115, 655-666 (2003).
- Davies, A. G., Bettinger, J. C., Thiele, T. R., Judy, M. E., McIntire, S. L. Natural variation in the npr-1 gene modifies ethanol responses of wild strains of C. elegans. Neuron. 42, 731-743 (2004).
- Kapfhamer, D., et al. Loss of RAB-3/A in Caenorhabditis elegans and the mouse affects behavioral response to ethanol. Genes Brain Behav. 7, 669-676 (2008).
- Speca, D. J., et al. Conserved role of unc-79 in ethanol responses in lightweight mutant mice. PLoS Genet. 6, e1001057 (2010).
- Thiele, T. E., Badia-Elder, N. E. A role for neuropeptide Y in alcohol intake control: evidence from human and animal research. Physiol. Behav. 79, 95-101 (2003).
- Treistman, S. N., Martin, G. E. BK Channels: mediators and models for alcohol tolerance. Trends Neurosci. 32, 629-637 (2009).
- Han, S., et al. Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence. Am. J. Hum. Genet. 93, 1027-1034 (2013).
- Kendler, K. S., et al. Genomewide association analysis of symptoms of alcohol dependence in the molecular genetics of schizophrenia (MGS2) control sample. Alcohol. Clin. Exp. Res. 35, 963-975 (2011).
- Schuckit, M. A., et al. Autosomal linkage analysis for the level of response to alcohol. Alcohol. Clin. Exp. Res. 29, 1976-1982 (2005).
- Alaimo, J. T., et al. Ethanol metabolism and osmolarity modify behavioral responses to ethanol in C. elegans. Alcohol. Clin. Exp. Res. 36, 1840-1850 (2012).
- Morgan, P. G., Sedensky, M. M. Mutations affecting sensitivity to ethanol in the nematode, Caenorhabditis elegans. Alcohol. Clin. Exp. Res. 19, 1423-1429 (1995).
- Mitchell, P. H., et al. The concentration-dependent effects of ethanol on Caenorhabditis elegans behaviour. Pharmacogenomics J. 7, 411-417 (2007).
- Vidal-Gadea, A., et al. Caenorhabditis elegans selects distinct crawling and swimming gaits via dopamine and serotonin. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, 17504-17509 (2011).
- Bettinger, J. C., Leung, K., Bolling, M. H., Goldsmith, A. D., Davies, A. G. Lipid environment modulates the development of acute tolerance to ethanol in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7, e35129 (2012).
- Davies, A. G., et al. Different genes influence toluene- and ethanol-induced locomotor impairment in C. elegans. Drug Alcohol Depend. 122, 47-54 (2012).
- Newlin, D., Thomson, J. Alcohol challenge with sons of alcoholics: a critical review and analysis. Psychol. Bull. 108, 383-402 (1990).
- Ponomarev, I., Crabbe, J. C. A novel method to assess initial sensitivity and acute functional tolerance to hypnotic effects of ethanol. J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 257-263 (2002).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , The C. elegans Research Community. (2012).
