Protocol
1. Подготовка личинок
- Для анализа желаемого личинку для передвижения или позиции предпочтения, растут личинки в стандартных условиях в нужное возраста для анализа 10 с использованием стандартного пищу летать 11.
- Сделайте сетчатый фильтр по растяжения шелкография класса нейлоновая сетка на воронке. Закрепите сетку на шее воронки с резинкой. Поместите воронку в стакан.
- Для сбора личинок для анализа, совок шпатель-полно еды, содержащей личинки нагула из бутылки культуры и промыть РТ водопроводной воды на сетчатый фильтр, собирая отдельные личинки непосредственно из сетки с кистью 10.
2. Подготовка пробирок
- Для подготовки подключить Пробирки, тщательно кипятить 4% гель агара и вылить в чашку Петри на глубину 1,5 см. Это обеспечит пробку для каждой стороны трубки, когда животное прилагается. 4% раствор достаточно плотный, чтобы предотвратить личинок из рenetrating пробки.
- Убедитесь, что трубы чисты и до введения личинки. Если это не так, как это может блокировать движения от записывается.
- Для обеспечения личинки имеют достаточную влажность для движения, подготовить бутылку сжатия, содержащий небольшое количество горячей воды. Обратить бутылку, тщательно ориентировать выход к раковине и сжать осторожно, чтобы изгнать воду из трубки пикап.
- Вставьте розетку бутылку в пробирке. Выжимать бутылку, чтобы доставить водный пар в пробирке, пока на стенке трубки тонкий слой конденсата не появится. Видео 1 показывает личинку движется в трубе с соответствующим количеством влаги.
- Для герметизации личинку в пробирку, удалить толстую 1,5 см гель агара из чашки Петри и помещают над поверхностью сетки, чтобы воздушный поток под агара так, что агар штекер может быть вставлен в трубку. Нажмите один конец пробирке в гель дважды вставить оба штекера геля в одном конце.
- С paintbспешить, положите одну личинку в пробирку примерно 1,5 дюйма глубиной и запечатать трубу, нажав край, ближайший личинки в геле агара. Результирующее давление будет вытеснять второй разъем геле агара с противоположного конца и запечатать животное внутри трубки.
- Место трубки в MB5 многолучевой дрозофилы Activity Monitor (РСВ) устройства, и отрегулируйте положение трубки ", так что животные не могут выйти за рамки диапазона датчиков.
- Чтобы убедиться, что пробирки не выскользнуть из ИК рамки считывания устройства во время транспортировки, держать трубку в месте крепления кольца шпаклевки вокруг каждой трубы, где он контактирует устройства записи.
3. Измерение активности
- Запись активности в инкубаторе, чтобы предотвратить неточные показания, которые могут возникнуть в связи с тенями, люминесцентных ламп или к изменениям температуры в лаборатории. На рисунке 5 рекомендованной организации системы.
- Установить инкубатор на 20 ° С (рисунок 1). Чтобы избежать ложных записей из-за помех от источников света ламп во время записи, выключите люминесцентные лампы инкубатора и использовать отдельный источник света СИД во время записи в инкубаторе. Выполните испытание без каких-либо животных, чтобы обеспечить, что условия освещения не аберрантно вызвать датчиков. Там не должно быть никаких записанные данные движения после этого испытания.
- Разрешить личинки, чтобы акклиматизироваться к 20 ° С Настройки инкубатора в течение 5 мин до начала анализа.
- Чтобы установить плотины системы к желаемым интервалом записи (например, 1 мин), убедитесь, РСВ программное обеспечение для записи система загружается на главный компьютер 12 и откройте файл РСВ системы до подключения камеры записи с интерфейсом PSIU.
- Чтобы установить нужную частоту записи, при которой данные будут сохранены, выберите предпочтения, а затем нажмите выше или ниже опции чтения интервала, чтобы выбрать различные временные рамки, в которых данныебудут сохранены. Например, выберите интервал чтения раза с 1 сек до 1 часа.
- Чтобы выбрать различную параметр для записи данных, выберите предпочтения, а затем выберите соответствующие флажки в разделе типа выходных данных (на счету, движется, позиции и останавливаться, см таблицу 1). Каждый параметр представляет собой уникальный анализ активности личинок внутри трубки.
- Для начала записи, подключите монитор к источнику питания Interface Unit (PSIU) с использованием CAB6 телефонный кабель. Подключите PSIU к розетке. Зеленый свет укажет соответствующее соединение.
- Подключите PSIU через Universal Serial Bus (USB) на Macintosh или Windows PC для записи данных. Откройте программу РСВ SystemMB1v6x на компьютере автоматически начать запись данных.
- После желаемое время коллекция будет завершена, выберите Выйти, а затем бросить в настоящее время на экране РСВ деятельности; Затем данные будут автоматически сохранены в DAM системы данных. Возьмите этот файл данных (например, мониторинг 1) и перетащите в отдельную папку. Это будет хранить необработанные данные из программного обеспечения DAM так, чтобы они в дальнейшем могут быть обработаны.
4. Подготовка данных для обработки (РСВ FileScan)
- Для обработки сырых данных в понятном формате открыть приложение РСВ FileScan и выберите Выбрать папку ввода данных. Затем выберите папку данных и требуемый файл и выберите опцию сканирования. Наконец выбрать длину бен в желаемый период чтения. Это организовать исходные данные в параметры, установленные оператором и программа будет сообщать данные, собранные в этом конкретном диапазоне.
- Выберите тип выходных данных для анализа установку нужного движения (на счету монитор, движется, останавливаться). В меню дополнительных показаний, выберите сумму в бункер (это если длина бен больше, чем выбранный интервал считывания системы).
- Имя файла надлежащим образом и сохранить. Файл будет храниться в одном месте, что и папка с шагом 3,9.
- Для того, чтобы собрать средние движения, процесс необработанные данные, полученные с шага 4. Чтобы создать таблицу в программе электронных таблиц, откройте файл, который ранее был сохранен (этап 4.3), и когда появляется текстовое окно мастера импорта, выберите Готово, чтобы открыть файлы данных в формате электронной таблицы.
Примечание: В зависимости от типа данных анализируемого, таблица будет прочитано по-разному. Обычно для измерения монитора движется или рассчитывает, период времени исследования будут записаны в цифровой форме, в то время как каждый человек чтение трубка получит назначенный письмо. При просмотре данных в таблице, столбцы KZ представляют слоты для пробирок 1-16 соответственно. Строки представляют точки данных, собранных. - Например, если шаги были собраны в течение 20 мин в 1-минутными интервалами, в среднем на 20 строк, чтобы вычислить среднее количество ходов / мин, и других измерений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1 показаны результаты исследования температурного отклика управления личинок третьей возрастной стадии, ш 1118, используя устройство контроля для определения различий в личиночной передвижения на семи различных температурах. Личинки промывают и помещают в плотине активности устройства, как описано выше, и помещают в инкубатор до нужной температуры. Затем устройство давали привыкнуть к среде в течение 5 мин до начала записи. Каждый личинка, в отдельности анализировали для передвижения в течение периода 20 мин и среднее количество ходов в минуту рассчитывали для каждого животного и усредняли для каждого набора из 32 животных. Данные были проанализированы и графически с использованием электронных таблиц. Личинки показали значительно большую активность, температура соответственно возрос с 5-35 ° C с шагом в 5 градусов, для отдыха в этой тенденции при 20 ° C и 25 ° C, за исключением.
Чтобы убедиться, что различия КоуLD быть обнаружены между контролем и мутанта, как описано ранее, гипоактивного неактивного личинок (IAV 1) тестировали. Данные были проанализированы, как движется / мин для каждой из 32 животных, а затем рассчитывали средний. Как показано на рисунке 2, анализ показывает, что неактивным личинки были значительно меньше, чем мобильного контроля. В то время как они намного меньше, чем третьей возрастной стадии личинок, активность первого и второго личинок возрастной стадии также измерить, как показано на рисунке 3. Деятельности третьей возрастной стадии личинок в каждой минуте 20 мин анализа было показано, что остается относительно постоянной в течение всего периода ( Рисунок 4).
Рисунок 1. ж 1118 личиночной передвижения был записан при температурах от 5 ° С. - 35 ° C Для комфортач колонна представляет собой среднюю движение 32 третьего возраста животных с индивидуальными ходов в минуту усредненного среди множества. * Все средние значительно отличаются друг от друга, за исключением 10 ° С и 15 ° С (р = 0,116) (разные буквы указывают на значительное различие, Стьюдента).
Рисунок 2. третьей стадии личинки управления по сравнению с неактивной (ИФО) 1 личинок при 20 ° С. IAV 1 личинки выставке значительно меньше мобильность по сравнению с контролем.
Рисунок 3. Измерение активности первого, второго и третьего возраста личинок в течение 20-минутного интервала записи при 20 ° С. N = 32 для каждой личиночной стадии.
Рисунок 4. Гистограмма отображения среднее количество ходов, происходящих в каждой минуте 20-минутного интервала записи. 32 личинок третьей возрастной стадии анализировали при 20 ° С. Красная линия представляет количество ходов в минуту в среднем за весь интервал 20 мин.
Рисунок 5. Схема, иллюстрирующая дрозофилы Activity Monitor настройку и его подключение к блоку интерфейса PSIU и настольным компьютером. Внутри инкубатора изображен, но во время записи инкубатора должны быть закрыты.
| Описание | Параметр |
| Каждый раз записываются данныеЛичинка пересекает луч, и дополнительные счету отражаются, если личинки перемещается в то время как в пределах одного луча. | Графы |
| Запись данных только тогда, когда мухи перемещает между отдельными пучками, он не записывает движение в пределах луча. | Переход |
| Запись позицию животные на каждой второй по интервалу записи. Эти данные показывают, предпочтение положение как функцию времени, проведенного в каждом датчике в течение анализе. | Жить |
| Эта установка анализирует общее положение животного внутри трубки, указывающий каким датчиком животное запуска во время движения. | Позиция |
| Этот параметр определяет частоту, с которой данные, собранные в течение установленного времени сохраняется на настольном компьютере. | Интервал записи |
Таблица 1. Описание measurement параметры (графы, движется, останься и позиции).
Видео 1. Система РСВ пробирку перед введением в работающего устройства. Влаги обеспечивается путем конденсации из дыхания. Этот уровень является достаточным для поддержания личиночной передвижения на протяжении всего периода исследования, не вызывая животное плавать или плавать. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы смотреть это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Активность личинок дрозофилы зависит от множества факторов, в том числе генотипа 8, 13 лет и температуры окружающей среды 2. Хотя мощные Видеографический методы, позволяющие весьма подробный анализ были разработаны теми, кто изучает передвижения 5, этот уровень детализации может быть излишним для тех, кто желает, чтобы определить основные параметры деятельности. Метод, описанный здесь использует устройство, которое доступно во многих лабораториях, легко работать, порождает высокую воспроизводимость результатов, и является управляемым даже для тех, чей основной фокус исследования не передвижение. Примерные результаты показывают, что этот анализ может быть использован для обнаружения существенных изменений в подвижности у личинок подвергнуты различным температурам (рисунок 1) и различных генотипов (фиг.2).
При личинки были измерены при температуре от 5 ° С - 35 ° С, ихдеятельность возрастает с повышением температуры, на перерыв в тенденции между 20 ° C и 25 ° C (рисунок 1), за исключением. Было показано Эйнсли и коллегами, что кормления начале третьего личинки возрастной стадии предпочитают температуру в пределах +/- 2 ° C типичного 25 ° С Температура культуры. Однако, когда личинки ввести бродить в середине-третьей стадии фазы они предпочитают несколько более низкие температуры 2. Этот вывод согласуется с наблюдением, что двигательная активность в течение третьей возрастной стадии личинок больше, при 20 ° С 25 ° С, предполагая, что некоторая часть животных анализировали были в стадии блуждающего и более активны на более низких температурах, и в меньшей степени на нормальная температура культура 25 ° C.
Этот метод предлагает простоту, объективность и надежную пропускную способность, но есть ограничения. Приложения, описанные выше, представляют собой анализы, происходящие в течение относительно короткого периода времени, в частности, потому, что нынешняя установка не прovide личинки с источником питания. Обеспечение достаточного питания будет необходимо изучить изменения активности в течение длительных периодов времени или для измерения циркадного ритма в долгосрочной перспективе. 4% агар вилки может ограничить газообмен между камерой и внешней средой, которые могут привести к личинкам испытывает гипоксии. Однако это, кажется, не влияет на активность в течение 20 мин для анализа, потому что, когда были проанализированы средние движется в минуту личинок во время каждой минуты в период, личинки не появляется, чтобы показать какие-либо изменения в деятельности за период записи (рисунок 4) ,
Потому что позиция записи устройство постоянно она представляет собой улучшение в захвате больше движение по сравнению с неавтоматизированной методов, приведенных, однако некоторые движения делает избежать обнаружения. Очень маленькие движения животных могут не вызвать ответ от этого устройства, и личинки могут перемещаться в окружном моды в течение одного инфракрасногокрасный луч, не нарушая соседних балок, в результате неточно низких показаний. Однако, поскольку этот тип ошибки можно было бы ожидать, происходит во всех группах лечения, маловероятно, чтобы вызвать ошибочные результаты. Хотя третий возрастной стадии личинки являются основной акцент данного анализа, устройство способно измерять движение гораздо меньших личинок первой и второй возрастной стадии, а также (рисунок 3). Как и ожидалось, число ходов в минуту, записанных в молодых животных ниже, чем у более крупных животных третьей возрастной стадии.
Хотя полный спектр применения этого устройства до сих пор не продемонстрировали, есть множество других приспособлений, которые могли бы разнообразить использования этого аппарата для исследований, личинок. Например, устройство позволяет "задержки" измерение, которое представляет время, затрачиваемое в определенной области трубы. Это может предоставить ценную информацию при использовании в различных дрозофилы личиночной таксиssays. Размещая устройство на бок так, чтобы трубы ориентирована вертикально, а не горизонтально, можно измерить личинок geotaxis. Для измерения фототаксис, свет градиент может быть создан в трубах, тестирование ли личинки имеют предпочтение для света или его отсутствие. Для изучения хемотаксиса, химически испытание может быть размещен на одной из агаровых пластин и положение личинок может затем определить, выявить свое предпочтение или отказ от химических веществ.
Система мониторинга позволяет проводить анализ различных параметров движения, приведены в таблице 1. При выборе всех параметров во время установки предварительного анализа (см шаг 3,6), экспериментатор может выбрать, какой параметр для анализа после анализа. Однако, если установка не выбрана, что данные не будут доступны для постфактум анализа. Следует отметить, что после каждого заданного периода времени, данные в замороженном виде при текущих графов и сохраняются в компьютере. Сбор данных, то сбрасывается внулю после этого периода и начинается снова, обеспечивая последовательность временных точек интервала. Надо вручную бросить, чтобы закончить запись данных.
Дальнейшие исследования с участием метод будет сосредоточено на использовании параметра задержки и ее различных применений. Также возможно, чтобы разработать протокол, который позволил бы исследования, чтобы произойти в течение более длительного периода времени, например, циркадных исследований, обеспечивая пищу и обмена агаровых пластин для более газопроницаемых материалов 14. Уровни влажности должны быть под контролем, а также, в виде сухих условия тормозят передвижение 15. В настоящее время этот протокол обеспечивает точное, простой, экономичный способ оценить основные параметры личиночной деятельности в различных экспериментальных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Activity Monitor, Multibeam, 16 tubes, including wires | TriKinetics Inc. | MB5 | |
| Power Supply Interface for Activity Monitor | TriKinetics Inc. | PSIU24 | |
| Glass 80 x 5 mm tubes for Activity Monitor (100) | TriKinetics Inc. | PGT 5x80 | |
| DAMsystemMB1v6x Data Acquisitions Software for Macintonsh OSX (Intel) | www.trikinetics.com | free download | |
| DAMFileScan 108x software for Macintosh | www.trikinetics.com | free download | |
| USB software (PSIUdrivers.zip). | www.trikinetics.com | free download | |
| DAMSystem Notes 308 | www.trikinetics.com | free download | |
| Zeiss Stemi 2000C- Stereo Microscope | Spectra Services | SP-STEMI2000C-BS | |
| Carbon Dioxide | Maine Oxy | anaesthesia | |
| Fly Pad | Genesee | 59-114 | surface for sorting anaesthetized flies |
| Small paint brush | Winsor & Newton | #2 ROUND | or similar, used for sorting anaesthetized flies |
| Silk Screen Printing Mesh (160) | msj-gallery.com | SM160W63-3YD | pore sized used in this protocol was ~ 0.1 mm |
| Tegosept | Genesee | 20-258 | preservative |
| Ethanol (190proof) | Pharmco | 111000190 | used to dissolve Tegosept |
| 6 oz Square Bottom Bottle (PP) | Genesee | 32-130 | |
| "Flugs" for Plastic Fly bottles | Genesee | 49-100 | |
| Drosophila Vials, Wide (PS) | Genesee | 32-117 | |
| Flugs for wide plastic vials | Genesee | 49-101 | |
| Yellow Degerminated Corn Meal | Gold Medal | ||
| Drosophila agar | LabScientific | FLY 8020 | |
| Baker's Yeast - Red Star | King Arthur Flour | 1270 | |
| Granulated Sugar - Extra Fine | Domino |
References
- Tracey, W. D. Jr, Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila.gene essential for nociception. Cell. 113, 261-273 (2003).
- Ainsley, J. A., Kim, M. J., Wegman, L. J., Pettus, J. M., Johnson, W. A. Sensory mechanisms controlling the timing of larval developmental and behavioral transitions require the Drosophila.DEG/ENaC subunit. Pickpocket1. Dev. Biol. 322 (1), 46-55 (2008).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila. melanogaster.and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol. Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Cattaert, D., Birman, S. Blockade of the central generator of locomotor rhythm by noncompetitive NMDA receptor antagonists in Drosophila.larvae. J. Neurobiol. 48 (1), 58-73 (2001).
- Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila. hordotonal organ mutants. PNAS. 100 (26), 16053-16058 (2003).
- Nichols, C. D., Bechnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. (61), (2012).
- Godoy-Herrera, R. The development and genetics of digging behavior in Drosophila. arvae. Heredity. 56, 33-41 (1986).
- Sinadinos, C., Cowan, C. M., Wyttenbach, A., Mudher, A. Increased throughput assays of locomotor dysfunction in Drosophila. larvae. Journal of Neuroscience Methods. 203 (2), 325-334 (2012).
- Homyk, T., Sheppard, D. E. Behavioral mutants of Drosophila melanogaster. I. Isolation and mapping of mutations which decrease flight ability. Genetics. 87 (1), 95-104 (1977).
- Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila. larvae. J. Vis. Exp. (63), e3837 (2012).
- Model Organisms I: yeast, Drosophila and C. elegans. Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education-database/3/essentials-of-biology-1-yeast-drosophila-and-c-elegans (2015).
- Woods, J. K., Kowalski, S., Rogina, B. Determination of the spontaneous locomotor activity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (86), e51449 (2014).
- Troncoso, B., Godoy-Herrera, R., Waldo, M. The development of larval movement patterns in Drosophila). Heredity. 58 (1), 321-329 (1987).
- Helfrich, C., Engelmann, W. Circadian rhythm of the locomotor activity in Drosophila. melanogaster.and its mutants ‘sine oculis’ and ‘small optic lobes. Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).
- Johnson, A. W., Carder, W. J. Drosophila, ociceptors mediate larval aversion to dry surface environments utilizing both the painless TRP channel and the DEG/ENaC subunit, PPK1. PLoS ONE. 7 (3), (2012).
