Protocol
애벌레 1. 준비
- , 운동 또는 위치를 기본 설정으로 원하는 유충을 분석 표준 플라이 음식 (11)를 사용하여 10를 분석하기 위해 원하는 시대에 표준 조건 하에서 유충 성장합니다.
- 실크 스크린 수준의 나일론 깔때기를 통해 메쉬 스트레칭으로 메쉬 필터를 확인합니다. 고무 밴드와 깔때기 목에 메쉬를 고정합니다. 비커에 깔때기를 놓습니다.
- 분석을 위해 애벌레를 수집하려면, 주걱 가득 배양 병에서 구하고 유충을 포함하는 식품의 특종과 붓 10 메쉬에서 직접 개별 애벌레를 수집, 메쉬 필터를 통해 RT의 수돗물로 세척한다.
분석 튜브 2. 준비
- 분석 튜브를 연결하기 위해 준비하려면 신중하게 4 % 한천 겔을 끓여 1.5 cm의 깊이에 페트리 접시에 붓는다. 동물 봉입 할 때 튜브의 양측에 대해 플러그를 제공 할 것이다. 4 % 용액 (P)에서 유충을 방지하기에 충분히 조밀플러그를 enetrating.
- 튜브 깨끗하고 유충의 삽입 분명 이전에 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우, 기록되는 움직임을 차단 할 수있다.
- 유충 이동 충분한 수분을 보장하기 위하여 온수를 소량 함유하는 스퀴즈 병을 준비한다. 조심스럽게 싱크쪽으로 출구 방향을, 병 전환 및 픽업 관에서 물을 추방 부드럽게 쥐어 짜기.
- 분석 튜브에 병 콘센트를 삽입합니다. 축합 박층 튜브의 벽에 나타날 때까지 시험 튜브에 수증기를 전달하는 스퀴즈 병. 비디오 1은 수분 적당량 관으로 이동 유충을 나타낸다.
- 튜브를 밀봉 유충, 페트리 접시에서 1.5 cm 두께의 한천 겔을 제거하고 한천 플러그는 튜브 내로 삽입 될 수 있도록 한천 아래의 공기 흐름을 허용하기 위해 메시의 표면 위에 놓는다. 일 단부에 두 겔 플러그를 삽입하는 회 겔로 분석 튜브의 한쪽 끝을 누른다.
- paintb으로서두 약 1.5 인치 깊이 튜브로 한 유충을 배치하고 한천 겔에 유충 가까운 단부를 눌러 튜브를 밀봉. 생성 된 압력은 대향 단부로부터 한천 겔의 제 2 플러그를 강제 튜브 내에 동물을 밀봉한다.
- 장소 MB5 멀티 빔 초파리 활동 모니터 (DAM) 장치의 튜브 및 동물이 센서의 범위를 넘어 이동할 수 있도록 튜브 '의 위치를 조정합니다.
- 튜브 운송 중 장치의 적외선 판독 프레임 밖으로 밀어하지 않는 분석을 보장하기 위해, 각각의 튜브에 접촉 기록 장치 주위에 퍼티의 고리를 고정하여 장소에 튜브를 개최합니다.
3. 측정 활동
- 인큐베이터에서 녹음 활동으로 인해 그림자, 형광등 또는 실험실에서 온도 변화로 발생할 수있는 부정확 한 측정을 방지합니다. 시스템의 제안 배치는 그림 5를 참조하십시오.
- 20 ° C (그림 1 참조)에 인큐베이터를 설정합니다. 녹화 중에 인해 백열등 광원의 간섭에 허위 기록을 방지 형광 인큐베이터 조명을 끄고 인큐베이터에서 녹음하는 동안 별도의 LED 광원을 사용합니다. 비정상적으로 센서를 트리거하지 않는 조명 조건을 보장하기 위해 모든 동물없이 시험을 수행합니다. 이 테스트 이후에는 기록 된 이동 데이터가 없어야합니다.
- 애벌레 분석의 시작하기 전에 5 분 동안 20 ° C 배양기 설정에 적응하도록 허용합니다.
- 원하는 기록 간격 (예를 들면, 1 분)에 댐 시스템을 설정하려면 DAM 시스템 레코딩 소프트웨어는 컴퓨터 (12)를 호스팅하고 PSIU 인터페이스에 기록 챔버를 연결하기 전에 DAM 시스템 파일을 엽니 다 다운로드되어 있는지 확인합니다.
- 다음 데이터가 저장 될 때의 원하는 녹화 주파수 선택 환경 설정을 설정하려면 서로 다른 시간 프레임을 선택하려면 위 또는 독서 간격 옵션 아래를 클릭하는 데이터저장됩니다. 예를 들어, 1 시간에 1 초 시간 간격에서 독서를 선택.
- , 기록 데이터에 대한 다양한 매개 변수를 선택 환경 설정을 선택하고 출력 데이터 타입에 따라 해당 상자를 선택하려면 (수, 이동, 위치 및 거, 표 1 참조). 각 매개 변수는 튜브 내에서 애벌레 활동의 고유 한 분석을 제공합니다.
- 녹음을 시작 CAB6 전화 케이블을 사용하여 전원 공급 장치 인터페이스 장치 (PSIU)에 모니터를 연결합니다. 전원 콘센트에 PSIU를 연결합니다. 녹색 등이 해당 연결을 나타냅니다.
- 데이터 기록을위한 매킨토시 또는 Windows PC에 범용 직렬 버스 (USB) 케이블을 통해 PSIU를 연결합니다. 자동 데이터 기록을 시작하기 위해 컴퓨터에 댐 SystemMB1v6x 프로그램을 엽니 다.
- 바람직한 수집 시간이 완료되면 종료를 선택한 다음 DAM 활성 화면에서 지금 종료; 데이터가 자동으로 DAM 시스템 데이터 아래에 저장됩니다. 이 데이터 파일을 가지고 (예를 들어 1, 모니터)와 드래그 별도의 폴더에. 그들은 나중에 처리 될 수 있도록이 DAM 소프트웨어의 원시 데이터를 저장할 것이다.
처리를위한 데이터 준비 (4) (DAM 파일 검사)
- 이해할 수있는 형식으로 원시 데이터를 처리하려면 댐 파일 검사 응용 프로그램을 열고 선택 입력 데이터 폴더를 선택합니다. 그런 다음 데이터 폴더와 원하는 파일을 선택하고 검색 옵션을 선택합니다. 마지막으로 원하는 독서 기간에 빈 길이를 선택합니다. 이는 작업자에 의해 설정된 파라미터에 원시 데이터를 구성되고 프로그램은 특정 범위 내에서 수집 된 데이터를보고 할 것이다.
- (모니터 카운트, 이동, 거) 원하는 동작 설정을 분석하기 위해 출력 데이터 유형을 선택합니다. 여분의 판독 메뉴에서, 빈에 선택 합 (이 빈 길이가 선택한 시스템 판독 간격보다 큰 경우).
- 적절하게 파일 이름을 지정하고 저장합니다. 파일은 단계 3.9에서 폴더와 같은 위치에 저장한다.
- 이전에 저장 한 파일 (단계 4.3)를 열고, 평균 이동, 처리 스프레드 시트 프로그램에서 테이블을 생성하려면 4 단계에서 생성 된 원시 데이터를 수집, 텍스트 가져 오기 마법사 창이 나타나면, 선택 마무리 열기 위해 스프레드 쉬트 형식의 데이터 파일.
주 : 분석 데이터 타입에 따라, 스프레드 시트는 다르게 판독 될 것이다. 각각의 독서 관이 지정 편지를 받게됩니다 동안 일반적으로, 연구의 시간이 숫자로 기록됩니다 모니터 이동 또는 수를 측정합니다. 스프레드 시트에 데이터를 볼 때, 열은 검정 튜브 1-16 각각에 대해 KZ 슬랏을 나타낸다. 행은 수집 된 데이터 지점을 나타낸다. - 이동은 1 분 간격으로 20 분 동안 수집 된 경우, 예를 들어, 이동 / 분 및 다른 측정의 평균 수를 계산하는 평균 20 행.
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Representative Results
도 1은 상이한 온도에서 일곱 유생 운동의 차이를 검출하기 위해 모니터링 장치를 사용하여, 1118 w 제어 셋째 령 유충의 온도 반응 연구로부터의 결과를 나타낸다. 유충을 세척 및 전술 한 바와 같이 DAM 동작 장치에 배치하고, 원하는 온도로 설정 배양기에 넣었다. 녹화가 시작되기 전에 장치가 다음 5 분 동안 환경에 적응시켰다. 각 애벌레 개별적 20 분에 걸쳐 운동 분당 움직임의 평균 개수에 대한 분석은 각 동물에 대해 계산 된 32 동물의 각 세트에 대해 평균 하였다. 데이터 분석 및 스프레드 시트 프로그램을 이용하여 그래프 화 하였다. 온도가 20 ° C에서 이러한 추세에 휴식 및 25 ° C를 제외하고, 5도 단위로 5-35 ° C의에서 대응 증가로 유충이 크게 증가 활성을 나타내었다.
차이를 기 있는지 확인하려면LD는 제어 이전에 성욕 감퇴, 비활성 유충 (IAV 1)로 설명 돌연변이 시험 하였다 사이에서 검출 될 수있다. 데이터는 32 동물의 각 이동 / 분으로 분석하고, 평균을 산출했다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 분석은 비활성 유충 제어보다 훨씬 적은 이동되었음을 표시. 그들은 세 번째 령 유충보다 훨씬 작은 동안 20 분 분석의 각 분 제 3 령 애벌레의 그림 3. 활동에 나타낸 바와 같이, 제 1 및 제 2 령 유충의 활동 기간 동안 상대적으로 일관성을 유지하는 것으로하고, 또한 측정했다 ( 그림 4).
1118 애벌레 운동 W 그림 1. 5 ℃에서 다양한 온도 기록하였습니다 -. 35 ° C의 EACH 열은 세트 사이에 평균 분당 개별 이동 32 번째 령 동물의 평균 움직임을 나타냅니다. * 모든 평균은 10 ° C를 제외한 서로 크게 상이하고 15 ° C (p = 0.116)은 (다른 문자는 의미있는 차이 학생 t 테스트를 나타낸다).
훨씬 적은 이동성 제어에 비해 20 ° C. IAV 1 애벌레 전시에서 비활성 (IAV 1) 유충에 비해 그림 2. 셋째 령 제어 애벌레.
도 각 애벌레 단계 20 ° C. N = 32에서 20 분 간격으로 촬영을 통해 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 령 유충의 활성 측정 3.
20 분의 기록 분 간격의 각각에서 발생하는 움직임의 평균 개수를 표시하는도 4 히스토그램. 제 32 령 유충을 20 ℃에서 측정 하였다. 적색 선은 분당 움직임의 횟수는 전체 20 분 간격 평균 나타낸다.
PSIU 인터페이스 부 및 데스크톱 컴퓨터 초파리 활동 모니터 설정 및 연결을 도시 한도 5의 다이어그램. 인큐베이터 내를 도시하지만, 인큐베이터를 기록하는 것이 종료 될 때이다.
| 기술 | 매개 변수 |
| 데이터를 기록 할 때마다유충은 빔을 교차 및 추가 카운트 기록 유충 이동하는 경우 하나의 빔 내에있다. | 카운트 |
| 파리 별도의 빔 사이에 재배치 할 때 데이터를 기록 만, 그것은 빔 내에서의 움직임을 기록하지 않습니다. | 이동 |
| 기록 간격 동안 초당에서 동물의 위치를 기록합니다. 이 데이터를 분석하는 과정을 통해 각각의 센서에서 보낸 시간의 함수로서 위치 환경을 보여준다. | 드웰 |
| 이 설정은 동물이 이동하는 동안 트리거되는 센서 있는지를 나타내는, 튜브 내에서 동물의 일반적인 위치를 분석한다. | 위치 |
| 이 설정은 설정 시간 프레임 동안 수집 된 데이터는 데스크탑 컴퓨터에 저장되는 주파수를 결정한다. | 촬영 간격 |
measu 표 1. 설명별 개로 매개 변수 (수는, 이동은, 드웰 및 위치).
이전에 비디오 1. DAM 시스템 분석 튜브 구동 장치에 삽입 할 수 있습니다. 습기는 호흡에서 응축에 의해 제공됩니다. 이 수준은 부유하거나 수영을 할 수있는 동물을 유발하지 않고 연구 기간 동안 애벌레 운동을 유지하기에 충분하다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
초파리 유충의 활동은 유전자형 8, 13 세 및 주위 온도 2를 포함한 다양한 요인에 의해 영향을 받는다. 매우 상세한 분석 할 수있는 강력한 비디오 그래픽 방법은 운동 (5)을 연구하는 사람들에 의해 개발되었지만, 세부 사항의 수준은 활동의 기본 매개 변수를 결정하고자하는 사람들을 위해 불필요 할 수있다. 여기에 기재된 방법은, 많은 실험실에서 사용할 디바이스 작동하기 쉬운 고용 고도로 재현 가능한 결과를 생성하고, 심지어 그 기본 연구 초점 운동 아니다에게 관리이다. 예시적인 결과는 상기 분석이 서로 다른 온도 (도 1)과 상이한 유전자형 (도 2) 실시 유충의 운동성에 상당한 변화를 검출하는데 사용될 수 있음을 입증한다.
35 ° C, 자신을 - 유충은 5 ° C 범위의 온도에서 측정했을 때활동은 20 ° C와 25 ° C (그림 1) 사이의 추세에서 휴식을 제외하고, 온도가 증가했다. 그것은 구하고 조기 셋째 령 유충은 전형적인 25 ℃ 배양 온도 + 2 ℃ 내에서 온도를 선호 Ainsley과 동료들에 의해 밝혀졌다. 애벌레 중반 세 번째 령 단계를 방황 입력 할 때 그러나, 그들은 약간 낮은 온도 (2)를 선호한다. 그 결과는 분석 동물의 일부는 낮은 온도에서보다 적극적으로, 그리고 덜에서 방황 단계에 있던 것을 제안, 세 번째 령 유충을위한 운동 활성이 25 ℃보다 20 ℃에서 큰 관찰과 일치 25 °의 C의 일반 배양 온도.
이 방법은 단순, 객관성과 강력한 처리 속도를 제공하지만, 한계가있다. 현재 셋업은 PR하지 않기 때문에 전술 한 애플리케이션은 부분적으로, 비교적 짧은 시간에 걸쳐 발생하는 분석법을 나타낸다음식 소스와 ovide 유충. 적절한 영양을 보장하는 것은 오랜 기간 동안 활동의 변화를 연구하거나 장기적으로 일주기 리듬을 측정 할 필요가있을 것입니다. 4 % 한천 플러그는 저산소 상태를 경험 유충이 발생할 수 챔버와 외부 환경 사이의 가스 교환을 제한 할 수 있습니다. 그러나이 기간의 각 분 동안 애벌레의 분 당 평균 이동을 분석 한 결과, 유충이 기록 기간 동안 활성의 변화를 보여주기 위해 표시되지 않기 때문에, 20 분의 시험 기간 내에 활성에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다 (도 4) .
장치 레코드 위치가 지속적으로이 인용이 아닌 자동화 된 방법에 비해 더 모션 캡처의 개선을 나타내므로, 그러나 일부 동작이 탐지되지 않습니다. 매우 작은 동물의 움직임이 장치로부터의 응답을 트리거하지 않을 수도 유충 한 적외선 내에 원주 방식으로 이동할 수있다부정확하게 낮은 수치의 결과로, 이웃 빔을 파괴하지 않고 빨간색 빔. 이러한 유형의 에러는 모든 치료 그룹에서 발생할 것으로 예상 될 수 있기 때문에, 이것은 잘못된 결과를 초래할 가능성이있다. 셋째 령 유충이 분석의 주요 초점이지만, 장치뿐만 아니라 (도 3)를 더 작은 제 1 및 제 2 령 유충의 움직임을 측정 할 수있다. 예상대로, 어린 동물 분당 기록 움직임의 수는 더 큰 제 령 동물보다 낮다.
이 장치에 사용하는 전체 범위가 아직 입증되어야하지만, 유충과 관련된 연구에 대해이 장치의 용도를 다양 화 할 수있는 다른 적응의 다양한있다. 예를 들어, 상기 장치는 상기 튜브의 결정 영역에서 소요 시간을 나타내는 '드웰'측정을 허용한다. 다양한 초파리 사용될 때 애벌레는 택시를 가치있는 정보를 제공 할 수있다ssays. 튜브가 수직 대신 수평의 방향이되도록 옆으로 장치를 배치하여, 하나는 애벌레 geotaxis을 측정 할 수있다. phototaxis을 측정하기 위해, 빛 그라데이션 유충이 빛 또는 부재에 대한 선호가 있는지 여부를 테스트 튜브에 설립 할 수있다. 화성을 연구하기 위해, 시험 물질이어서 그들의 선호도를 결정하거나 화학적 회피 밝힐 수도 한천 플러그 및 유충의 위치 중 하나에 배치 될 수있다.
모니터 시스템은 사전 분석 설정 동안 모든 파라미터를 선택함으로써 표 1에 요약 다양한 동작 파라미터의 분석을 허용 실험자가 시험 후 분석되는 파라미터를 선택할 수있다 (단계 3.6 참조). 어떤 설정을 선택하지 않은 경우, 해당 데이터는 사후 분석을 위해 사용할 수 없습니다. 이것은 각각의 선택된 시간주기 이후에, 데이터는 현재 카운트에서 동결되고, 호스트 컴퓨터에 저장된 것을 주목해야한다. 데이터 수집은 다음에 재설정이 기간 후에는 제로 시간 간격 일련의 데이터 포인트를 제공 다시 시작한다. 하나는 수동으로 데이터 기록을 종료 종료해야합니다.
이 방법과 관련된 미래 연구 드웰 파라미터와 그 다양한 용도의 사용에 초점을 맞출 것이다. 또한 그것은 연구 음식을 제공하고, 더 많은 가스 투과성 물질 (14)에 대해 한천 플러그를 교환함으로써, 이러한 주기성 연구로서 오랜 기간에 걸쳐 발생할 수 있도록 허용하는 프로토콜을 개발하는 것이 가능할 수있다. 건조 조건이 운동 (15)을 억제하는 수분 수준뿐만 아니라, 제어 될 필요가있을 것이다. 현재,이 실험 프로토콜은 다양한 조건 하에서 유생 활성 기본 파라미터를 정확하게 평가하는 간단하고 비용 효율적인 방법을 제공한다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Activity Monitor, Multibeam, 16 tubes, including wires | TriKinetics Inc. | MB5 | |
| Power Supply Interface for Activity Monitor | TriKinetics Inc. | PSIU24 | |
| Glass 80 x 5 mm tubes for Activity Monitor (100) | TriKinetics Inc. | PGT 5x80 | |
| DAMsystemMB1v6x Data Acquisitions Software for Macintonsh OSX (Intel) | www.trikinetics.com | free download | |
| DAMFileScan 108x software for Macintosh | www.trikinetics.com | free download | |
| USB software (PSIUdrivers.zip). | www.trikinetics.com | free download | |
| DAMSystem Notes 308 | www.trikinetics.com | free download | |
| Zeiss Stemi 2000C- Stereo Microscope | Spectra Services | SP-STEMI2000C-BS | |
| Carbon Dioxide | Maine Oxy | anaesthesia | |
| Fly Pad | Genesee | 59-114 | surface for sorting anaesthetized flies |
| Small paint brush | Winsor & Newton | #2 ROUND | or similar, used for sorting anaesthetized flies |
| Silk Screen Printing Mesh (160) | msj-gallery.com | SM160W63-3YD | pore sized used in this protocol was ~ 0.1 mm |
| Tegosept | Genesee | 20-258 | preservative |
| Ethanol (190proof) | Pharmco | 111000190 | used to dissolve Tegosept |
| 6 oz Square Bottom Bottle (PP) | Genesee | 32-130 | |
| "Flugs" for Plastic Fly bottles | Genesee | 49-100 | |
| Drosophila Vials, Wide (PS) | Genesee | 32-117 | |
| Flugs for wide plastic vials | Genesee | 49-101 | |
| Yellow Degerminated Corn Meal | Gold Medal | ||
| Drosophila agar | LabScientific | FLY 8020 | |
| Baker's Yeast - Red Star | King Arthur Flour | 1270 | |
| Granulated Sugar - Extra Fine | Domino |
References
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