Protocol
1. Utarbeidelse av larver
- Å analysere en ønsket larve for locomotion eller foretrukket plassering, vokser larver under standardbetingelser til ønsket alder for å analysere 10 ved hjelp av standard fly mat 11.
- Lag en mesh filter ved å strekke Silke grade nylon mesh over en trakt. Fest mesh på trakt hals med strikk. Sett på trakten i et begerglass.
- Å samle larver for analyse, scoop en slikkepott-full av mat som inneholder foraging larver fra flasken kultur og vask med vann RT springen over maskefilter, samle enkelte larver direkte fra mesh med en pensel 10.
2. Fremstilling av Analyserørene
- For å forberede seg til å plugge analyse rør, kok forsiktig en 4% agar gel og hell i en petriskål til en dybde på 1,5 cm. Dette vil gi en plugg for hver side av røret når dyret er vedlagt. Den 4% løsning er tilstrekkelig tett til å hindre at larver fra pPenetrerende pluggene.
- Pass på at rørene er rent og klart før innsetting av larve. Hvis de ikke er det, kan dette blokkere bevegelser fra å bli registrert.
- For å sikre larver har tilstrekkelig fuktighet for bevegelse, utarbeide en klemme flaske inneholder en liten mengde varmt vann. Vend flasken forsiktig orientere uttaket mot en vask og klem forsiktig for å fordrive vann fra pickup tube.
- Sett flaskeutløpet inn i prøverør. Trykk på flasken for å gi vanndamp inn i prøverør til et tynt lag av kondensasjon vises på veggen av røret. Video 1 viser en larve som beveger seg i et rør med en passende mengde fuktighet.
- For å forsegle larven i røret, fjernes 1,5 cm tykk agar gel fra petriskålen og legg over en mesh overflate for å tillate luftstrøm under agar agar, slik at en plugg kan settes inn i røret. Trykk på den ene enden av prøverør inn i gelen to ganger for å sette inn to plugger av gelen inn i en ende.
- Med en paintbjag, plasserer en larve i røret ca 1,5 inches dyp og forsegle røret ved å trykke på slutten nærmest larven inn i agar gel. Det resulterende trykk vil tvinge ut den andre plugg av agar gel fra den motsatte ende og forsegle dyret inne i røret.
- Plasser rørene i MB5 Multi-Beam Drosophila Activity Monitor (DAM) enhet, og juster rør posisjoner slik at dyrene ikke kan bevege seg utenfor rekkevidden av sensorene.
- For å sikre at analysen rør ikke gli ut av enhetens trådløse leseramme under transport, holder røret på plass ved å feste en ring av kitt rundt hvert rør der den kommer i kontakt opptaksenheten.
3. Måling aktivitet
- Record aktivitet i en kuvøse for å unngå unøyaktige målinger som kan oppstå på grunn av skygger, lysrør eller til temperaturvariasjoner i laboratoriet. Se figur 5 for et foreslått arrangement av systemet.
- Satt en inkubator til 20 ° C (se figur 1). For å unngå falske opptak på grunn av forstyrrelser fra gløde lyskilder under opptak, slå av fluorescerende inkubator lys og bruke en egen LED lyskilde under innspilling i kuvøse. Utfør en rettssak uten dyr for å sikre at lysforholdene ikke abnormt utløse sensorer. Det bør ikke være registrert bevegelse data etter denne testen.
- Tillat larver å akklimatisere seg til de 20 ° C inkubator innstillinger for 5 min før start av analysen.
- Hvis du vil angi DAM System til ønskede opptaks intervaller (f.eks 1 min), sikre DAM system innspillingen programvare er lastet ned til å være vert datamaskin 12 og åpne DAM systemfilen før du kobler innspillingen kammeret til PSIU grensesnittet.
- Å stille inn ønsket opptaksfrekvens som data blir lagret, velger preferanser og klikk deretter over eller under lesing intervallet muligheten til å velge ulike tidsrammer som datablir lagret. For eksempel velge å lese intervaller fra 1 sekund til 1 time.
- Slik velger varierende parameter for registrering av data, velger innstillinger og deretter velge de tilsvarende alternativene under utgangsdatatype (teller, bevegelser, posisjoner og bo, se tabell 1). Hver parameter gir en unik analyse av larve aktivitet inne i røret.
- Til å begynne innspillingen, koble skjermen til strømforsyningen Interface Unit (PSIU) ved hjelp CAB6 telefonkabel. Koble PSIU til et strømuttak. Et grønt lys vil indikere riktig tilkobling.
- Koble PSIU gjennom en Universal Serial Bus (USB) kabelen til en Macintosh eller Windows PC for dataregistrering. Åpne DAM SystemMB1v6x program på datamaskinen for å starte data opptaket automatisk.
- Etter den ønskede samlingen tiden er ferdig, velger Avslutt, og deretter Avslutt nå på DAM aktivitet skjermen; data vil da bli automatisk lagret under DAM System Data. Ta denne datafilen (for eksempel overvåke 1) og dra inn i en egen mappe. Dette vil lagre rådata fra DAM programvaren, slik at de senere kan bli behandlet.
4. Forberede Data for Processing (DAM FileScan)
- Å behandle rådata til et forståelig format åpne DAM FileScan programmet og velg Select Input Data-mappen. Deretter velger data mappe og ønsket fil, og velg skannealternativ. Til slutt velger bin lengden til ønsket leseperioden. Dette vil organisere rådata til parametre satt av operatøren og programmet vil rapportere de innsamlede dataene i det aktuelle område.
- Velg utgangsdatatype for å analysere den ønskede bevegelse innstilling (monitor teller, trekk, bor). Under ekstra opplesninger menyen velger sum inn bin (dette er hvis bin lengde er større enn det valgte systemet lesing intervall).
- Gi navn til filen på riktig måte og spare. Filen vil bli lagret på samme sted som den mappen fra trinn 3.9.
- For å samle gjennomsnittlig trekk, prosess rådata generert fra trinn 4. Hvis du vil generere en tabell i et regneark program, åpne filen som tidligere ble lagret (trinn 4.3), og når teksten importveiviseren vises, for å velge FINISH åpne datafilene i et regnearkformat.
Merk: Avhengig av datatype analysert, vil regnearket leses annerledes. Typisk for å måle overvåknings trekk eller tellinger, tidsrommet for undersøkelsen vil bli registrert tallmessig, samtidig som hver enkelt avlesning røret vil få en utpekt bokstav. Når du viser dataene i regnearket, KZ kolonner representerer sporene for analyse rør 1-16 hhv. Radene representerer datapunktene samles. - For eksempel, hvis trekk ble samlet i 20 min i 1 minutts intervaller, gjennomsnitt de 20 radene for å beregne et gjennomsnittlig antall trekk / minutt og andre målinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser resultatene fra en temperatur responsstudie av kontroll tredje instar larver, 1118 w, ved hjelp av overvåkingsanordningen til å detektere forskjeller i larve bevegelse ved syv forskjellige temperaturer. Larver ble vasket og plassert i den DAM-aktivitet enhet som beskrevet ovenfor, og plassert i en inkubator innstilt på den ønskede temperatur. Apparatet ble deretter tillatt å akklimatisere seg til omgivelsene i 5 minutter før opptaket begynte. Hver larve ble individuelt analysert for bevegelse over en 20 minutters periode, og det gjennomsnittlige antall trekk per minutt ble beregnet for hvert dyr og i gjennomsnitt for hvert sett av 32 dyr. Data ble analysert og tegnes ved hjelp av et regnearkprogram. Larvene viste signifikant økende aktivitet som temperaturen økt tilsvarende 5-35 ° C i 5 grader, med unntak av en pause i denne trenden ved 20 ° C og 25 ° C.
For å bekrefte at forskjeller couLD detekteres mellom en kontroll og en mutant som tidligere beskrevet som hemmet, inaktive larver (IAV 1) ble testet. Data ble analysert som beveger seg / minutt for hver av de 32 dyrene og et gjennomsnitt ble deretter beregnet. Som vist i figur 2, viser analysen at inaktive larvene var betydelig mindre mobile enn en kontroll. Selv om de er mye mindre enn tredje instar larver, aktivitet av første og andre stadiums larver var også målbar, som vist i figur 3. Aktivitet av tredje instar larver i hvert minutt av 20 min analyse ble vist å være relativt konsistent hele perioden ( figur 4).
Figur 1. w 1118 larve locomotion ble registrert ved temperaturer som varierer fra 5 ° C -. 35 ° C Each kolonne representerer den gjennomsnittlige bevegelsen av 32 tredje stadium dyr med individuelle trekk per minutt i gjennomsnitt blant settet. * Alle gjennomsnitt er vesentlig forskjellige, bortsett fra 10 ° C fra hverandre, og 15 ° C (p = 0,116) (forskjellige bokstaver indikerer en signifikant forskjell, Student t-test).
Figur 2. For det tredje instar larver sammenlignet med kontroll inaktiv (IAV 1) larver ved 20 ° C. IAV en larver oppviser betydelig mindre mobilitet sammenlignet med kontrollen.
Figur 3. Måling av aktivitet av første, andre og tredje instar larver i løpet av en 20 min opptaksintervall ved 20 ° C. N = 32 for hver larvestadiet.
Figur 4. histogram som viser gjennomsnittlig antall trekk som forekommer i hvert minutt av 20 min opptaksintervall. 32 tredje instar larver ble analysert ved 20 ° C. Den røde linjen representerer antall trekk per minutt i gjennomsnitt for hele 20 min intervall.
Figur 5. Diagram som illustrerer Drosophila Activity Monitor oppsett og dens tilkobling til PSIU tilpasningsenhet og en stasjonær datamaskin. Innsiden av inkubatoren er avbildet, men under innspillingen inkubatoren er å bli stengt.
| Beskrivelse | Parameter |
| Registrerer data hver gangen larve krysser en bjelke, og flere tellinger registreres dersom larven beveger seg mens innenfor en enkelt bjelke. | Teller |
| Registrerer data bare når en flue pinnen mellom separate bjelker, det spiller ikke inn bevegelse i en bjelke. | Moves |
| Registrerer dyr posisjon ved hver andre over et opptaksintervall. Denne informasjonen viser plasseringsinnstilling som en funksjon av tid brukt på hver sensor i løpet av en analyse. | Dwell |
| Denne innstillingen analyserer dyrets generelle posisjon inne i røret, noe som indikerer hvilken sender dyret utløser under bevegelse. | Posisjon |
| Denne innstillingen bestemmer hvor ofte data samlet inn i løpet av et gitt tidsrom, blir lagret på stasjonære PC. | Recording Interval |
Tabell 1. Beskrivelse av måleREMENT parametere (Counts, Moves, Dwell og posisjoner).
Video 1. DAM-system prøverør før innsetting i betjeningsinnretningen. Fuktighet er gitt ved kondensasjon fra pust. Dette nivået er tilstrekkelig til å opprettholde larve bevegelse gjennom hele studieperioden uten at dyret å flyte eller svømme. Klikk her for å se denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aktivitet av Drosophila larver er påvirket av en rekke faktorer, inkludert genotype 8, alder 13 og omgivelsestemperatur 2. Selv kraftige videographic metoder som kan svært detaljert analyse har blitt utviklet av de som studerer locomotion 5, kan dette detaljnivået være overflødig for de som ønsker å bestemme grunnleggende parametre for aktivitet. Metoden er beskrevet her benytter en enhet som er tilgjengelig i mange laboratorier, er enkel å betjene, genererer svært reproduserbare resultater, og er overkommelig selv for dem som primært forskningsfokus er ikke bevegelse. Eksemplene resultater viser at denne analysen kan brukes til å detektere signifikante forandringer i motilitet i larvene utsettes for forskjellige temperaturer (figur 1) og av forskjellige genotyper (figur 2).
Når larvene ble målt ved temperaturer fra 5 ° C - 35 ° C, sinaktiviteten økt med temperatur, med unntak av en pause i trenden mellom 20 ° C og 25 ° C (figur 1). Det har blitt vist av Ainsley og medarbeidere at slåing tidlig tredje instar larver foretrekker temperaturer innenfor +/- 2 ° C av en typisk 25 ° C kultur temperatur. Men når larvene skriv vandrende mid-tredje stadium fasen de foretrekker litt kjøligere temperaturer to. Det funn er i overensstemmelse med den observasjon at bevegelsesaktivitet for tredje instar-larver er større ved 20 ° C over 25 ° C, noe som tyder på at en del av dyrene ble analysert i den vandrende scenen og mer aktive ved lavere temperaturer, og i mindre grad ved den normale kulturen temperatur på 25 ° C.
Denne metoden gir enkelhet, objektivitet og robust gjennomstrømning, men det er begrensninger. Anvendelsene som er beskrevet ovenfor representerer analyser som opptrer over et relativt kort tidsrom, delvis fordi den nåværende oppsett ikke PRovide larver med en matkilde. Sikre tilstrekkelig ernæring vil være nødvendig å studere endringer i aktivitet over lengre tid eller for å måle døgnrytmen på lengre sikt. 4% av agarplugger kan begrense gassutvekslingen mellom kammeret og det ytre miljø, noe som kan resultere i at larvene opplever hypoksiske betingelser. Men dette synes ikke å påvirke aktiviteten i en 20 min periode assay, fordi da gjennomsnittlig trekk per minutt av larver i løpet av hvert øyeblikk av perioden ble analysert, ble larvene ikke synes å vise noen endring i aktivitet over registreringsperioden (figur 4) .
Fordi enheten poster posisjon kontinuerlig den representerer en forbedring i å fange mer bevegelse i forhold til de ikke-automatiserte metoder sitert, men noen bevegelse gjør unngå å bli oppdaget. Svært små bevegelser av dyr kan ikke utløse en respons fra denne enheten, og larvene kan bevege seg i en omkrets mote innen ett infrarød stråle uten å bryte nabobjelker, hvilket resulterer i feilaktig lave avlesninger. Men siden denne type feil kan forventes å oppstå i alle behandlingsgruppene, er det lite sannsynlig å forårsake misvisende resultater. Selv om det tredje instar larver er den primære fokus for denne analysen, er anordningen i stand til å måle bevegelse av mye mindre første og andre stadiums larver i tillegg (figur 3). Som forventet, er det antall trekk tas opp per minutt i yngre dyr lavere enn for de større tredje instar dyr.
Selv om hele spekteret av bruksområder for denne enheten har ennå ikke påvist, er det en rekke andre tilpasninger som kan diversifisere bruken av dette apparatet for studier med larver. For eksempel kan enheten en "oppholdstid" måling, som representerer tiden som brukes i en bestemt region av røret. Dette kan gi verdifull informasjon når ansatt i ulike Drosophila larve drosjer enssays. Ved å plassere anordningen på siden, slik at rørene er orientert vertikalt i stedet for horisontalt, kan man måle larve geotaxis. For å måle phototaxis, kunne en lett gradient bli etablert i rørene, teste om larvene har en preferanse for lys eller dens fravær. For å studere kjemotakse, kan en forsøksstoff plasseres på en av agarplugger og posisjonen til larvene vil da kunne avsløre bestemme deres preferanse for eller unngåelse av kjemikaliet.
Den monitor systemet tillater analyse av ulike bevegelsesparametre, oppsummert i tabell 1. Ved å velge alle parametere i løpet av pre-analyseoppsett (se trinn 3.6), experimenter kan velge hvilken parameter for å analysere etter analysen. Men hvis noen innstillingen ikke er valgt, at data vil ikke være tilgjengelig for post hoc analyse. Det skal bemerkes at etter hver valgt tidsperiode, blir data frosset i løpende tellinger og lagret til vertsdatamaskinen. Datainnsamling deretter tilbakestilles tilnull etter denne perioden, og begynner på nytt, noe som gir en serie av tidsintervalldatapunkter. Man må manuelt slutte å ende data innspillingen.
Fremtidige studier som involverer denne fremgangsmåten vil fokusere på bruk av holde parameter og dets ulike anvendelser. Også kan det være mulig å utvikle en protokoll som ville tillate for studier for å skje over en lengre tidsperiode, slik som biologiske undersøkelser, ved å gi mat og utveksling av agarplugger for en mer gass-permeable materiale 14. Fuktighetsnivåer trenger å bli kontrollert, så vel som tørre forhold hemmer bevegelse 15. Foreløpig gir denne protokollen en nøyaktig, enkel og kostnadseffektiv metode for å evaluere grunnleggende parametre for larve aktivitet under en rekke eksperimentelle forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Activity Monitor, Multibeam, 16 tubes, including wires | TriKinetics Inc. | MB5 | |
| Power Supply Interface for Activity Monitor | TriKinetics Inc. | PSIU24 | |
| Glass 80 x 5 mm tubes for Activity Monitor (100) | TriKinetics Inc. | PGT 5x80 | |
| DAMsystemMB1v6x Data Acquisitions Software for Macintonsh OSX (Intel) | www.trikinetics.com | free download | |
| DAMFileScan 108x software for Macintosh | www.trikinetics.com | free download | |
| USB software (PSIUdrivers.zip). | www.trikinetics.com | free download | |
| DAMSystem Notes 308 | www.trikinetics.com | free download | |
| Zeiss Stemi 2000C- Stereo Microscope | Spectra Services | SP-STEMI2000C-BS | |
| Carbon Dioxide | Maine Oxy | anaesthesia | |
| Fly Pad | Genesee | 59-114 | surface for sorting anaesthetized flies |
| Small paint brush | Winsor & Newton | #2 ROUND | or similar, used for sorting anaesthetized flies |
| Silk Screen Printing Mesh (160) | msj-gallery.com | SM160W63-3YD | pore sized used in this protocol was ~ 0.1 mm |
| Tegosept | Genesee | 20-258 | preservative |
| Ethanol (190proof) | Pharmco | 111000190 | used to dissolve Tegosept |
| 6 oz Square Bottom Bottle (PP) | Genesee | 32-130 | |
| "Flugs" for Plastic Fly bottles | Genesee | 49-100 | |
| Drosophila Vials, Wide (PS) | Genesee | 32-117 | |
| Flugs for wide plastic vials | Genesee | 49-101 | |
| Yellow Degerminated Corn Meal | Gold Medal | ||
| Drosophila agar | LabScientific | FLY 8020 | |
| Baker's Yeast - Red Star | King Arthur Flour | 1270 | |
| Granulated Sugar - Extra Fine | Domino |
References
- Tracey, W. D. Jr, Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila.gene essential for nociception. Cell. 113, 261-273 (2003).
- Ainsley, J. A., Kim, M. J., Wegman, L. J., Pettus, J. M., Johnson, W. A. Sensory mechanisms controlling the timing of larval developmental and behavioral transitions require the Drosophila.DEG/ENaC subunit. Pickpocket1. Dev. Biol. 322 (1), 46-55 (2008).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila. melanogaster.and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol. Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Cattaert, D., Birman, S. Blockade of the central generator of locomotor rhythm by noncompetitive NMDA receptor antagonists in Drosophila.larvae. J. Neurobiol. 48 (1), 58-73 (2001).
- Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila. hordotonal organ mutants. PNAS. 100 (26), 16053-16058 (2003).
- Nichols, C. D., Bechnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. (61), (2012).
- Godoy-Herrera, R. The development and genetics of digging behavior in Drosophila. arvae. Heredity. 56, 33-41 (1986).
- Sinadinos, C., Cowan, C. M., Wyttenbach, A., Mudher, A. Increased throughput assays of locomotor dysfunction in Drosophila. larvae. Journal of Neuroscience Methods. 203 (2), 325-334 (2012).
- Homyk, T., Sheppard, D. E. Behavioral mutants of Drosophila melanogaster. I. Isolation and mapping of mutations which decrease flight ability. Genetics. 87 (1), 95-104 (1977).
- Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila. larvae. J. Vis. Exp. (63), e3837 (2012).
- Model Organisms I: yeast, Drosophila and C. elegans. Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education-database/3/essentials-of-biology-1-yeast-drosophila-and-c-elegans (2015).
- Woods, J. K., Kowalski, S., Rogina, B. Determination of the spontaneous locomotor activity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (86), e51449 (2014).
- Troncoso, B., Godoy-Herrera, R., Waldo, M. The development of larval movement patterns in Drosophila). Heredity. 58 (1), 321-329 (1987).
- Helfrich, C., Engelmann, W. Circadian rhythm of the locomotor activity in Drosophila. melanogaster.and its mutants ‘sine oculis’ and ‘small optic lobes. Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).
- Johnson, A. W., Carder, W. J. Drosophila, ociceptors mediate larval aversion to dry surface environments utilizing both the painless TRP channel and the DEG/ENaC subunit, PPK1. PLoS ONE. 7 (3), (2012).
